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문제 정의
- 皿12)줄풀과 측백나무 잎은 민간에서 목욕제로 사용되어 왔는데, 줄풀은 거친 피부와 습진의 치료에 사용되어 왔고, 측백나무는 거친 피부와 옴 등의 치료에 사용되어 왔다. 본연구에서는 예비실험에서 가장 좋은 효과를 나타낸 SPZZC가 아토피성 피부염 동물모델에서 피부염 치료 효능에 대해 평가함으로써 신약 또는 기능성화장苦으로의 개발 가능성을 확인하고자 하였다.
- 9, 10) 그러나 아직까지 획기적인 의약조성물, 화장품 조성물 또는 식품조성물 등은 없는 실정이다. 이에, 본 연구팀은 민간에서 아토피성 피부질환의 예방과 치료에 사용되어온 한약제들에 대한 사전 연구와 예비실험을 실시하였다. 그 결과 가장 좋은 효과를 나타낸 조성물은 미치광이풀과 작약 지하경, 줄풀 전초, 대추 및 측백나무 껍질의 추출물을 혼합한 조성물인 SPZZC 였다.
가설 설정
- 20) 면역세포를 활성화시 킨다. 면역세포의 활성화는 IgE 생성증가와 항체 반응 증가를 유도하고 IgE 의존성 histamine 유리체의 활동성을 증가시켜 histamine분비를 촉진시킨다.
제안 방법
- 도포하였다. 1차 도포 후 7일 째부터는, 1주일에 3회씩 5주간 0.4% DNCB용액 150 m® 재 도포하여 아토피성 피부염을 유발하였다.氈⑸
- 用)Histamine 등은 호산구의 침윤을 유도하고¥ 급성 과민반응과 소양감을 유발한다. 22)이러한 과정에 나타나는 피부소양감, 피부 변형(홍반, 건조 피부, 부종과 혈종, 짓무름, 그리고 태선화) 정도와 혈 중 호산구와 IgE 함량 등을 근거로 아토피성 피부염 정도를 평가하였다.
- 3일이 지난 후 부착한 패치를 떼어내고 2주일간의 잠복기를 두었다. 2주일 후 두 번째 피부자극을 위해 대조군은 50 B의 인산완충용액을 복강 주사 하였으며 다른 군들은 50 ng 오범알부민을 50 B의 인산 완충용액에 녹여서 복강주사 하였다. 3일 후 첫 번째 패치를 부착하였던 것과 동일한 방법으로 등 피부에 두 번째 패치를 부착하였다가3일 후 패치를 떼어내었다.
- 1 mg 오범 안부민을 같은 방법으로 도포하고 부착하였다. 3일이 지난 후 부착한 패치를 떼어내고 2주일간의 잠복기를 두었다. 2주일 후 두 번째 피부자극을 위해 대조군은 50 B의 인산완충용액을 복강 주사 하였으며 다른 군들은 50 ng 오범알부민을 50 B의 인산 완충용액에 녹여서 복강주사 하였다.
- 본 실험에서 사용한 BALB/c 마우스는 오범알부민에 민감하여&13)아토피성 피부염 실험에 흔히 사용되는 종이며, NC/Ngi 마우스는 IgE의 과생성에 의해 동반된 아토피성 피부염의 형태가 임상적으로나 조직학적으로 인간의 아토피성 피부염의 병변과 매우 흡사한 양태를 나타내고 X선조사와 오범알부민에 의해 유도되는 과민반응에 매우 민감하여 일반 재래 환경에서 아토피성 피부염과 같은 피부 습진성 상처가 쉽게 유발되는 실험동물이다.氈以)생후 4주령의 BALB/c 마우스를 1주일간 안정화를 시킨 후 아토피 비유발군, 대조군연고기제), 시험물질 도포군(SPZZC 0.22%, 0.66%, 2.0%) 과 양성대조군 (Clobetasol propionic acid 도포군)으로 분류하여 실험을 실시하였다.
- 대조군의 동물에는 연고기제를, 시험군의 동물에는 조성물 SPZZC 0.22%, 0.66%, 2.0% 함유 연고 200 m暗, 양^대조군의 동물에는 프로피온산크로베타솔(®Domohom) 연고 200 me을 1 일 1회, 오전 10:00-11:00^] 사이에 도포하였다.
- 마우스의 등을 귀 하단부에서부터 꼬리 상단부 까지 전체를 제모하고 24시간 방치한 후 1%의 DNCB용액 (아세톤 : 올리브오일 =3:1) 200 讨를 제모 부위에 도포하고, 3일 후 2차 도포하였다. 1차 도포 후 7일 째부터는, 1주일에 3회씩 5주간 0.
- 마우스의 등을 귀 하단부에서부터 꼬리 상단부까지 전체를 제모한 후에 4%(w/w) 수산화알루미늄 액 0.05 m/와 오범알부민 0.05 me을 복강주사한 후 3일째 되는 날 100 区의 인산 완충용액을 등에 도포하고 증발을 막기 위하여 Tfegadum(2x2cm)을 부착하였다. 나머지 군들은 100 区의 인산완충용액과 0.
- 양진과 데선화가 관찰된다.본 실험에서는 아도피성피부염이 유발된 등 부위의 증상을 주로 관찰하여 평가하였다. BALB/c 마우스에 아도피성 피부염이 유발뇌어 시험 약물을 치지하기 직선 관능평가 점수는 125점 이었고 2주 후에노 8점 상대 呈 유시뇌었나.
- 시험물질 도포 한 시간 전과 도포 30분 후 한 시간 동안 긁는 횟수(scratching counts)를 측정하였다.玖炒
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관능 평가 시험
시험물질 도포 후 1, 3, 7, 14일이 되는 시점에 실시하였다. 본 평가 방법은 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 임상적 육안 평가법으로서 아토피성 피부염의 심각성 정도를 다음의 5 가지 항목을 각각 평가한 점수의 총 합으로 나타내었다.
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Scratching behavior 시험
시험물질 처치 후 1, 3, 7, 14일이 되는 시점에 실시하였다. 시험물질 도포 한 시간 전과 도포 30분 후 한 시간 동안 긁는 횟수(scratching counts)를 측정하였다.
- 감압 농축하여 에탄올 추출물을 얻었다. 위 추출물들을 (주) 로다멘코스메틱이 지정한 비율로 혼합한 후 연고 기제(프로필렌글리콜, 세라마이드 및 PCA-나트륨 혼합물)를 첨가하여 0.22%, 0.66% 및 2% 조성물을 제조하였다.
- 5成를 채취하였다. 전혈을 네오딘뱃렙(주)(Seoul, Korea)에 의뢰하여 혈액 중 백혈구와 호중구, 호산구의 함량을 측정 하였고, ELISA kit(Shibayagi. co., Ltd. Japan)를 사용하여 혈청 중 IgE 함량을 측정하였다.W7, 18)
- 최종 관능평가를 실시한 후 EDTA 처리된 튜브형 주사기로 심장 혈액 0.5成를 채취하였다. 전혈을 네오딘뱃렙(주)(Seoul, Korea)에 의뢰하여 혈액 중 백혈구와 호중구, 호산구의 함량을 측정 하였고, ELISA kit(Shibayagi.
대상 데이터
- Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO, USA) 에서 구입하여 사용하였으며, 도모호론(Domohom, Clobetasol propionic add 0.005% 함유 연고. 동구제약, 서울) 및 그 외 시약은 시중에서 구입할 수 있는 최상급을 사용하였다. 미치광이풀, 백작약, 줄풀, 대추 및 측백나무피는 경동시장(Seoul, Korea) 에서 구입하여 사용하였다.
- 4주령의 BALB/c 마'우스(18~20 g)와 NC/N密 마우스(18~20 g) 를 (주)한림실험동물(Whasung, Korea)과 중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 공급받아 삼육대학교 의명신경과학연구소의 동물 실에 약 7일간 적응시켜 사용하였으며, 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 온도(23±2℃), 습도(50±10%) 및 명암주기 (12시간)는 자동으로 조절되도록 하였다. 본 실험에서 사용한 BALB/c 마우스는 오범알부민에 민감하여&13)아토피성 피부염 실험에 흔히 사용되는 종이며, NC/Ngi 마우스는 IgE의 과생성에 의해 동반된 아토피성 피부염의 형태가 임상적으로나 조직학적으로 인간의 아토피성 피부염의 병변과 매우 흡사한 양태를 나타내고 X선조사와 오범알부민에 의해 유도되는 과민반응에 매우 민감하여 일반 재래 환경에서 아토피성 피부염과 같은 피부 습진성 상처가 쉽게 유발되는 실험동물이다.
- 동구제약, 서울) 및 그 외 시약은 시중에서 구입할 수 있는 최상급을 사용하였다. 미치광이풀, 백작약, 줄풀, 대추 및 측백나무피는 경동시장(Seoul, Korea) 에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 ANOVA(one way analysis of variance) 를 이용하여 통계 처리흐}였고, Post-hoc test로 Newman-Keuls Test 를 사용하여 2<0.05 수준 이하에서 유의성 검 정을 실시하였다.
이론/모형
- 본 평가 방법은 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 임상적 육안 평가법으로서 아토피성 피부염의 심각성 정도를 다음의 5 가지 항목을 각각 평가한 점수의 총 합으로 나타내었다. 평가항목은 홍반(erythema), 가려움과 건조피부(pruritus & dry skin), 부종과 혈종(edema & excoriation), 짓무름(erosion), 그리고 태선화(lichenification)이다.
성능/효과
- 1血 PE한, 아도피성 피부염 환자의 80%에서 IgE의 혈청치 증가가 보고됨으로써 이 질환이 면역학적 이상과 관련이 있다는 증거를 제시하고 있다.4) IgE의 증감은 병변의 범위와 증상의 중증도와 관련이 있음을 시사하고 있고, 면역학적인 기전이 관여한다는 것은 알려져 있지만 정확한 병인에 관해서는 아직까지 이해가 부족한 실정이다. 아토피성 피부염은 전체인구의 약 10~20%에게서 발병하고 있는 것으로 추산되고 있으나 완치시킬 수 있는 뚜렷한 치료법이 없는 실정이다.
- 백혈구, 호중구, 호산구와 혈장 IgE의 함량변화는 염증반응의 정도를 예표하며, 특별흐], IgE는 알러지반응의 정도를 나타내는 지표가 뇐다. BALB/c 마우스에 아도피성 피부염이 유발된 후 2주 후에도 백혈구는 약 50%, 호중구은 두배, 호산구와 IgE는 약 3배 증가된 상대가 유시뇌었나. Fig.
- 이상 지속되었다. Fig. 1에서 보는 바와 같이 아토피성 피부염이 유발된 BALB/c 마우스에게 SPZZC를 처치한 결과 3일째 고용량(2.0%) 처치군에서 긁는 횟수가 유의성 있게 줄기 시작하여 7일 째와 14일 째(2.0% 처치군 긁는 횟수=평균 30회)는 용량 의존적으로 유의성 있게 감소하였고, 그 효능은 clobetasol 처치군 평균 기회) 보다 우수하였다. NC/N密 마우스에서 아토피성 피부염의 유발은 1시간 동안 상처부위를 약 300회 긁게했고, 이러한 현상은 1주 이상 지속되었다.
- NC/N密 마우스에서 아토피성 피부염의 유발은 1시간 동안 상처부위를 약 300회 긁게했고, 이러한 현상은 1주 이상 지속되었다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 아토피성 피부염이 유발된 NC/Ngi 마우스에게 SPZZC를 처치한 결과 3일째 066%와 2.0% 처치군 및 clobetasol 처치군에서 긁는 횟수가 유의성 있게 줄기 시작하여 7일 째는 전용량군에서 (2.0% 처치군 긁는 횟수=평균 120회) 유의성 있게 감소하였고, 그 효능은 clobetasol 처치군(평균 167회) 보다 우수하였다. SPZZCS] 처치에 따른 경시 증상 완화 효과 여부를 알아보기 위해 처치 전 1시간과 처치 후 1시간 동안 긁는 횟수를 비교한 결과 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스에서 모두 유의 성있는 차이가 없었다.
- BALB/c 마우스에 아도피성 피부염이 유발뇌어 시험 약물을 치지하기 직선 관능평가 점수는 125점 이었고 2주 후에노 8점 상대 呈 유시뇌었나. Fig. 3에서 보는 바와 긷©I 아도피성 피부염이 유발된 BALB/c 마우스에게 SPZZC를 치지한 결과 7일째부터 대소 군에 비혜 평균 점수가 유의성있게 용량의존적으로 줄기 시작하여 14일 째 2.0% 치지군 은 0.3점-0로 정상 피부와 유사한 수준으로 회복되었고, :L 효능은 clobetasol 치지군평균 3점) 보나 우수하였다. NC/Nga 마우스에서 아도피성 피부염 의 유발은 관능 평가 점수가 평균 14점이 뇌게하였고 1주 후 에노 11점 상대로 유시뇌었나.
- BALB/c 마우스에 아도피성 피부염이 유발된 후 2주 후에도 백혈구는 약 50%, 호중구은 두배, 호산구와 IgE는 약 3배 증가된 상대가 유시뇌었나. Fig. 5에서 보는 바와 긷이 아도피성피부염이 유발된 BALB/c 마우스에게 SPZZC를 2주간 치지한 결과 백혈구, 호중구, 호산구와 IgE 함량 모두 용량의존적으로 감소하는 경향을 나타내었고, 백혈구, 호중구, 호산구는 2% 처치 군과 clobetasol 처치군에서 유의성있게 감소하였고, IgE 함량은 SPZZC 0.66%와 2% 처치군 및 clobetasol 처치군에서 유의성 있게 감소하였다. 그러나 그 회복 정도7F 정상 동물 수준에는 미치지 못하였고, 그 효능 역시 clobetasol 효과와 유사하였다.
- NC/ N密 마우스에 아토피성 피부염이 유발된 후 1주 후에도 백혈구는 약 30%, 호중구와 호산구는 2배, IgE는 약 3배 증가된 상태가 유지되었다. Fig. 6에서 보는 바와 같이 아토피성 피부염이 유발된 NC/N密 마우스에게 SPZZC# 1주간 처치한 결과 백혈구, 호중구, 호산구와 IgE 함량 모두 용량의존적으로 감소하는 경향을 나티내었고, WBCe 2% 처치군과 clobetasol 처치군에서, 호중구는 2% 처치군에서 유의성 있게 감소하였고, 호산구는 SPZZC 0.66%와 2% 처치군 및 clobetasol 처치군에서 유의성있게 감소하였으며, IgE 함량은 SPZZC 전용량군과 clobetasol 처치 군에서 유의성 있게 감소하였다. 그러나 그 회복 정도가 정상 동물 수준에는 미치지 못하였고, 그 효능 역시 clobetasol 효과와 유사하였다.
- 그러나 그 회복 정도7F 정상 동물 수준에는 미치지 못하였고, 그 효능 역시 clobetasol 효과와 유사하였다. NC/ N密 마우스에 아토피성 피부염이 유발된 후 1주 후에도 백혈구는 약 30%, 호중구와 호산구는 2배, IgE는 약 3배 증가된 상태가 유지되었다. Fig.
- 0% 처치군 긁는 횟수=평균 120회) 유의성 있게 감소하였고, 그 효능은 clobetasol 처치군(평균 167회) 보다 우수하였다. SPZZCS] 처치에 따른 경시 증상 완화 효과 여부를 알아보기 위해 처치 전 1시간과 처치 후 1시간 동안 긁는 횟수를 비교한 결과 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스에서 모두 유의 성있는 차이가 없었다. 그러므로 SPZZC의 처치에 의한 긁는 횟수의 감소는 국소적이며 일시적인 소양효과라기보다는 피부염의 치료작용에 따른 결과로 여겨진다.
- 이에, 본 연구팀은 민간에서 아토피성 피부질환의 예방과 치료에 사용되어온 한약제들에 대한 사전 연구와 예비실험을 실시하였다. 그 결과 가장 좋은 효과를 나타낸 조성물은 미치광이풀과 작약 지하경, 줄풀 전초, 대추 및 측백나무 껍질의 추출물을 혼합한 조성물인 SPZZC 였다. 미치광이풀의 뿌리는 스코폴리아근이라고도 하며, 부교감신경 억제성분인 scopolamine과 부종에 유효한 scopoletine 등이 함유되어 있고, 작약에는 진정, 항궤양 및 항염작용이 있는 paeoniflorin과 항알러지 작용이 있는 benzoylpaeoniflorin 등이 함유되어 있다.
- 0% 도포처치는 아토피성 피부염의 대표적인 증상인 긁는 횟수를 용량으존적으로 유의성 있게 감소시켰고, 피부의 염증정도를 알 수 있는 관능평가점수와 혈액 중 백혈구, 호중구와 호산구의 함량 역시 용량의존적으로 유의성 있게 개선함으로써 SPZZC가 아토피성 피부염의 증상개선에 효과가 있음을 증명흐}였다. 뿐만 아니라 SPZZCS] 도포는 피부염 동물에서 알러지반응 정도를 예표하는 혈 중 IgE의 함량을 감소킴으로써 알러지성 염증 역시 완화 시킬 수 있음을 시사하였다. 이러한 효능들은 clobetasole] 효과보다 우수하거나 유사하였다.
- 아토피성 피부염의 대표적인 증상인 염증 부위를 긁는 행동의 횟수를 관찰한 결과, BALB/c 마우스에서 아토피성 피부염의 유발은 1시간 동안 상처부위를 약 200회 긁게했고, 이러한 현상은 2주 이상 지속되었다. Fig.
- 오범알부민과 수산화알루미늄을 복강내 주사하고 패취를 부착하여 아토피성 피부염을 유발한 BALB/c 생쥐와 DNCB를 도포하여 아토피성 피부염을 유발한 NC/Nga 생쥐에서 생약조성물 SPZZCS] 0.22%, 0.66%, 2.0% 도포처치는 아토피성 피부염의 대표적인 증상인 긁는 횟수를 용량으존적으로 유의성 있게 감소시켰고, 피부의 염증정도를 알 수 있는 관능평가점수와 혈액 중 백혈구, 호중구와 호산구의 함량 역시 용량의존적으로 유의성 있게 개선함으로써 SPZZC가 아토피성 피부염의 증상개선에 효과가 있음을 증명흐}였다. 뿐만 아니라 SPZZCS] 도포는 피부염 동물에서 알러지반응 정도를 예표하는 혈 중 IgE의 함량을 감소킴으로써 알러지성 염증 역시 완화 시킬 수 있음을 시사하였다.
후속연구
- 이러한 효능들은 clobetasole] 효과보다 우수하거나 유사하였다. 그러므로 본 연구 결과는 생약조성물 SPZZC가 아토피성 피부염의 증상을 개선하는 약물 또는 기능성 화장품 원료로 개발될 수 있음을 나타내고 있다. 그러나 시험물질인 SPZZC의 아토피성 피부염 증상을 완화효과가 어떤 생약, 어떤 성분 또는 어떤 복합성분들- 의 복합작용에 기인하는지는 확인되지 않았다.
- 그러나 시험물질인 SPZZC의 아토피성 피부염 증상을 완화효과가 어떤 생약, 어떤 성분 또는 어떤 복합성분들- 의 복합작용에 기인하는지는 확인되지 않았다. 그러므로 향후 연구를 통하여 아토피성 피부염 치료 효과가 어떤 성분에 기인하며 어떤 작용기전을 통하여 발현되는지 밝혀야할 것이다.
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