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문제 정의
- 문제가 될 수 있다. 건강한 어린이에서 치주질환의 원인이 되는 세균들이 얼마나 분포하는지 조사하고, 또한 어린이들의치면 세균막에서 전신적으로 흔히 사용하고 있는 항생제들에 대한 내성유전자를 얼마나 가지고 있는지를 알아보고자 하였다. 어린이 87명(남자 44명, 여자 43명)의 치은연하 치태를 수집하여 5종의 치주질환 원인균 P.
- 1"气 특히 급속진행형 치주염인 경우는 어린 연령에서부터 발병하기도 하여 어린이에서 치주질환 원인균의 평가가 중요하다고 할 수 있다. 따라서 어린이에서 치주질환의 원인이 되는 세균들이 얼마나 분포하는지 조사하고, 또한 건강한 어린이들의 치면 세균막에서 전신적으로 흔히 사용하고 있는 항생제들에 대해 어느 정도 내성을 가지고 있는지를 알아보고자 하였다. 또한 각각의 항생제 내성 유전자와 치주질환 원인균과는 어떤 관련성을 가지고 있는지 상관관계를 알아보고자 하였다.
- 따라서 어린이에서 치주질환의 원인이 되는 세균들이 얼마나 분포하는지 조사하고, 또한 건강한 어린이들의 치면 세균막에서 전신적으로 흔히 사용하고 있는 항생제들에 대해 어느 정도 내성을 가지고 있는지를 알아보고자 하였다. 또한 각각의 항생제 내성 유전자와 치주질환 원인균과는 어떤 관련성을 가지고 있는지 상관관계를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 50 ng의 D* NA 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 시행하였다. 항생제의 내성유전인자로 알려진 9종 tet(Q), tet(M), ermF, aacA-aphD, cfxA, blasuv, blarsu, vanA, _mec厶에 특정한 10 nM의 각각의 primer를 제작하고 반응 premix에 포함시켰다(Table 2).
- 세균덩어리로부터 Wizard Genomic DNA 정제 기구를 이용하여 DNA를 추출하였으며. DNA의 농도는 UV스펙트럼 측정 기 를 이용하여 측정 하였다.
- actino-mycMemcomitans의 경우는 변성을 위해 95P에서 2분간, 이후 36번의 PCR cyclee 940에서 30초, 55P에서 1분, 7死 에서 2분간 시행하고, cycle이 끝난 후 72笔에서 최종적으로 10분간 처리하였다. PCR 산물은 1.5% agarose gel상에서 전기영동하고, gele ethidium bromide (0.5 *g/ml) 로 염색한 후 TFX-20M (Vilber lourmat, France)에서 사진촬영하여 증폭여부를 확인하였다.
- PCRe PCR premix (dNTP 250 “M, MgCb 1.5 mM, KCl 40 mM, Taq polymerase 1 U, tris-HCl 10 mM, Accupower™, Bioneer corp, Korea)에 10 pmol 한 쌍의 primer 2, 虬 DNA template 4 “1 와 증류수 14 岡를 첨가하여최종 용량을 20 로 조절하여 혼합하고 GeneAmp PCR system 2700 (Applied Biosystem, USA) 을 사용하여 중합효소연쇄반응을 시행하였다. 이때 사용한 PCR의 조건은 P.
- TaqDNA 중합효소를 사용하여 PCR을 시행하였다. PCR을 마친 후에 각각의 반응 후 튜브에서 0.2 ug 의 샘플을 채취하여 PCR산물은 1.5% agarose gel상에서 전기영동하고, gele ethidium bromide (0.5 “g/mD로 염색한 후 TFX-20M (Vilber lourmat, France)에서 사진 촬영하여 증폭 여부를 확인하였다(Fig. 1).
- 항생제의 내성유전인자로 알려진 9종 tet(Q), tet(M), ermF, aacA-aphD, cfxA, blasuv, blarsu, vanA, _mec厶에 특정한 10 nM의 각각의 primer를 제작하고 반응 premix에 포함시켰다(Table 2). TaqDNA 중합효소를 사용하여 PCR을 시행하였다. PCR을 마친 후에 각각의 반응 후 튜브에서 0.
- 얻어진 세균덩어리는 PBS를 이용하여 부드럽게 3회 세척하였다. 세균덩어리로부터 Wizard Genomic DNA 정제 기구를 이용하여 DNA를 추출하였으며. DNA의 농도는 UV스펙트럼 측정 기 를 이용하여 측정 하였다.
- 건강한 어린이에서 치주질환의 원인이 되는 세균들이 얼마나 분포하는지 조사하고, 또한 어린이들의치면 세균막에서 전신적으로 흔히 사용하고 있는 항생제들에 대한 내성유전자를 얼마나 가지고 있는지를 알아보고자 하였다. 어린이 87명(남자 44명, 여자 43명)의 치은연하 치태를 수집하여 5종의 치주질환 원인균 P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola, F. nucleatum, A. actinomycetemcomitans의 출현율과 항생제의 내성유전자로 알려진 9종 tet(Q), tet(M), ermF, aacA~aphD, cfxA, blasnv, blarsM, vanA, mecA의 출현율을 PCR을 이용하여 조사하였다.
- actinomycetemcomitans는 yeast extract (1 mg/ml), tryptic soy broth (30 mg/ml) 배지에서 혐기 배양하였다. 이들 배양한 표준 균주들은 12,000 rpm으로 1분간 원심분리하여 상층액은 버리고 균 pellet을 100 风 PBS buffer에 2회 washing시킨 후 다시 PBS 0.1 ml로 부유하여 위에서와 같은 방법으로 DNA를 추출하였다.
- 조사 대상자들의 치면세균막으로부터 치주질환 원인균의 출현율과 항생제 내성유전인자의 출현율을 조사하였다. 또한 치주질환 원인균과 내성유전인자의 출현율 간의 상관관계를 얻기위해, 그리고 치주질환원인균간 및 내성유전인자간의 상관관계조사를 위해 phi 상관계수(두 개의 이분형 변수들간의 상관성을 즉정하는 계수)와 Chi-square 검정을 시행하였다.
- 치은연하 치태 내 치주질환 원인균 P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola, F. nucleatum, A. actinomycetemcomitanse] 존재를 확인하기 위해 시행할 polymerase chain reaction (PCR)의 primer를 제작하였다. 치태에서 5종의 세균을 검색하기 위해서 16S rDNA의 염기서열에 기초한 각 세균종-특이 primer를 제작하였다(Table 1).
- 치태시료를 얻기 위해 대상자의 하악 우측 저〕1대구치 또는 제2유구치의 근심협측부위에서 멸균된 이쑤시개를 사용하여 조심스럽게 치은연하 치태를 채취하였다. 채취한 치태는 멸균된 O.
- actinomycetemcomitanse] 존재를 확인하기 위해 시행할 polymerase chain reaction (PCR)의 primer를 제작하였다. 치태에서 5종의 세균을 검색하기 위해서 16S rDNA의 염기서열에 기초한 각 세균종-특이 primer를 제작하였다(Table 1).
- 항생제의 내성유전인자로 알려진 9종 tet(Q), tet(M), ermF, aacA-aphD, cfxA, blasuv, blarsu, vanA, _mec厶에 특정한 10 nM의 각각의 primer를 제작하고 반응 premix에 포함시켰다(Table 2). TaqDNA 중합효소를 사용하여 PCR을 시행하였다.
대상 데이터
- gingivalis는 yeast extract (5 mg/ml), hemin (5 傀/ml), vitimin K (1 必g/ml)가 포함된 halFstrength brain heart infusion (BHI; Difco) 액체배지에 혐기 배양하였다. T. for-sy纺ia와 F. nucleatume yeast extract (10 mg/ml), hemin (5 *g/ml), vitamin K (1 "g/ml) 가 포함된 BHI 액 체배지에 혐기 배양하였다. T.
- 본 연구대상으로는 광주광역시 한 유치원의 전신질환이 없는 건강한 어린이 87명(남자 44명, 여자 43명)을 조사대상으로하였다. 어린이들의 연령은 4-6세 사이였으며 평균연령은 4.
- 제작한 primer가 정상적으로 PCR 산물을 만들어 낼 수 있는지 여부와 pcr 조건의 표준화를 위해 사용할 표준균주로서 P. gingivalis ATCC 33277, T. forsythia ATCC 43037, T. denticola ATCC 35405, F. nucleatum ATCC 10953, A actinomycetemcomitans ATCC 33384를 선택하였다. P.
데이터처리
- 또한 치주질환 원인균과 내성유전인자의 출현율 간의 상관관계를 얻기위해, 그리고 치주질환원인균간 및 내성유전인자간의 상관관계조사를 위해 phi 상관계수(두 개의 이분형 변수들간의 상관성을 즉정하는 계수)와 Chi-square 검정을 시행하였다. 또한 5보다 작은 기대빈도를 가지는 cell0] 존재할 경우 Fisher s exact 검정을 시행하여 odds ratio를 구하였다.
- 항생제 내성유전인자의 출현율을 조사하였다. 또한 치주질환 원인균과 내성유전인자의 출현율 간의 상관관계를 얻기위해, 그리고 치주질환원인균간 및 내성유전인자간의 상관관계조사를 위해 phi 상관계수(두 개의 이분형 변수들간의 상관성을 즉정하는 계수)와 Chi-square 검정을 시행하였다. 또한 5보다 작은 기대빈도를 가지는 cell0] 존재할 경우 Fisher s exact 검정을 시행하여 odds ratio를 구하였다.
성능/효과
- 건강한 정상의 어린이에서는 치주질환으로 치주조직이 파괴되는 경우는 드물다하지만 많은 어린이들에서 치주질환 원인균이 발견되고 있으며以也 병력이 있던 어린이는 결국 청소년기를 지나 성인이 되어서 다시 치주질환을 가지게 될 가능성이 높다는 사실이 알려져 있다. 1"气 특히 급속진행형 치주염인 경우는 어린 연령에서부터 발병하기도 하여 어린이에서 치주질환 원인균의 평가가 중요하다고 할 수 있다. 따라서 어린이에서 치주질환의 원인이 되는 세균들이 얼마나 분포하는지 조사하고, 또한 건강한 어린이들의 치면 세균막에서 전신적으로 흔히 사용하고 있는 항생제들에 대해 어느 정도 내성을 가지고 있는지를 알아보고자 하였다.
- g源ivMs와 vanA 간에 유의한 상관성이 있었다. 항생제 내성유전자간의 상관관계는 圮"Q)와 ermF (0.514)간에 중등도의 상관성을 나타내었으며, mecA와 vanA (0.25)간에 유의한 상관성을 나타내었다.
- 1. 치주질환 원인균으로 F. nucleatume 95.4%, T. forsythia는 55.2%, P. gingivalis는 40.2%, A. actinomycetemcomitans는 5.7%, T. denticola는 ;3.4%이었다.
- 2. 항생제 내성유전자의 줄현율 조사에서 cephalosporin 분해효소에 해당되는 cfxA 유전자는 100%에서 발견되었으며 ^-lactam 분해효소 blaTEM과 tetracycline 내성 유전자인 tet(M)도 100%의 출현율을 보였다. tet(Q)는 88.
- 3. 치주질환 원인균과 항생제 내성유전인자와의 관계를 보면 T. fgy㎛a와 b屁洲간에 그리고 P. g源ivMs와 vanA 간에 유의한 상관성이 있었다. 항생제 내성유전자간의 상관관계는 圮"Q)와 ermF (0.
- 2%의 출현율을 보였다. A. actinomycetemcom itans는 5.7%, T. denticola는 3.4% 로 가장 낮은 비율이었다.
- 5%의 출현율을 보였다. Aminoglycoside0)] 대한 복합 내성을 보이는 aacA-aphDe-meticillin 내성유전자 mecA는 9.2%로 가장 낮은 출현율을 보였다(Table 4).
- 5%의 출현율을 보였다. Aminoglycoside에 대한 복합 내성을 보이는 aac厶-ap/iD유전자와 meticillin 내성유전자 mec厶는 9.2%로 가장 낮은 출현율을 보였다';
- 원인균이 발견되었다(Table 3). F. nucleatume 95.4%의 높은 출현율을 보였으며 그 다음이 T. forsythia로 55.2%이었으며, P. gingivalis는 40.2%의 출현율을 보였다. A.
- forsythia균의 출현비율이 3 배 더 많았다. P. gingivalis와 va履간에 유의한 상관성이 있었는데 (phi : 0.250), odds ratio는 3.3으로 vau/1를 가진 사람은 가지지 않은 사람보다 P. gingivalis균의 출현비율이 3.3 배 더 많았다.
- 보였다. tet(Q)^ 88.5%, /3-lactam 분해효소의 다른 하나인 b丿所成는 29.9%이었으며 macrolim계 항생제에 대한 내성을 나타내는 emJ7유전자는 87.4%, vancomycin 항생제에 대한 내성을 나타내는 盹力厶는 48.5%의 출현율을 보였다. Aminoglycoside0)] 대한 복합 내성을 보이는 aacA-aphDe-meticillin 내성유전자 mecA는 9.
- 4%로 높게 나타났다. 관련성의 조사에서 erythromycin 저항유전자 ermF와 tetracycline 저항유전자인 tet(Q)^ 관련성이 나타났는데, Odds ratio가 21.6으로 가 있는 대상에서는 없는 경우보다 ermF의 출현비율이 21.6배나 높아 높은 상관성을 보임을 알 수 있었다.
- 많은 어린이들에서 치주질환의 원인균들이 높은 비율에서 발견되고 있음을 본 실험에서 알 수 있었다. 국소 유년형 치주염의 원인인 A actinomycetemcomitans도 5.7%에서 발견되었으며 치주질환의 주원인균으로 꼽히는 P. gingivalis 40.2 %, T. forsythia도 55.2%로 상당히 높은 출현율을 보이고 있었다.
- 또한 mecA와 程典厶간에 유의한 상관성을 나타내었으며 (phi : 0.25), odds ratio는 8.8로 mecA가 출현한 대상에서 출현하지 않은 경우보다 vanA의 출현비율이 8.8배 높았다.
- 가장 우선해야 할 것은 치태의 조절이다. 많은 어린이들에서 치주질환의 원인균들이 높은 비율에서 발견되고 있음을 본 실험에서 알 수 있었다. 국소 유년형 치주염의 원인인 A actinomycetemcomitans도 5.
- 모든 대상자의 치태를 PCR로 조사한 결과 한 종류 이상의 치주질환 원인균이 발견되었다(Table 3). F.
- aureus의 출현을 유발시킬 수 있다. 본 연구에서 作皿厶는 48.5%에서 그리고 mec厶는 9.2%에서 발견되었으며, 두 유전 자간에 유의한 관련성이 있었으며 mecA가 있는 대상에서 vanA 출현비율이 8.8배 높게 나타났다.
- 비슷한 연구에서 Williams 등節도 tetracycline 치료 후 모든 환자에서 tetracycline에 내성이 있는 연쇄상구균을 발견하였을 뿐 아니라 Fusobacterium nuclaatum을 비롯한 여러 종의 세균에서 tetracycline에 내성을 가지고 있었다고 보고하였다. 본 연구에서도 유전자는 100%에서 발현되었고, tet(Q)도 88.5%에서 발견되어 많은 어린이에서 이미 tetracycline에 대한 내성을 가지고 있음을 알 수 있었다.
- 5%, 치주염 환자에서 40%였다고 보고하였다. 이와 비교해볼 때 본 연구의 한국의 건강한 어린이에서 발견되는 항생제 내성유전자의 발현율이 매우 높음을 알 수 있었으며 특히 反Tactam 분해효소중 하나인 blarEM, cephalosporin 분해효소에 해당되는 cfxA 유전자, 그리고 tetracycline에 대한 내성유전자인 tet(M)은 100%의 출현율을 보여 어릴 때부터 구강내 치면세균막에 흔히 사용하는 항생제에 대한 내성유전자를 보유하고 있음을 확인할 수 있었다.
- 치주질환 원인균과 항생제 내성유전인자와의 관계를 보면 T. forsythia와 blasnv (phi : 0.514)간에 중등도의 상관성이 존재하였는데(phi : 0.514), odds ratio는 3.0으로 blasHv를 가진 사람은 가지지 않은 사람보다 T. forsythia균의 출현비율이 3 배 더 많았다. P.
- 치주질환원인균 사이의 출현에 따른 상관관계 조사에서 A actinomycetemcomitans는 T. forsythia (phi : 0.223) 및 T. denticola (phi : 0.224)와 유의한 상관성이 있었으며 , 또한 T. forsythia는 F. nucleatum (phi : 0.244)과 유의한 상관성을 보였다.
- 항생제 내성유전인자간의 상관관계는 te打Q)와 ermF간에 중등도의 상관성을 나타내었으며(phi : 0.514), odds ratio는 21.6으로 teZ(Q)가 출현한 대상에서 출현하지 않은 경우보다 emF의 출현비율이 그6배나 높았다.
후속연구
- 구강내 세균이 항생제 내성을 가지고 있다면 치료는 복잡해질 수 있다. 따라서 기계적 치료를 완료한 후 치주 병원균의 미생물학적 조사를 토대로 그 특징을 고려하여 항생제의 사용을 고려해야 할 것이다. 또한 치주감염을 해결한 후에는 각 개인에게 적합한 구강관리 유지 프로그램을 수행해서 이상적인 치태조절이 이루어지도록 해야겠다.
- 따라서 기계적 치료를 완료한 후 치주 병원균의 미생물학적 조사를 토대로 그 특징을 고려하여 항생제의 사용을 고려해야 할 것이다. 또한 치주감염을 해결한 후에는 각 개인에게 적합한 구강관리 유지 프로그램을 수행해서 이상적인 치태조절이 이루어지도록 해야겠다.
- 따라서 치주질환의원인 이 일부 세균 종에 의한 것이라면 불특정의 지속적인 물리적이고 기계적인 치태관리가 예방과 치료를 위한 유일한 방법은 아닐 것이다. 이런 경우 치태에서 질병을 유발하는 특별한 병원균만을 제거하거나 감소시키는 것이 효과적인 대안이 될 수 있고, 항균제를 국소적으로 또는 전신적으로 투약하면 기계적 치주치료의 효과를 증진시킬 수 있을 것이다. 따라서 치주질환의 치료를 위해 전신적 항생제 투여를 병용하기도 하였다車 사용되는 항생제 중 tetracycline, aminopenicillins, metronidazole, macrolides, ciprofloxacin과 amoxicillin clavulanic acid 조합이 추천되고 있다物.
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