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문제 정의
- 이에 본 연구는 RAW 264.7세포에서 전 염증성사이토카인인 TNF-α과 IL-1β 생성량을 조사하여 frankincence의 항염성을 검토하고자 한다.
제안 방법
- 24시간 CO2 배양기에서 배양한 후 배양액에 함유된 전연증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β의 생성을 ELISA kit을 이용하여 측정하였다.
- 24시간 후 20μl의 MTS solution을 첨가한 후 CO2 배양기 37℃, 5% CO2에서 4시간 반응시킨 후, 세포의 변화를 450nm에서 흡광도의 변화로 측정한 후 대조군에 대한 세포독성여부를 확인할 수 있는 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
- LPS로 자극에 의한 RAW264.7 대식세포에 대한 프랑킨센스의 대식세포에 대한 독성을 측정하기 위하여 MTS Assay를 수행하였다. 대조군과 프랑킨센스 24시간 처리한 실험군의 세포독성이 없었다(Figure 1).
- 다양한 농도에서 cell viability를 측정해 본 결과 1000ug/mL의 농도까지는 독성이 나타나지 않았다. RAW 264.7 대식 세포의 세포생존율에 독성을 주지 않는 10ug/mL, 100ug/mL, 1000ug/mL의 농도에서 독성 실험을 진행하였다. 실험 결과 프랑킨센스는 10ug/mL, 100ug/mL, 1,000ug/mL 모든 농도에서 각각 101.
- 대식세포 RAW264.7 세포에서 프랑킨센스에 의한 안전성을 확인하기 위하여 MTS를 이용하여 실험을 실시하였다. 실험결과 실험에 사용된 프랑킨센스는 세포독성을 나타내지 않았다.
- 독성이 없다고 알려진 프랑킨센스의 세포에 대한 독성을 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포에 프랑킨센스를 10-1000ug/mL 처리한 후 MTS assay를 실시하였다. 다양한 농도에서 cell viability를 측정해 본 결과 1000ug/mL의 농도까지는 독성이 나타나지 않았다.
- 프랑킨센스의 Proinflammatory Cytokine TNF-α, IL-1β의 생성 억제에 미치는 효과을 확인하기 위해 RAW 264.7 세포에 10ug/mL농도의 LPS 단독 처리하거나 LPS와 프랑킨센스를 10ug/mL, 100ug/mL, 1,000ug/mL 농도로 처리하였다.
대상 데이터
- ELISA kit는 전염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β를 eBioscience 사(San Diego ,CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 마우스의 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행인 KCLB에서 분양받아서 실험에 사용하였으며, 세포배양을 위해 DMEM인 Dulbecco's Modified Eagle Medium 배지를 사용하였으며 세포의 영양과 감염억제를 위해 FBS 10%과 penicillin-streptomycin 1%을 포함하는 배지를 사용하였다.
- 세포배양용 시약들인 fetal bovine serum(FBS)와 세포 배양액인 DMEM인 Dulbecco's Modified Eagle Medium, streptomycin-penicillin은 Gibco BRL사(Grand Island, USA)를 사용하였으며 Sigma-Aldrich사(St. Louis, USA)에서 Lipopolysaccharide(LPS)를 구입하였으며 MTS인 Cell Titer 96® AQ ueous One Solution은 Promega사 (Madison, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 프랑킨센스는 100% 순도의 천연 에션셜 오일이며 유기농 인증기관으로부터 인정받았으며 (ECOCERT-F-32600), 프랑스가 원산지인 NEW DIRECTIONS LABORATORY LTD사 제품을 사용하였다. 에탄올과 프랑킨센스를 4 : 1로 희석하여 배지에 첨가하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험군 사이의 통계적 차이는 students' t-test를 사용하였다.
이론/모형
- 프랑킨센스의 세포에 대한 독성반응은 Desai의 방법[10]에 의해 측정하였다. 세포독성측정은 MTS assay 방법을 이용하여 mitochondrial dehydrogenases에 의하여 formazan으로 전환되는 MTS를 측정하여 독성 정도를 판별하는 것이다.
성능/효과
- TNF-α 생성 억제 평가에서는 프랑킨센스 10ug/mL, 100ug/mL, 1,000ug/mL 농도별로 처리한 실험군에서 TNF-α 생성이 농도의존적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다.
- 그러나 TNF-α은 1,000ug/mL을 처리한 실험군은 TNF-α 생성이 유의성 있게 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(Figure 2, 3).
- 7 세포에 프랑킨센스를 10-1000ug/mL 처리한 후 MTS assay를 실시하였다. 다양한 농도에서 cell viability를 측정해 본 결과 1000ug/mL의 농도까지는 독성이 나타나지 않았다. RAW 264.
- 실험 결과 프랑킨센스는 10ug/mL, 100ug/mL, 1,000ug/mL 모든 농도에서 각각 101.6±5%, 98.9±3.02%, 99.0±2.97%로 상회하는 결과를 나타내어 세포독성을 나타내지 않았다 (Figure 1).
- 이러한 연구를 통하여 프랑킨센스가 LPS에서 유도된 염증모델에서 Proinflammatory Cytokine TNF-α 생성억제 효과로 인해 유의성 있는 항염성을 확인할 수 있었다.
- 이에 IL-1β과 TNF-α 의 생성억제의 변화를 살펴보기 위해 프랑킨센스를 처리한 실험군은 특히, TNF-α분비가 농도 의존적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다.
- 처리 후 TNF-α, IL-1β의 생성량을 조사한 결과 농도 의존적으로 TNF-α, IL-1β 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었으나 IL-1β에서는 유의성은 없었다.
- TNF-α 생성 억제 평가에서는 프랑킨센스 10ug/mL, 100ug/mL, 1,000ug/mL 농도별로 처리한 실험군에서 TNF-α 생성이 농도의존적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 특히 프랑킨센스는 1,000ug/mL을 처리한 실험군은 TNF-α 생성이 유의성 있게 생성 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 프랑킨센스의 항염 작용과 관련된 면역기전에 대한 생리활성을 객관적으로 입증하는 기초적인 자료로 활용을 할 수는 있으나 심도 깊은 항염 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 평균±표준오차(Mean±S.E.)로 계산되어진 실험 결과는 각군 간의 유의성 판정은 p＜0.05 에 해당하는 경우에 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
후속연구
- 특히 프랑킨센스는 1,000ug/mL을 처리한 실험군은 TNF-α 생성이 유의성 있게 생성 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 프랑킨센스의 항염 작용과 관련된 면역기전에 대한 생리활성을 객관적으로 입증하는 기초적인 자료로 활용을 할 수는 있으나 심도 깊은 항염 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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