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문제 정의
- 아울러 PBMCAT의 어떤 성분이 항 아토피 피부염 효능을 가지는 지 성분 분석 또한 필요하다. 따라서 이후의 연구에서는 PBMCAT의 주요 성분 분석과 작용기전에 대하여 밝히는데 연구의 목표를 가지고자 한다.
- 그러나 많은 연구에도 불구하고 아직까지 획기적인 아토피 치료제가 개발되지 않은 실정이다. 이에 본 연구에서는 민간에서 피부질환의 예방과 치료에 사용되어온 생약혼합 조성물인 PBMCAT[백작약(Paeonia japonica), 백급(Bletilla striata), 천련자(Melia azedarach), 백굴채(Chelidonium majus), 우방자(Arctium lappa), 섬여피(Toad skin)의 혼합추출물]의 효능을 검색하여 아토피성 피부염 동물모델에서 피부염 치료효능에 대해 평가함으로써 아토피 관련 제품으로의 개발 가능성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 또한 활성화된 면역세포로 인해 histamine 분비가 촉진되며28) 이로 인해 심한 소양증이 유발되면 염증반응이 가중되게 된다.1) 본 연구에서는 이러한 과정에서 나타나는 피부소양감, 피부변형 정도와 혈 중 IgE 함량 등을 근거로 아토피성 피부염 정도를 평가하였다. 아토피 피부염의 발생 기전은 매우 복잡하기에 그 치료제 개발 또한 쉬운 일은 아니다.
- 2주일 후 두 번째 피부자극을 위해 50 µl의 PBS 용액과 50 µl의 OVA을 복강주사하였으며 100 µl의 PBS 용액과 100 µl의 OVA을 등에 도포하고 동일한 방법으로 처리하였다.
- 2주일 후 두 번째 피부자극을 위해 50 µl의 PBS 용액과 50 µl의 OVA을 복강주사하였으며 100 µl의 PBS 용액과 100 µl의 OVA을 등에 도포하고 동일한 방법으로 처리하였다. 3일 후 첫 번째와 동일한 방법으로 복강에 주사하였으며 등 피부에 두 번째 패치를 부착하여 동일한 방법으로 처리하였다(Fig. 1). 3일 후 부착된 패치를 떼어내었다.
- 05 mg을 복강주사하고 100 µl의 인산완충용액과 100 µl의 오범 알부민을 등에 도포하고 증발을 막기 위하여 멸균 투명 필름인 Tegaderm (2 × 2 cm)을 부착한 후 3일째 되는 날 떼어내고 같은 방법으로 패치를 갈아붙여 주었다. 3일이 지난 후 부착한 패치를 떼어내고 2주일간의 잠복기를 두었다. 2주일 후 두 번째 피부자극을 위해 50 µl의 PBS 용액과 50 µl의 OVA을 복강주사하였으며 100 µl의 PBS 용액과 100 µl의 OVA을 등에 도포하고 동일한 방법으로 처리하였다.
- Clinical Skin Severity − 시험물질 도포 후 1, 3, 7, 14일이 되는 시점에 실시하였다.
- Scratching Behavior − 시험물질을 도포한 후 1, 3, 7, 14일이 되는 시점에 실시하였으며, 시험물질 도포 한 시간 전과 시험물질 도포 후 30분부터 한 시간 동안 긁기 횟수(scratching counts)를 측정하였다.
- 마우스의 아토피 유발 − 안정화 기간이 지난 후 마우스의 등 부위인 귀 하단부에서부터 꼬리 상단부까지 전체를 제모하고 24시간 방치한 후 4% (w/w) 알루미늄 하이드록사이드 용액 50 µl와 오범 알부민 0.05 mg을 복강주사하고 100 µl의 인산완충용액과 100 µl의 오범 알부민을 등에 도포하고 증발을 막기 위하여 멸균 투명 필름인 Tegaderm (2 × 2 cm)을 부착한 후 3일째 되는 날 떼어내고 같은 방법으로 패치를 갈아붙여 주었다.
- Clinical Skin Severity − 시험물질 도포 후 1, 3, 7, 14일이 되는 시점에 실시하였다. 본 평가 방법은 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 임상적 육안 평가방법으로써 아토피성 피부염의 심각성 정도를 다음의 5가지 항목을 각각 평가한 점수의 총 합으로 나타내었다. 평가항목은 홍반(erythema), 가려움과 건조피부(Pruritus & Dry Skin), 부종과 혈종(Edema & excoriation), 짓무름(Erosion), 그리고 태선화(Lichenification)로 나누었고 각각의 항목을 없음 (0), 약함 (1), 보통 (2), 심함 (3)으로 채점한 후 합산함으로써 최소 0점에서 최고 15점 사이의 점수를 부여한다.
- 시험약물의 처치 − 아토피 유도 후, 각 마우스에게 관찰 평가 된 아토피 유발 점수를 부과하여 군을 분리하였다.
- 시험약물의 처치 − 아토피 유도 후, 각 마우스에게 관찰 평가 된 아토피 유발 점수를 부과하여 군을 분리하였다. 아토피 비유도군, 대조군(control base), 시험물질 도포군과 양성대조군으로 분류한 후 대조군에는 control base를, 처치군에는 PBMCAT 0.1, 0.25, 0.5, 1.0%를 함유한 연고 20 mg을 1일 1회 2주일 동안 등 부위에 도포하였으며, 양성대조군의 동물에는 엘리델 크림 20 mg을 도포하였다.
- 실험물질의 제조 − 본 실험에서 사용된 약제는 경동시장에서 구입하였으며 실험물질은 (주)로다멘코스메딕스에서 제조한 것을 공급받아 사용하였다. 제조 방법을 간단히 설명하면, 백작약을 분쇄한 것 100 g, 천련자를 분쇄한 것 100 g, 백굴채를 분쇄한 것 100 g, 우방자를 분쇄한 것 50 g, 백급을 분쇄한 것 50 g, 섬여피를 분쇄한 것 50 g 등을 에탄올 3,000 ml에 가하여 실온에서 10일간 침적하여 추출 여과한 후 그 여과액을 감압, 증발하여 240 g의 농축물을 얻은 생약복합제로 연고기제(프로필렌글리콜, 세라마이드 및 PCA나트륨 혼합물)를 첨가하여 조성물(PBMCAT)을 제조하였다.
- 평가항목은 홍반(erythema), 가려움과 건조피부(Pruritus & Dry Skin), 부종과 혈종(Edema & excoriation), 짓무름(Erosion), 그리고 태선화(Lichenification)로 나누었고 각각의 항목을 없음 (0), 약함 (1), 보통 (2), 심함 (3)으로 채점한 후 합산함으로써 최소 0점에서 최고 15점 사이의 점수를 부여한다.
대상 데이터
- 실험동물 − 실험동물로 사용한 BALB/c 마우스(4주령, 18~20 g)는 (주)한림실험동물(Whasung, Korea)에서 공급받아 삼육대학교 의명신경과학연구소의 동물실, clean cage에서 7일 동안 안정화시켜 사용하였으며, 온도(23 ± 2℃), 습도(55 ± 10%) 및 명암주기(12 시간)는 자동으로 조절되도록 하였으며 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 실험물질의 제조 − 본 실험에서 사용된 약제는 경동시장에서 구입하였으며 실험물질은 (주)로다멘코스메딕스에서 제조한 것을 공급받아 사용하였다.
- 약물 및 시약 − 오범알부민(Ovum albumin), 알루미늄 하이드록사이드(Aluminum hydroxide)는 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 엘리델 크림(연고 1 g 중 프로피온산 클로베타솔 0.5 mg, 파라옥시향산 메틸 0.5 mg과 파라옥시향산 프로필 0.25 mg 함유)는 (주) 한국 노바티스사(Seoul, Korea)에서 시판 중인 것을 구입하였고, Tegaderm film은 3M Health Care (St. Paul, MN, USA)에서, Thiopental sodium은 중외제약(주) (Anyang, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 통계처리 − 모든 실험 결과는 ANOVA (one way analysis of variance)를 이용하여 통계 처리하였고, Post-hoc test로 Newman-Keuls Test를 사용하여 p<0.05 수준 이하에서 유의성 검정을 실시하였다.
성능/효과
- 1) 각질형성세포(keratinocyte)는 각질층 구성에 필요한 필수적인 세포로 피부에서 발생하는 면역반응의 일차적인 유도체와 표적으로 작용한다. 인체와 외부 환경 사이의 투과막인 피부 각질장벽이 손상되면 경표피 수분손실이 증가되고 수분결합력이 감소되어 소양증이 심해지고 피부가 건조해지며, 가려움증으로 인하여 긁게 되면 각질형성 세포에서 여러 가지 염증유발 사이토카인(cytokine)들이 분비되어 염증을 악화 시키게 되고, 피부 기능 장벽을 손상시키게 되어 포도상 구균 등의 결합을 촉진시키게 되는 것이다.
- p>아토피 피부염은 천식, 식품 알레르기, 알레르기 비염 등과 같은 다른 알레르기 질환보다 먼저 발생하고 다양한 면역학적 이상과 이로 인한 다양한 속발 증상도 갖고 있는 만성 재발성의 습관성 질환이다.1,2) 영유아기에 흔히 발생하는 이 질환은 최근 전 세계 뿐만 아니라 우리나라의 성인에서도 증가하고 있는 추세이다.3)
- 5% 투여군에서 유의성 있게 감소하였고, 7일간 도포한 실험군에서의 관능평가는 저용량을 제외한 모든 농도의 PBMCAT의 처리가 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다. 14일간 도포한 실험군에서도 저용량을 제외한 모든 농도의 PBMCAT의 처리가 유의성 있는 감소 효과를 나타내었고 엘리델크림에 비해 더 좋은 효과를 보여주었다(Fig. 3, 4). 이상의 결과 역시 PBMCAT의 도포가 아토피성피부염의 증상을 완화시킬 수 있음을 시사한다.
- BALB/c 마우스의 Clinical Skin Severity 시험 − 아토피성 피부염의 증상들을 종합하여 관찰한 관능평가 시험 결과 PBMCAT를 3일간 도포한 경우 아토피성 피부염 점수가 대조군에 비해 PBMCAT 0.5% 투여군에서 유의성 있게 감소하였고, 7일간 도포한 실험군에서의 관능평가는 저용량을 제외한 모든 농도의 PBMCAT의 처리가 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다.
- BALB/c 마우스의 혈장 IgE 함량 − 혈 중 IgE 함량 역시 아토피성피부염의 유발에 의해 증가하였으나 PBMCAT 도포에 의해 용량 의존적으로 유의성 있게 감소되었으며 도포 14일째의 0.5%와 1.0%의 고농도 도포군에서 엘리델 크림보다 더 나은 효과를 보여주었다(Table I).
- 도포 후 3일째에 긁기의 횟수가 증가되었다가 1주일째에 조금 감소하는 경향을 나타내었다. PBMCAT의 도포에 의해 3일째부터 긁는 행동의 횟수가 유의성 있게 감소하였으며 도포 7일째에 이르러 저용량을 제외한 전 용량군에서 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다. 도포 14일째에는 PBMCAT의 고 용량군에서 긁는 행동의 횟수가 유의성 있게 감소하였으며 PBMCAT의 비교적 낮은 농도인 0.
- Scratching Behavior Test − BALB/c 마우스에서 아토피성 피부염 유발은 1시간 동안 상처부위를 약 200회 정도 긁게 했으며 도포 첫째 날은 도포 전 1시간 보다 도포 후 1시간 동안 긁기의 횟수가 증가하였다.
- 3. The surface area of clinical skin severity was measured after dermal application of PBMCAT at dose 0.1%, 0.25%, 0.5%, 1.0%, PL (pimecrolimus). Non-treated mice were used as a control.
- 도포 14일째에는 PBMCAT의 고 용량군에서 긁는 행동의 횟수가 유의성 있게 감소하였으며 PBMCAT의 비교적 낮은 농도인 0.25%에서 엘리델 크림보다 더 좋은 효과가 확인되었으며 고농도인 0.5%, 1.0%의 PBMCAT는 엘리델 크림보다도 월등한 효과를 보여주었다(Fig. 2).
- 본 연구 결과, 6가지 생약 혼합 추출물인 PBMCAT가 현재 아토피 피부염 치료제로 사용되고 있는 엘리델 크림에 비해 월등히 좋은 효과를 보여주었다. 최근 면역억제제인 엘리델 크림의 성분인 피메크로리무스(pimecrolimus)의 발암 사례 및 또 치료제 시장에서의 다른 아토피 피부염 치료제인 부펙사막 성분의 퇴출은 안전성이 확보된 새로운 아토피 피부염 치료제 개발을 요구하고 있다.
- 아토피성 피부염의 유발에 의해 혈중 IgE 수치는 증가하였으나, PBMCAT의 도포에 의해 14일째에는 유의성 있는 감소 효과를 나타내어 그 효과는 알레르기 반응에 대한 억제작용과 관련이 있음을 시사한다. 본 연구에서 사용된 PBMCAT의 각 조성물 중 백작약의 항염과 항알러지 작용 및 천련자, 백급, 백굴채와 우방자의 살균작용들과 섬여피의 태선화와 각질 회복작용 등의 작용으로 부작용 없이 안전하면서 아토피 증상을 완화시키는 효과를 가진 것으로 입증된 바, 아토피 피부염의 새로운 치료제로서의 가능성을 확인하였다. 시험물질 PBMCAT의 도포가 아토피성 피부염의 증상을 완화시키는 효능이 있지만 그 효능이 어떤 단일 성분 또는 어떤 성분들의 복합작용에 기인하는지는 확인되지 않았다.
- 본 연구에서 사용된 PBMCAT의 각 조성물 중 백작약의 항염과 항알러지 작용 및 천련자, 백급, 백굴채와 우방자의 살균작용들과 섬여피의 태선화와 각질 회복작용 등의 작용으로 부작용 없이 안전하면서 아토피 증상을 완화시키는 효과를 가진 것으로 입증된 바, 아토피 피부염의 새로운 치료제로서의 가능성을 확인하였다. 시험물질 PBMCAT의 도포가 아토피성 피부염의 증상을 완화시키는 효능이 있지만 그 효능이 어떤 단일 성분 또는 어떤 성분들의 복합작용에 기인하는지는 확인되지 않았다. 그러므로 향후 연구를 통하여 실험물질 PBMCAT의 도포로 인한 아토피성 피부염 치료 효과가 어떤 성분에 기인하며 어떤 작용기전을 통하여 발현되는지 밝혀야 할 것이다.
- 아토피성 피부염의 BALB/c 마우스 모델에서 염증 부위를 긁는 행동의 횟수가 약물처치 3일째에서 14일째까지 실험물질 PBMCAT 도포군 전 용량군에서 대조군에 비해 현저하게 감소하였으며 그 감소 효능은 엘리델 크림의 효능보다 우수하였다. 아토피성 피부염 점수는 도포 7일째와 14일째에서 실험물질 도포군의 전용량에서 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다. 아토피성 피부염의 유발에 의해 혈중 IgE 수치는 증가하였으나, PBMCAT의 도포에 의해 14일째에는 유의성 있는 감소 효과를 나타내어 그 효과는 알레르기 반응에 대한 억제작용과 관련이 있음을 시사한다.
- 아토피성 피부염의 BALB/c 마우스 모델에서 염증 부위를 긁는 행동의 횟수가 약물처치 3일째에서 14일째까지 실험물질 PBMCAT 도포군 전 용량군에서 대조군에 비해 현저하게 감소하였으며 그 감소 효능은 엘리델 크림의 효능보다 우수하였다. 아토피성 피부염 점수는 도포 7일째와 14일째에서 실험물질 도포군의 전용량에서 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다.
- 3, 4). 이상의 결과 역시 PBMCAT의 도포가 아토피성피부염의 증상을 완화시킬 수 있음을 시사한다.
- 0%의 고농도 도포군에서 엘리델 크림보다 더 나은 효과를 보여주었다(Table I). 이상의 결과를 통해 PBMCAT의 도포는 아토피성피부염의 증상을 완화시킬 수 있으며, 그 증상의 완화는 알레르기 반응에서 증가하는 IgE 억제작용과 연관이 있음을 확인하였다.
후속연구
- 시험물질 PBMCAT의 도포가 아토피성 피부염의 증상을 완화시키는 효능이 있지만 그 효능이 어떤 단일 성분 또는 어떤 성분들의 복합작용에 기인하는지는 확인되지 않았다. 그러므로 향후 연구를 통하여 실험물질 PBMCAT의 도포로 인한 아토피성 피부염 치료 효과가 어떤 성분에 기인하며 어떤 작용기전을 통하여 발현되는지 밝혀야 할 것이다.
- 아토피 피부염의 발생 기전은 매우 복잡하기에 그 치료제 개발 또한 쉬운 일은 아니다. 본 연구에서 나타난 항 아토피 피부염 효능에 관한 기전검색이 요구되는데 특히, 사용된 생약혼합물이 면역세포의 Th1, Th2 사이토카인 발현에 어떠한 영향을 미치는 지 규명할 필요가 있다. 아울러 PBMCAT의 어떤 성분이 항 아토피 피부염 효능을 가지는 지 성분 분석 또한 필요하다.
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