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문제 정의
- 본 실험에서는 Lactobacillus casei 배양액으로부터 분리한 물질의 여러 가지 암 세포주에 대한 암세포 생육 억제 활성에 대해 측정함으로써 항암제로 개발하기 위한 가능성을 밝히기 위한 기초 자료를 확립하고자 하였다.
제안 방법
- 그리고 농축한 단백질을 FPLC(fast protein liquid chromatography, Sephadex 75)을 이용하여 농축된 단백질을 분리 정제하여 fraction collector로 각 3 mL/fraction으로 순서대로 회수하여 항암 활성 측정에 사용하였다. Fraction별로 나온 peak를 토대로 3번 fraction에서 9번 fraction을 이용하여 항암 활성을 측정하여 항암 효과를 지니고 있는 성분을 확인하기 위해 실험에 사용하였다(Fig. 1, 2).
- Lactobacillus casei를 배양하기 위하여 배지(Glucose 4.0%, Soy-peptone A3 1.5%, yeast extract 1.0%, K2HPO4 0.1%, sodium acetate 0.1%, diammonium citrate 0.1%, MgSO4 0.01%, MnSO4 0.005%)를 제조하고, 여기에 Lactobacillus casei 균주를 접종 (초기 접종 농도 0.5%)하여 37℃에서 약 13～14시간 동안 배양하였다. 배양시의 pH는 5.
- Lactobacillus casei의 배양물에서 분리한 단백질을 3, 10, 30, 100 KDa의 ultrafiltration membrane을 이용 Ultrafiltration 으로 농축한 농축물인 단백질 성분 A(protein components A) 와 단백질 성분 B(protein components B)에 대해 정상 세포의 세포 독성 및 암세포에 대한 생육 억제 활성을 측정하였다. 위의 두 가지 농축물 모두 정상 세포에 대해 농도 의존적으로 세포 독성이 증가하는 경향을 나타냈지만 최고 농도에서 20% 미만으로 비교적 낮은 세포 독성을 나타내어 정상 세포에 대한 세포 독성은 낮은 것으로 나타났다(Fig.
- Lactobacillus casei의 배양물을 이용하여 단백질을 분리한 후 3, 10, 30, 100 KDa의 ultrafiltration membrane을 이용하여 최종적으로 3～100 KDa(단백질 성분 A: protein components A)과 10～30 KDa(단백질 성분 B: protein components B)의 범위의 단백질로 농축 제조하여 단백질 정량(Bradford kit)을 통하여 단백질 정량한 후 실험에 사용하였다. 그리고 농축한 단백질을 FPLC(fast protein liquid chromatography, Sephadex 75)을 이용하여 농축된 단백질을 분리 정제하여 fraction collector로 각 3 mL/fraction으로 순서대로 회수하여 항암 활성 측정에 사용하였다.
- Lactobacillus casei의 배양물을 이용하여 단백질을 분리한 후 3, 10, 30, 100 KDa의 ultrafiltration membrane을 이용하여 최종적으로 3～100 KDa(단백질 성분 A: protein components A)과 10～30 KDa(단백질 성분 B: protein components B)의 범위의 단백질로 농축 제조하여 단백질 정량(Bradford kit)을 통하여 단백질 정량한 후 실험에 사용하였다. 그리고 농축한 단백질을 FPLC(fast protein liquid chromatography, Sephadex 75)을 이용하여 농축된 단백질을 분리 정제하여 fraction collector로 각 3 mL/fraction으로 순서대로 회수하여 항암 활성 측정에 사용하였다. Fraction별로 나온 peak를 토대로 3번 fraction에서 9번 fraction을 이용하여 항암 활성을 측정하여 항암 효과를 지니고 있는 성분을 확인하기 위해 실험에 사용하였다(Fig.
- 단백질의 농축물에서 항암 활성을 가지는 단백질을 정제하기 위해서, FPLC(fast protein liquid chromatography, Sephadex 75, Amersham)을 수행하였다. 구체적으로 사용된 buffer는 0.
- 배양한 후 aspirator로 상등액을 조심스럽게 제거한 후 dimethyl sulfoxide(DMSO) 를 각 well에 300 μL씩 첨가 후 상온, 어두운 곳에서 30분간 반응시켜 formazan을 녹인 후 96 well plate로 200 μL를 옮겨 ELISA reader(BiotrackⅡ plate reader, Amersham)을 이용 하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 정상 세포 및 암세포주의 성장 억제 효과를 측정하였다.
- 분리된 단백질을 농축하기 위하여, 분획분자량이 3, 10, 30, 100 KDa인 한외 여과막(ultrafiltration membrane)을 사용하였으며, 250 mL Stirred Ultrafiltration Cell(Milipore, model 8200, USA)을 이용하여 농축하였다. 농축 순서는 30, 100 KDa 한외 여과막을 사용하여 통과하는(flow-through) 용액을 받고, 3, 10 KDa 한외 여과막을 사용하여 상등액을 얻어 최종 3～100 KDa, 10～30 KDa의 두 가지 농축물을 이용하여 실험에 사용하였다.
- 위에서 제조된 Lactobacillus casei 균주의 배양물을 양이온 교환수지(SK-104, 강산, Na+ 형), 음이온 교환수지(PA-412, 강염기, Cl- 형) 및 합성이온 교환수지(HP-20)를 이용하여 전 처리하고, 상기 전 처리된 배양물에 황산암모늄(ammonium sulfate)을 최종 농도 70%가 되도록 4℃에서 4시간 동안 투여하여 교반하였다. 교반 후, 4℃에서 8,000×g로 20분간 원심분리하여 단백질을 침전시키고, 침전된 단백질을 50 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.
- 위와 같이 배양한 다음 Lactobacillus casei를 제거하고 배양물만을 얻기 위해, 원심분리기를 이용하여, 8000×g로 20분간 원심 분리하고 0.45 μm 크기의 공극막(pore membrane, Millipore, Bedford, Mass.)을 통과시켜 균체가 포함되지 않은 배양물만을 얻어 실험에 사용하였다.
- 이에 따라 유산균의 한 종류인 Lactobacillus casei의 배양 물로부터 단백질을 분리한 것으로 Ultrafiltration membrane (3, 10, 30, 100 KDa)으로 분리 농축한 단백질 물질인 단백질 성분 A(protein components A)와 단백질 성분 B(protein components B)을 분리하여 실험에 사용하였고, 이 물질을 이용 하여 보다 세밀한 분리를 위해 FPLC(fast protein liquid chromatography, sephadex 75, Amersham)를 이용하여 분석된 peak 를 이용하여 3번부터 9번까지 분획물을 얻어 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 분리된 단백질을 농축하기 위하여, 분획분자량이 3, 10, 30, 100 KDa인 한외 여과막(ultrafiltration membrane)을 사용하였으며, 250 mL Stirred Ultrafiltration Cell(Milipore, model 8200, USA)을 이용하여 농축하였다. 농축 순서는 30, 100 KDa 한외 여과막을 사용하여 통과하는(flow-through) 용액을 받고, 3, 10 KDa 한외 여과막을 사용하여 상등액을 얻어 최종 3～100 KDa, 10～30 KDa의 두 가지 농축물을 이용하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 이용한 동물세포는 정상 세포로는 293(Kidney, normal)을 이용하였고, 암세포주로는 AGS(Stomach cancer), A549(Lung cancer), MCF-7(Breast cancer), SK-OV-3(Ovary cancer), LoVo(Colon cancer)을 이용하였고, 모든 세포주는 Korean Cell Line Bank(KCLB)로 부터 구입하여 사용하였다. 각 세포의 배양은 10% fetal bovine serum(FBS)과 100 unit/ mL의 penicillin/streptomycin을 1% 첨가한 MEM 배지 및 RPMI1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
이론/모형
- Lactobacillus casei에서 분리한 단백질 성분에 대한 항암 효과를 측정하기 위해 Charmichael 등의 방법에 따라 MTT assay(Charmichael et al., 1987)를 실시하였다. 3-(4, 5-dimethyl2-thiazoly)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT) assay는 탈수소효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성 MTT formazan으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법으로 MTT formazan의 흡광도는 540～550 nm의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다.
성능/효과
- 5가지 암세포주에 대한 암세포 생육 억제 활성을 측정한 결과, 두 가지 농축물 모두 모든 암세포주에 대해서 농도 의존적으로 암세포의 생육 억제 효과가 증가하는 경향을 나타내었고, 이 중 최적 농도로는 100 μg/mL의 농도로 두 가지 농축물에서 모두 70% 정도의 암세포 생육 억제 효과를 나타냄으로서 두 농축물에서 항암 효과를 지니고 있는 단백질 성분을 함유하고 있는 것으로 확인하였다(Fig. 5, 6).
- FPLC를 이용하여 단백질 성분 A(protein components A)와 단백질 성분 B(protein components B)의 농축물을 분리한 분획물을 fraction collector를 이용하여 분획물을 회수하여 실험에 사용하였는데, 분리된 peak를 중심으로 3번에서 9번 fraction을 이용하여 정상 세포의 세포 독성 및 암세포주에 대한 암세포 생육 억제 활성에 대한 실험을 수행한 결과, 3, 8, 9번 fraction에서는 정상 세포에 대해 50% 정도 높은 세포 독성 효과를 나타내었고, 6, 7번 fraction에서는 세포 독성 효과를 나타내지 않았다. 반면 암세포에 대한 생육 억제 활성에서는 다른 분획물들에서는 활성을 나타내지 않았으나, 7번 fraction에서만 모든 암세포주에 대해 60～70% 정도로 높은 암세포 생육 억제 활성을 나타내었다(Table 1, 2).
- 그리고 FPLC를 이용하여 분리한 분획물에서는 3, 8, 9번 분획물에서는 정상 세포에 대한 세포독성이 50%를 나타내 독성 효과를 나타냈고, 그 외의 분획 물에서는 정상 세포에 대한 독성이 나타나지 않았다. 그 중 7번 분획물에서 암세포에 대한 생육 억제 활성을 나타낸 결과, 70% 정도의 높은 암세포 생육 억제 활성을 나타내 항암 활성을 지닌 성분으로 확인하였다. 그 외의 분획물에서는 거의 효과를 나타내지 않았다.
- 위에서 얻은 단백질 물질들을 이용하여 정상 세포와 암세포주를 이용하여 세포 독성 및 암세포 생육 억제 활성을 측정한 결과, 단백질 성분 A(protein components A)와 단백질 성분 B(protein components B)의 물질에서 최적 농도인 100 μg/mL의 농도에서 정상 세포에 대한 세포 독성은 20%정도로 낮은 세포 독성 효과를 나타내 정상 세포에 대한 독성 효과는 없는 것으로 나타났고, 5가지 암세포주(위암, 폐암, 유방암, 난소암, 대장암)에 대한 암세포 생육 억제 활성에서는 70% 정도의 높은 암세포 생육 억제 효과를 나타내 항암 효과를 나타냈다. 그리고 FPLC를 이용하여 분리한 분획물에서는 3, 8, 9번 분획물에서는 정상 세포에 대한 세포독성이 50%를 나타내 독성 효과를 나타냈고, 그 외의 분획 물에서는 정상 세포에 대한 독성이 나타나지 않았다. 그 중 7번 분획물에서 암세포에 대한 생육 억제 활성을 나타낸 결과, 70% 정도의 높은 암세포 생육 억제 활성을 나타내 항암 활성을 지닌 성분으로 확인하였다.
- 이는 위의 두 가지 농축물에서 분리한 분획물 모두에서 같은 효과를 나타내었다. 따라서 Lactobacillus casei의 배양물에서 분리한 단백질 중 항암 효과를 나타내는 성분을 함유하고 있는 것으로 나타났다.
- 그 외의 분획물에서는 거의 효과를 나타내지 않았다. 따라서 Lactobacillus casei의 배양물에서 분리한 성분이 항암 효과를 나타내고 있는 것을 확인하였다.
- 따라서 두 가지 단백질 농축물인 단백질 성분 A(protein components A)와 단백질 성분 B(protein components B)의 항암 효과를 나타내는 최적 농도는 100 μg/mL로 암세포의 생육 억제 활성이 70% 정도로 높은 항암 효과를 나타내는 것을 확인할 수있었다.
- 위에서 얻은 단백질 물질들을 이용하여 정상 세포와 암세포주를 이용하여 세포 독성 및 암세포 생육 억제 활성을 측정한 결과, 단백질 성분 A(protein components A)와 단백질 성분 B(protein components B)의 물질에서 최적 농도인 100 μg/mL의 농도에서 정상 세포에 대한 세포 독성은 20%정도로 낮은 세포 독성 효과를 나타내 정상 세포에 대한 독성 효과는 없는 것으로 나타났고, 5가지 암세포주(위암, 폐암, 유방암, 난소암, 대장암)에 대한 암세포 생육 억제 활성에서는 70% 정도의 높은 암세포 생육 억제 효과를 나타내 항암 효과를 나타냈다.
- Lactobacillus casei의 배양물에서 분리한 단백질을 3, 10, 30, 100 KDa의 ultrafiltration membrane을 이용 Ultrafiltration 으로 농축한 농축물인 단백질 성분 A(protein components A) 와 단백질 성분 B(protein components B)에 대해 정상 세포의 세포 독성 및 암세포에 대한 생육 억제 활성을 측정하였다. 위의 두 가지 농축물 모두 정상 세포에 대해 농도 의존적으로 세포 독성이 증가하는 경향을 나타냈지만 최고 농도에서 20% 미만으로 비교적 낮은 세포 독성을 나타내어 정상 세포에 대한 세포 독성은 낮은 것으로 나타났다(Fig. 3, 4).
후속연구
- 유산균의 한 종류인 Lactobacillus casei는 기존에 많은 효능을 가지고 있다고 보고되어지고 있고, 계속 연구가 되고 있다. 하지만 이 균주가 배양하면서 분비되어 나오는 물질이 포함되어 있는 배양물에 대한 연구는 미비한 상태이기 때문에 배양물에서 분리한 물질이 높은 암세포 생육 억제 효과를 나타냈기에 이는 향후 바이오 의약품을 개발하는데 있어서 기초 자료로 활용될 수 있는 가치를 지니고 있을 것이다.
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