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문제 정의
- 따라서 본 연구는 예비실험 결과 항산화효과가 높은 제주자생식물 20종을 대상으로 고압용매 추출하여 항산화 활성을 검증하고 폴리페놀 성분을 동정하여 식품산업에 응용할 천연항산화소재를 탐색하는데 그 목적이 있다.
제안 방법
- 1단계는 R① 1500 μL와 R② 1000 μL가 들어있는 sampling tube에 R③-WS 25 μL를 가하여 blank를 측정하였다.
- 1단계는 R① 2300 μL와 R② 200 μL가 들어있는 sampling tube에 R③-WS 25 μL를 가하여 blank를 측정하였다.
- 3단계 시료분석은 검량선 작성 시 R④-WS 대신 희석된 자생식물 추출물 10 μL를 가하여 3회 반복 측정하였다.
- 6 MPa에서 3분 동안 정치추출한 후에, 고압 유기용매는 시료가 충전된 cartridge를 통과하면서 10분 동안 1 mL/min의 유속으로 동적 추출을 행하였고, 추출물은 restrictor를 통하여 collection vial에 포집되었다. 3회 반복 추출하였다. 추출물은 회전진공증발농축기로 농축하였고 메탄올로 10 mL 정용하여 -20℃에서 저장하면서 분석용 시료로 사용하였다.
- 500 μL R①을 Trolox(R④)가 들어 있는 바이알에 가한 후 20～30초간 vortex시켜 혼합하여 R④ stock solution을 제조하고, 이 용액을 R①로 1:100으로 희석하여 R④-WS을 제조하였다.
- Sep-pak에 흡착되어 있는 폴리페놀 성분은 ethyl acetate 3 mL로 용출시키고, 용매를 진공회전증발농축기로 제거한 후 잔사를 methanol 0.5 mL에 용해시킨 다음 진공회전증발농축기로 용매를 제거하고 BSTFA(Supelco, USA) 250 μL를 가하여 75℃에서 20분간 유도체화시킨 것을 GC/MS에 1 μL 주입하여 분석하였다(10).
- 고압용매 추출은 시료 1 g을 cartridge에 충전하고 고압 chamber에 장착한 후, 유기용매(메탄올)는 syringe pump에서 가압되었고 supply valve를 통하여 cartridge로 주입되었다. 고압용매 추출물의 효과 검증을 위하여 보편적으로 많이 사용하는 온도와 압력 조건인 40℃와 13.6 MPa에서 3분 동안 정치추출한 후에, 고압 유기용매는 시료가 충전된 cartridge를 통과하면서 10분 동안 1 mL/min의 유속으로 동적 추출을 행하였고, 추출물은 restrictor를 통하여 collection vial에 포집되었다. 3회 반복 추출하였다.
- 따라서 본 연구에서는 사람주나무를 고압용매 추출하고 산가 수분해한 후 GC/MS를 이용하여 폴리페놀 성분을 분리·동정하였다(Fig. 1, Table 5).
- 제주 자생식물 20종을 대상으로 고압용매 추출(추출용매 100% methanol, 추출 온도 40℃, 추출 압력 13.6 MPa, 추출시간 10분)하여 총페놀 함량과 통합적 항산화 능력을 측정하고 폴리페놀 성분을 동정하였다. 추출수율은 붉나무, 말오줌때, 사방오리나무, 사람주나무, 팥배나무가 각각 21.
- 제주 자생식물 20종을 대상으로 고압용매 추출하여 총페놀 함량을 측정하였다(Table 3). 총페놀 함량은 아그배나무가 68.
- 이 용액 10 μL에는 1 nmol의 Trolox(표준용액)이 함유되어 있다. 지용성 통합적 항산화 능력 또한 3단계로 측정하였다. 1단계는 R① 2300 μL와 R② 200 μL가 들어있는 sampling tube에 R③-WS 25 μL를 가하여 blank를 측정하였다.
대상 데이터
- 490 μL Reagent 1(R①)과 10 μL H2SO4를 ascorbic acid(R④)가 들어 있는 바이알에 가한 후 20～30초간 vortex 시켜 혼합하여 R④ stock solution을 제조하고, 이 용액을 R①로 1:100으로 희석하여 R④ working solution(R④-WS)을 제조하였다.
- 자생식물의 항산화 활성은 Photochemiluminescence system(Berlin, Germany)으로 측정하였다(9). ACW와 ACL kits는 Analytik Jena AG(Jena, Germany)에서 구입하여 사용하였다.
- 5 mL에 용해시킨 다음 진공회전증발농축기로 용매를 제거하고 BSTFA(Supelco, USA) 250 μL를 가하여 75℃에서 20분간 유도체화시킨 것을 GC/MS에 1 μL 주입하여 분석하였다(10). GC/MS는 Hewlett-Packard사의 HP 6890 series GC system과 Agilent Technologies사의 5973 Network series mass selective detector를 direct inlet으로 연결한 것으로, 시료는 Agilent Technologies사의 7683B series autosampler를 사용하여 주입하였고, 기기분석조건은 Table 2와 같다. 분석결과는 GC/MS에 내장된 Wiley library와 비교하여 동정하였다.
- 본 실험에 사용한 고압용매 추출장치(SFX 3560, Isco Inc., USA)는 syringe pump, pump controller, sample cartridge가 장착되는 고압 chamber, 유량 조절을 위한 restrictor 그리고 collection vial로 구성되어 있다. 고압용매 추출은 시료 1 g을 cartridge에 충전하고 고압 chamber에 장착한 후, 유기용매(메탄올)는 syringe pump에서 가압되었고 supply valve를 통하여 cartridge로 주입되었다.
- 본 실험에 사용한 제주 자생식물은 Table 1과 같으며, 제주도 전역에서 20종을 채취하여 세척·음건한 후 30 mesh를 통과하도록 분쇄기(Ika Work, Inc., USA)로 분쇄하여 -20℃ 냉동고에 보관하면서 추출용 재료로 사용하였다.
- 즉, Reagent 3(R③)에 Reagent 2(R②)를 750μL 가하여 Reagent 3 working solution(R③-WS)을 제조하였다.
- 즉, R③에 R②를 750 μL 가하여 R③-WS을 제조하였다.
- 3회 반복 추출하였다. 추출물은 회전진공증발농축기로 농축하였고 메탄올로 10 mL 정용하여 -20℃에서 저장하면서 분석용 시료로 사용하였다. 가용성 고형분의 함량은 추출물 1 mL를 취하여 105℃에서 항량이 될 때까지 건조한 후 증발잔사의 양으로 나타내었다.
데이터처리
- GC/MS는 Hewlett-Packard사의 HP 6890 series GC system과 Agilent Technologies사의 5973 Network series mass selective detector를 direct inlet으로 연결한 것으로, 시료는 Agilent Technologies사의 7683B series autosampler를 사용하여 주입하였고, 기기분석조건은 Table 2와 같다. 분석결과는 GC/MS에 내장된 Wiley library와 비교하여 동정하였다.
이론/모형
- 자생식물의 항산화 활성은 Photochemiluminescence system(Berlin, Germany)으로 측정하였다(9). ACW와 ACL kits는 Analytik Jena AG(Jena, Germany)에서 구입하여 사용하였다.
- 총페놀 함량은 Peschel 등(8)의 방법에 의하여 측정하였다. 즉, 시료 용액 0.
성능/효과
- 수용성 항산화 능력은 이질풀, 사람주나무, 산딸나무, 붉나무가 각각 598, 394, 293, 270 μmol ascorbic acid equivalent/g로 높았고, 지용성 항산화 능력은 백량금, 새우나무, 이질풀, 붉가시나무가 611, 314, 296, 242 μmol trolox equivalent/g로 높았다. GC/MS에 의한 폴리페놀성분을 동정한결과 15개의 주요 피크를 얻었으며, 그 중 2종의 폴리페놀류 (gallic acid(체류시간 19.7분)와 quercetin(체류시간 33.5분)), ascorbic acid(체류시간 35.3분) 그리고 다수의 지방산류(체류시간 18.6, 21.0, 21.8, 21.9, 23.6분)를 확인할 수 있었 는데, 이 중 gallic acid는 다른 성분보다 peak area가 높은 것으로 나타나 사람주나무의 가장 중요한 폴리페놀 성분으로 추정되었다.
- 1, Table 5). 그 결과 15개의 주요 피크를 얻었으며, 그 중 2종의 폴리페놀류, ascorbic acid, 다수의 지방산 류를 확인할 수 있었다. 확인된 폴리페놀 성분은 체류시간 19.
- 수용성 항산화 능력은 이질풀, 사람주나무, 산딸나무, 붉나무가 각각 598, 394, 293, 270 μmol ascorbic acid equivalent/g로 높았고, 지용성 항산화 능력은 백량금, 새우나무, 이질풀, 붉가시나무가 611, 314, 296, 242 μmol trolox equivalent/g로 높았다.
- 수용성 항산화 능력은 이질풀이 598 μmol ascorbic acid equivalent/g로 가장 높았고, 다음으로 사람주나무, 산딸나무, 붉나무, 자금우, 말오줌때가 각각 394, 293, 270, 246, 230 μmol ascorbic acid equivalent/g을 나타내었다.
- 실험 결과는 추출물 고형분 g당 μmol equivalents ascorbic acid 또는 trolox의 항산화능으로 나타내었다.
- 이질풀과 사람주나무는 수용성과 지용성 통합적 항산화능력 모두 높았는데, 총페놀 함량도 각각 359, 270 mg GAE/g로 높았으며, 지용성 항산화 능력이 높게 나타난 새우나무와 아그배나무의 총페놀 함량도 411, 399 mg GAE/g 로 높아 항산화 능력과 총페놀 함량 사이에는 서로 상관관계가 있었다.
- 1%로 가장 높았다. 총페놀 함량은 아그배가 68.3 mg GAE/g로 가장 높았고, 다음으로 사람주나무, 석위, 말오줌때가 각각 57.6, 56.6, 55.1 mg GAE/g을 나타내었다. 수용성 항산화 능력은 이질풀, 사람주나무, 산딸나무, 붉나무가 각각 598, 394, 293, 270 μmol ascorbic acid equivalent/g로 높았고, 지용성 항산화 능력은 백량금, 새우나무, 이질풀, 붉가시나무가 611, 314, 296, 242 μmol trolox equivalent/g로 높았다.
- 제주 자생식물 20종을 대상으로 고압용매 추출하여 총페놀 함량을 측정하였다(Table 3). 총페놀 함량은 아그배나무가 68.3 mg GAE/g로 가장 높았고, 다음으로 사람주나무, 석위, 말오줌때가 각각 57.6, 56.6, 55.1 mg GAE/g을 나타내었고, 붉나무, 자금우, 이질풀, 새우나무도 50 mg GAE/g 이상의 높은 함량을 나타내었다.
- 제주 자생식물 20종을 대상으로 고압용매 추출하여 추출 수율을 측정한 결과는 Table 3과 같다. 추출수율은 붉나무, 말오줌때, 사방오리나무, 사람주나무, 팥배나무가 각각 21.8, 21.5, 21.1, 20.7, 20.1%로 가장 높았다. 그 외에 아그배나무, 석위, 백량금, 귀룽나무, 산딸나무가 15% 이상, 이질풀, 자금우, 딱지꽃, 짚신나물 등이 14% 이하의 추출수율을 나타내 었으며, 이삭여뀌가 8.
- 그 결과 15개의 주요 피크를 얻었으며, 그 중 2종의 폴리페놀류, ascorbic acid, 다수의 지방산 류를 확인할 수 있었다. 확인된 폴리페놀 성분은 체류시간 19.7분에서 gallic acid를, 33.5분에서 quercetin을 확인할 수 있었는데, 이중 gallic acid는 다른 성분보다 peak area가 매우 높아 사람주나무의 가장 중요한 폴리페놀 성분으로 추정되었다.
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