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문제 정의
- 그러나 현재까지 프랑킨센스 오일의 효능을 실험적으로 입증한 연구보고는 확인되지 않고 있다. 이에 본 연구는 hairless 마우스에 반복적으로 UVB 조사와 squalene monohydroperoxide (Sq-OOH)를 도포하여 피부노화를 유발시키고, 이와 병행하여 프랑킨센스 오일을 도포하여 피부의 조직학적 관찰을 통하여 피부노화 억제효과를 확인하고 아울러 피부조직 내 유해산소 대사효소들의 활성을 알아보았다.
제안 방법
- Retinoic acid는 polyethylene glycol에 0.01%로 희석하여 1일 2회, 주 6일, 4주 동안 매회 100 μL씩 도포하였다.
- 실험기기 중 자외선 조사장치는 UVB sunlamp(UVM-225D, Mineralight Lamp UVP, USA)를, 자외선 측정장치는 UV-radiometer (HD 9021, Delta OHM, Italy)를 사용하였고 조직표본관찰은 Inverted microscope (Axiovert 200, Carl Zeiss, Germany)와 Fluorescence microscope (Axio imager, Carl Zeiss, Germany)를 사용하였고 혈구 분석은 자동혈구분석기(Hemavet 850+, CDC Technologies Inc., USA)를 사용하였다.
- 자외선 조사장치의 광원은 302 nm의 UVB를 방출하는 sunlamp를 사용하였다. 자외선 조사량은 UV-radiometer로 측정하였으며, 마우스를 자외선조사용 cage에 가둔 후 등 부위에 균등하게 120 mJ/cm2의 광량으로 격일 간격으로 1주일에 3회, 4주 동안 조사하였다. 피부거침과 주름형성을 촉진하기 위하여 Sq-OOH를 1일 2회, 주 6일, 4주 동안 매회 100 μL씩 도포하였다.
- 절취한 피부조직을 실온에서 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 후 10% formal-calcium에 1주일 동안 산화 처리한 다음 30% sucrose 용액에 cryo-protection한 후 냉동 절편기로 10 μm 두께의 냉동절편을 제작하여 Oil Red O 염색 후 표피 각 질층 내 지방과 lipid lamella 분포양상을 광학현미경과 형광현미경으로 관찰하였다.
- 절취한 피부조직을 실온에서 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을 거친 다음 paraffin으로 포매하고 4 μm 두께로 절편을 만들어 Toluidine Blue 염색 후 진피 및 피하층 내 mast cell의 분포양상 및 탈과립 정도를 광학현미경과 형광현미경으로 관찰하였다.
- 절취한 피부조직을 실온에서 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을 거친 다음 paraffin으로 포매하고 4 μm 두께로 절편을 만들어 실온에서 bouin 용액에 하룻밤 담구고 Masson’s Trichrome 염색 후 진피 내 collagen fiber의 양과 형태를 광학현미경과 형광현미경으로 관찰하였다.
- 절취한 피부조직을 실온에서 10% 중성 포르말린용액에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을 거친 다음 paraffin에 포매하고 4 μm 두께로 절편을 만들어 hematoxylin and eosin (H & E)으로 염색 후 광학현미경과 형광현미경으로 피부조직의 변화양상을 관찰하였다.
- 채취한 혈액을 혈액응고 방지제인 K2-EDTA가 포함된 채혈 tube에 담아 coulter mixer기 위에서 5분 이상 혼합한 뒤 동물 전용 혈액학적 분석기를 이용하여 백혈구수, 호중구수, 호산구수, 호염구수, 림프구수, 단핵구수를 측정하였다.
- 피부거침과 주름형성을 촉진하기 위하여 Sq-OOH를 1일 2회, 주 6일, 4주 동안 매회 100 μL씩 도포하였다.
- 호호바 오일에 3%로 희석한 프랑킨센스 오일과 용매(호호바 오일), 생리식염수는 1일 2회, 주 6일, 4주 동안 매회 100 μL씩 도포하였다.
대상 데이터
- Hydrogen peroxide는 Junsei 사(Japan)의 제품을, hematoxylin, retinoic acid, polyethylene glycol은 Sigma 사(USA)의 제품을 사용하였으며 그 외 일반시약들은 특급품을 사용하였다. 프랑킨센스 오일(frankincense oil)은 유기농 인증기관으로부터 인정받은(ECOCERT-F-22043) 100% 순도 천연 정유인 Sanoflore 사(France) 제품을, 호호바 오일(jojoba oil)은 Desert Whale 사(USA) 제품을 사용하였다.
- 사육실은 온도 22±1oC, 상대습도 50±5%, 조명주기 12시간씩 밤낮을 유지하였다. 실험군은 5군으로 나누었으며 각 군당 5마리씩 총 25마리를 실험에 사용하였다. 실험동물은 실험 4주째 되는 날 4시간 전부터 절식시킨 다음 에테르로 마취한 후 개복하여 피부를 적출한 후 일부는 10% 중성 포르말린 용액에 고정하여 조직학적 검사에 사용하였고 나머지는 냉동시켜 효소측정에 사용하였다.
- 실험동물은 6~7주령의 SHR-1 hairless mouse(Charles-River, Japan)를 분양받아 1주일간 사육실에서 적응시킨 후 실험 전 기간 동안 사료와 물은 자유로이 공급하였다. 사육실은 온도 22±1oC, 상대습도 50±5%, 조명주기 12시간씩 밤낮을 유지하였다.
- 실험군은 5군으로 나누었으며 각 군당 5마리씩 총 25마리를 실험에 사용하였다. 실험동물은 실험 4주째 되는 날 4시간 전부터 절식시킨 다음 에테르로 마취한 후 개복하여 피부를 적출한 후 일부는 10% 중성 포르말린 용액에 고정하여 조직학적 검사에 사용하였고 나머지는 냉동시켜 효소측정에 사용하였다.
- 자외선 조사장치의 광원은 302 nm의 UVB를 방출하는 sunlamp를 사용하였다. 자외선 조사량은 UV-radiometer로 측정하였으며, 마우스를 자외선조사용 cage에 가둔 후 등 부위에 균등하게 120 mJ/cm2의 광량으로 격일 간격으로 1주일에 3회, 4주 동안 조사하였다.
- Hydrogen peroxide는 Junsei 사(Japan)의 제품을, hematoxylin, retinoic acid, polyethylene glycol은 Sigma 사(USA)의 제품을 사용하였으며 그 외 일반시약들은 특급품을 사용하였다. 프랑킨센스 오일(frankincense oil)은 유기농 인증기관으로부터 인정받은(ECOCERT-F-22043) 100% 순도 천연 정유인 Sanoflore 사(France) 제품을, 호호바 오일(jojoba oil)은 Desert Whale 사(USA) 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 통계적 분석은 SPSS WIN (v12.0)를 이용하여 정상군, 대조군, 용매대조군, 양성대조군, 프랑킨센스오일 도포군 간의 차이를 비교하기 위하여 Student’s t-test로 분석하였고, 통계적 유의수준은 0.05로 하였다.
이론/모형
- 피부조직 중 단백질 함량은 Lowry et al.(1951)의 방법에 따라 bovine serum albumin을 표준품으로 사용하여 측정하였다.
- (1987)의 방법에 따라 0.1 mM EDTA가 함유된 50 mM 인산 완충액(pH 7.5)에 10 μM hematoxylin 및 효소액을 가해 25oC에서 반응시켜 생성된 hematein을 560 nm에서 측정하여 효소의 활성도를 산정하였다.
- 피부조직 중 CAT 활성도는 hydrogen peroxide를 기질로 하여 환원되는 정도를 파장 240 nm에서 그 흡광도를 읽고 분자흡광계수(E=0.04 mM-1cm-1)를 이용하여 활성을 산출하는 Aebi (1974)의 방법에 준하였다. 활성도 단위는 피부조직 중에 함유된 단백질 1 mg이 1분 동안 반응하여 감소되는 hydrogen peroxide 양을 nmole로 표시하였다.
- 피부조직 중 XO의 활성도는 xanthine을 기질로 사용하여 30oC에서 20분간 반응시켜 생성된 요산을 292 nm에서 흡광도를 측정하는 Stripe, Della(1969)의 방법에 준하여 측정하였다. 활성도 단위는 효소액 중에 함유된 단백질 1 mg이 1분간 반응하여 기질인 xanthine으로부터 생성된 uric acid의 양을 nmole로 표시하였다.
성능/효과
- 대조군, 용매대조군, 양성대조군은 정상군에 비해 각각 42.9%, 33.8%, 10.2% 낮은 반면, 프랑킨센스오일 도포군은 정상군에 비해 49.2% 높은 수치를 보였으며 유의한 차이가 없었고 대조군과 양성대조군에 비해서는 각각 161.1%, 66.2% 높았다.
- 대조군에 비해 양성대조군과 프랑킨센스 오일 도포군은 백혈구 수치가 전반적으로 낮았으며, 백혈구 중에서 양성대조군은 호중구(p⁄0.01)와 호산구(p⁄0.05)가 유의하게 낮았고, 프랑킨센스 오일 도포군은 호산구(p⁄0.01)와 호염구(p⁄0.001)는 유의하게 낮았다.
- 본 연구에서 UVB 조사와 Sq-OOH를 도포한 대조군은 표피의 비후와 함께 각질층 내 lipid lamella가 많이 부서져 형태가 불규칙적이고 지방량이 적게 나타나 피부장벽에 심한 손상이 있음을 확인하였다. 또한 진피층의 비후와 피지선의 증식, 진피층 내 림프구, 대식구 및 호중구와 같은 염증관련 세포들의 침윤과 함께 mast cell 수의 증가와 탈과립의 증가가 관찰되었고 진피층 내 collagen fiber가 파괴되어 밀도가 엉성하고 배열이 불규칙적이고 양도 많이 줄어있음을 확인하였다. 아울러 XO 활성의 유의한 증가와 함께 SOD와 CAT 활성의 상당한 감소를 확인함으로써 산화스트레스가 심함을 알 수 있었다.
- 이와 같이 대조군의 경우 정상군에 비해 XO 활성의 유의한 증가와 함께 SOD와 CAT 활성의 감 소는 UVB 조사와 Sq-OOH 도포로 인해 유해산소의 생성을 높게 하고 이들 생성된 유해산소를 제거하기 위해 해독계 효소가 많이 사용됨으로써 항산화 방어기구의 불균형을 가져와 산화스트레스가 심함을 의미한다. 반면, 프랑킨센스 오일 도포군은 대조군에 비해 XO 활성은 유의하게 낮았고 SOD와 CAT 활성은 높게 나타나 우수한 항산화 효과 가 있음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 조직학적 관찰에서 프랑킨센스 오일 도포군이 대조군에 비해 피부 손상을 적게 초래한 일련의 결과와 부합하는 결과이다.
- 본 연구에서 UVB 조사와 Sq-OOH를 도포한 대조군은 표피의 비후와 함께 각질층 내 lipid lamella가 많이 부서져 형태가 불규칙적이고 지방량이 적게 나타나 피부장벽에 심한 손상이 있음을 확인하였다. 또한 진피층의 비후와 피지선의 증식, 진피층 내 림프구, 대식구 및 호중구와 같은 염증관련 세포들의 침윤과 함께 mast cell 수의 증가와 탈과립의 증가가 관찰되었고 진피층 내 collagen fiber가 파괴되어 밀도가 엉성하고 배열이 불규칙적이고 양도 많이 줄어있음을 확인하였다.
- 또한 진피층의 비후와 피지선의 증식, 진피층 내 림프구, 대식구 및 호중구와 같은 염증관련 세포들의 침윤과 함께 mast cell 수의 증가와 탈과립의 증가가 관찰되었고 진피층 내 collagen fiber가 파괴되어 밀도가 엉성하고 배열이 불규칙적이고 양도 많이 줄어있음을 확인하였다. 아울러 XO 활성의 유의한 증가와 함께 SOD와 CAT 활성의 상당한 감소를 확인함으로써 산화스트레스가 심함을 알 수 있었다.
- 진피층에서는 염증관련 세포들의 침윤, mast cell 수와 탈과립 정도가 대조군에 비해 상대적으로 적음을 관찰하였고 진피층 내 collagen fiber의 밀도가 비교적 조밀하고 배열이 규칙적임을 확인하였다. 아울러 대조군에 비해 XO 활성은 유의하게 낮았고 SOD와 CAT 활성은 높게 나타났으며 정상군 수준의 항산화 방어기구의 균형을 가지고 있음을 확인하였다.
- 정상군은 collagen fiber의 밀도가 조밀하고 배열이 규칙적인 반면, 대조군은 collagen fiber가 파괴되어 밀도가 엉성하고 배열이 불규칙적이고 양도 많이 줄어있었다. 양성대조군과 프랑킨센스 오일 도포군은 대조군에 비해 collagen fiber의 밀도가 조밀하고 배열이 규칙적으로 나타났다.
- 정상군은 lipid lamella가 규칙적이며 지방량이 많은 반면, 대조군은 lipid lamella가 많이 부서져 형태가 불규칙적이고 지방량이 적었다. 양성대조군과 프랑킨센스 오일 도포군은 대조군에 비해 lipid lamella가 비교적 규칙적이고 지방량도 많음을 확인하였다.
- 정상군은 mast cell이 적게 관찰되었고 탈과립이 거의 없는 반면, 대조군은 mast cell이 현저히 많이 관찰되었고 탈과립 정도가 심하게 나타났다. 양성대조군과 프랑킨센스 오일 도포군은 대조군에 비해 mast cell 수가 적게 관찰되었고 탈과립 정도도 경미하게 나타났다.
- 이상의 피부의 조직학적 관찰과 피부조직의 유해산소 대사효소의 활성을 분석한 실험결과를 종합해 볼 때, 프랑킨센스 오일은 유해산소의 발생은 감소시키고 유해산소 해독계 효소의 활성을 증가시키는 우수한 항산화 능을 지님으로 인해 UVB조사와 Sq-OOH 도포로 인한 피부조직의 손상을 적게 시킴으로써 피부노화를 억제시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- 정상군은 표피와 진피층 배열이 규칙적이며 염증관련 세포들이 거의 보이지 않은 반면, 대조군은 진피 내 림프구, 대식구 및 호중구가 상당수 관찰되었고, 표피층과 진피층의 비후와 피지선의 증식이 관찰되었다. 이에 비해 양성대조군과 프랑킨센스 오일 도포군은 림프구, 대식구 및 호중구와 같은 염증관련 세포들이 대조군에 비해 많이 줄어들어 있음을 확인하였다.
- 이에 비해 프랑킨센스 오일 도포군은 대조군에 비해 피부 각질층 내 lipid lamella가 비교적 규칙적이고 지방량도 많음을 관찰함으로써 피부장벽 손상이 상대적으로 적음을 확인하였다. 진피층에서는 염증관련 세포들의 침윤, mast cell 수와 탈과립 정도가 대조군에 비해 상대적으로 적음을 관찰하였고 진피층 내 collagen fiber의 밀도가 비교적 조밀하고 배열이 규칙적임을 확인하였다.
- 001)는 유의하게 낮았다. 이와 같은 결과는 피부의 조직학적 소견과일치하는 결과로써 retinoic acid와 프랑킨센스 오일이 자외선으로 발생한 피부조직의 염증을 경감시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- 정상군에 비해 대조군에서 염증성 관련 세포인 백혈구(p⁄0.05), 호중구(p⁄0.001), 호산구(p⁄0.05), 호염구(p⁄0.05)가 유의하게 높았고 용매대조군에서 호중구(p⁄0.05)가 유의하게 높았다.
- 정상군에 비해 대조군은 56.0% (p⁄0.01), 양성대조군은 28.5% (p⁄0.05)로 유의하게 높았으나, 프랑킨센스 오일 도포군은 정상군과 유의한 차이가 없었고 대조군과 양성대조군에 비해서는 각각 33.2%(p⁄0.01), 19.0% 낮았다.
- 4와 같다. 정상군은 mast cell이 적게 관찰되었고 탈과립이 거의 없는 반면, 대조군은 mast cell이 현저히 많이 관찰되었고 탈과립 정도가 심하게 나타났다. 양성대조군과 프랑킨센스 오일 도포군은 대조군에 비해 mast cell 수가 적게 관찰되었고 탈과립 정도도 경미하게 나타났다.
- 1과 같다. 정상군은 표피와 진피층 배열이 규칙적이며 염증관련 세포들이 거의 보이지 않은 반면, 대조군은 진피 내 림프구, 대식구 및 호중구가 상당수 관찰되었고, 표피층과 진피층의 비후와 피지선의 증식이 관찰되었다. 이에 비해 양성대조군과 프랑킨센스 오일 도포군은 림프구, 대식구 및 호중구와 같은 염증관련 세포들이 대조군에 비해 많이 줄어들어 있음을 확인하였다.
- 이에 비해 프랑킨센스 오일 도포군은 대조군에 비해 피부 각질층 내 lipid lamella가 비교적 규칙적이고 지방량도 많음을 관찰함으로써 피부장벽 손상이 상대적으로 적음을 확인하였다. 진피층에서는 염증관련 세포들의 침윤, mast cell 수와 탈과립 정도가 대조군에 비해 상대적으로 적음을 관찰하였고 진피층 내 collagen fiber의 밀도가 비교적 조밀하고 배열이 규칙적임을 확인하였다. 아울러 대조군에 비해 XO 활성은 유의하게 낮았고 SOD와 CAT 활성은 높게 나타났으며 정상군 수준의 항산화 방어기구의 균형을 가지고 있음을 확인하였다.
- 8% 낮았다. 프랑킨센스 오일 도포군은 정상군에 비해 13.8% 낮았으며 대조군과 양성대조군에 비해서는 각각 28.4%, 13.1% 높았다.
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