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문제 정의
- 것이다. 그러나 아직까지 랫트 관절연골세포에 저강도 맥동성 초음파 적용 시 세포신호전달기전에 관한 연구 보고는 거의 보고되지 않고 있어, 본 연구에서는 연골세포 내의 신호전달기전을 밝힘으로서 저강도 맥동성 초음파의 관절염 치료에 대한 기초 근거를 제시하고자 하였다.
- 본 연구에서는 단충 배양한 관절 연골세포에서 저강도 맥동성 초음파(low-intensity pulsed ultrasound) 의 비 열적 효과와 관련하여 세포신호전달 기전에 대해 알아보고자 하였다. 연골세포에서 초음파를 1 W/cm와 0.
- 본 연구에서는 임상분야에서 관절염 치료에 사용하는 초음파 치료에 대한 세포수준에 미치는 메카니즘을 연구하였다. 저강도 맥동성 초음파는 세포 내 특정 신호전달체계인 ERK1/2 를 거쳐 세포 증식에 변화에 영향을 미치고 있음을 관찰하였다.
- 특히 본 연구에서는 임상분야에서 관절염 치료에 적용하는 초음파가 실제 어떠한 세포 기전에 의해 효과를 발휘하는지 세포 수준에서의 연구가 매우 미진한 실정이기에, 세포 배양된 연골세포에서의 초음파 치료 효과에 관해 세포 내 작용 기작에 대한 근거를 제시하는데 목적이 있다.
제안 방법
- 얻어진 세포는 10% FCS(fetal calf serum, GIBCO, 26140-038, NY) 와 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium: GIBCO 213000-025, NY)에 항생제를 첨가하여 35 mm 배양 접시에 각 well 당 5 X 104 cells/㎠ 밀도로 분주하였으며, 37℃, 5% CO2 하에서 배양하였다. 2~3일 간격으로 배지를 교환해주었고, 배양접시가 완전히 차면 모든 세포는 1회 계대 배양후 사용하였다. 1회 계대배양 할 때 배양접시에 3 X 104 cells/㎠ 농도로 용도에 따라 각각 동일하게 심어 배양한 후 사용하였다.
- , Minneopolis, USA)를 사용하여 정량하였다. Calibrator Diluent RD5-39를 비특이적 결합(nonspecific binding, NSB)을 한 well에 150 ㎕ 첨가하고, Calibrator Diluent RD5-3950를 100 ㎕ 첨가하여 zero standard(B0) well을 만들었다. 다음으로 microplate well에 sample 과 100 ㎕의 표준 용액을 첨가하였다.
- , 1995). Membrane 은 TBS(PBS containing 0.01% (v/v) Tween 20)에 5% nonfat dried milk로 4℃에서 1시간 반응시키고, TBS로 다시 세척한 후 rabbit anti-phospho p44/42 MAP Kinase (Thr202/Tyr204) polyclonal antibody, rabbit anti-p44/42 MAP kinase polyclonal antibody (Cell Signaling technology, 1:100, Herts, UK)를 4 ℃에서 24 시간 반응시킨 후, enhanced chemical luminescence kit (RPN 2106, Amersham Life Science, Inc., USA)를 이용하여, 방사선 필름에 감광시켜서 단백질 발현을 확인하였다.
- rat 를 사용하여 연골 채취를 하였다. 각 실험을 위한 백서들은 경추탈골한 후 우측 슬관절 부위를 베타딘과 알코올(70%)로 소독하고 피부절개 후 관절 연골을 채취하였다. 채취한 연골 조직은 4℃ PBS(phosphate buffer saline, pH 7.
- 다음으로 microplate well에 sample 과 100 ㎕의 표준 용액을 첨가하였다. 또한 blank 와 NSB well 을 제외한 나머지 well 에 50 ㎕의 1차 항체 용액을 첨가하고, blank를 제외한 나머지 well에 50 ㎕의 PGE2 Conjugate를 첨가하였다. 마지막으로 실온에서 2 시간 동안 반응시킨 후 수세 용액(400 ㎕)으로 4번 깨끗이 세척한 후 암실에서 기질 용액을 각각의 well에 200 ㎕ 첨가하여 30분간 반응시킨다.
- transducer head는 37℃ 에서 세포배양이 된 35 m 배양 접시(culture dish) 내 배지와 head가 공기가 접하지 않도록 잘 밀착되도록 한 후 연골세포에 자극을 주었다. 매일 동일 시간에 처리하였으며, 출력은 0.25 W/㎠, 1 W/㎠를각각 주파수가 1 ㎒, 맥동비 (duty cycle) 가 1:4인 맥동초음파로 설정하고, 0, 1, 2, 5, 10분간 조사하였다.
- 배양 용기에 배양한 관절연골 세포를 PBS 로 2회 세척한 후 배양된 세포를 DNA 와 결합하는 형광 색소인 Hoechst 33342(Invitrogen, USA) 시약을 5 ㎍/㎖ 농도로 첨가된 PBS와 암실에서 10분간 반응시킨 후, 자외선 필터를 이용하여 형광현미경(Olympus Optical Co., Tokyo, Japan) 으로 핵의 형태를 관찰하였다. 최소한 300개 이상의 세포를 관찰하였으며, 핵 내 염색질 (chromatic) 이 응죽(condensation) 된 사멸체 (apoptotic body)가 존재하는 세포를 세포사멸이 일어난 세포로 간주하였다.
- 연골세포에서 과산화수소수 50 μM 과 저강도 맥동성 초음파를 처리한 후 p-ERK 1/2의 활성화에 미치는 영향을 알아보았다. 과산화수소수 50 μM과 저강도 맥동성 초음파 0.
- 이후 4℃, 14,000 rpm 에서 15분 동안 원심분리하여 상충액을 추출하였다. 용해된 세포의 단백질 농도는 단백질을 정량화를 통해 계산하였고, 추출된 단백질은 동일한 양을 7.5~12% sodium dodecyl sulfate(SDS) polyacrylamide gel의 각 lane에 로딩한 후 전기 영동하였다. 이후, 겔을 polyvinylidene difluoride membrane (Amersham, 0.
- 일정기간 동안 배양한 연골세포에서 초음파를 0.25 W/㎠를 5분간 처리한 후 p-ERK1/2, p38 MAPK, JNK 등의 MAPK 아형 중 어느 kinase 가 활성화되는지 알아보았다. 저강도 초음파 처리 10분 후 p-ERK1/2 가 발현되었고 시간 경과에 따라 점차 증가되어, 60분에 최대로 발현된 후 90분에서 감소하였다 (Fig.
- 저강도 초음파가 염증에 관여하는 PGE2에 미치는 영향을 알아보기 위해 ELISA를 이용하여 PGE2 농도 변화를 관찰하였다 (Fig. 5). PGE2 농도 변화는 산화적 스트레스를 주지 않았을 때 0.
- 초음파를 1 W/cm와 0.25 W/㎠의 강도로 0, 1, 2, 5, 10 분간 처리하여 24시간과 72시간 후에 연골세포의 증식률을 관찰하였다. 초음파 처리를 하지 않았을 때 24시간 후 98.
- , Tokyo, Japan) 으로 핵의 형태를 관찰하였다. 최소한 300개 이상의 세포를 관찰하였으며, 핵 내 염색질 (chromatic) 이 응죽(condensation) 된 사멸체 (apoptotic body)가 존재하는 세포를 세포사멸이 일어난 세포로 간주하였다.
- 퇴행성 골관절염과 같은 상태를 인위적으로 유도하기 위하여 세포 증식에 영향을 주는 여러 물질 중 과산화수소수를 50 μM, 24시간 처리하여 관절연골세포의 세포고사를 유도하였다. 배양 현미경 소견 상 정상관절 연골세포에 비해 (Fig.
대상 데이터
- 관절연골세포 배양을 위해 실험동물로는 무게 280 ~300 g 의 Sprague-Dawley rat 를 사용하여 연골 채취를 하였다. 각 실험을 위한 백서들은 경추탈골한 후 우측 슬관절 부위를 베타딘과 알코올(70%)로 소독하고 피부절개 후 관절 연골을 채취하였다.
- 이 부유액은 나일론 여과지 (pore size, 120 ㎛)로 여과한 후 1,500 rpm 으로 5분간 원심분리 하여 원심분리 된 세포를 Hank's balanced salt solution(GIBCO, 450-1200EA, NY) 으로 세척한 후 연골세포를 얻었다. 얻어진 세포는 10% FCS(fetal calf serum, GIBCO, 26140-038, NY) 와 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium: GIBCO 213000-025, NY)에 항생제를 첨가하여 35 mm 배양 접시에 각 well 당 5 X 104 cells/㎠ 밀도로 분주하였으며, 37℃, 5% CO2 하에서 배양하였다. 2~3일 간격으로 배지를 교환해주었고, 배양접시가 완전히 차면 모든 세포는 1회 계대 배양후 사용하였다.
- 치료용 초음파는 Sonopuls 590® therapeutic ultrasound device (Enraf Nonius, 2600 AV, Delft, the Netherland)를 사용하였고, 초음파의 transducer head 의 직경은 3 cm 이고, 70% 에탄올로 소독하여 사용하였다. transducer head는 37℃ 에서 세포배양이 된 35 m 배양 접시(culture dish) 내 배지와 head가 공기가 접하지 않도록 잘 밀착되도록 한 후 연골세포에 자극을 주었다.
데이터처리
- 0 windows 를 사용하였다. 각 실험결과들은 평균 ± 표준오차로 나타내었고, 통계검정은 independent t-test 를 실시하였다. 모든 통계학적 유의 수준은 p<0.
이론/모형
- 관절연골세포의 증식과 생존율을 측정하기 위하여 XTT(sodium 3'-[1-(phenylamino- carbonyl)-3, 4-tetrazolium]-bis (4-methoxy-6-nitro) benzene sulfonic acid hydrate) 분석 방법을 이용하였다. 이는 mitochondria의 succinate-tetrazolium 환원효소에 의해서 formazan 염색으로 살아있는 세포에서만 분해되어 나타나며, 수용성 대사산물이다.
성능/효과
- 25W/㎠처리 후 60분 후에 p-ERK 가 발현되었고, 두 가지를 병합 시에도 발현이 활성화됨을 보였으나 병합 처리 시 더욱 인산화가 증폭되지는 않았다. ERK 선택적 억제제인 PD 98059를 10-8 M 과 10-5 M 을 60분 전처리 시 과산화수소수와 저강도 맥동성 초음파에 의하여 증가되는 p-ERK 1/2 활성화를 10-5 M에서 유의하게 억제하였다(Fig. 4).
- 3B). Hoechst 염색을 통하여 핵 내 염색질 응축 (condensation) 을 형광 현미경을 통해 관찰한 결과 정상관절 연골세포 (Fig. 3C) 에 비하여 산화적 스트레스로 인한 세포고사 유도 시 핵 응축과 세포 수가 많이 감소했음이 관찰되었다(Fig. 3D).
- p38 MAPK, JNK는 발현되지 않았다. MAPK 아형 중 저강도 맥동성 초음파로 인하여 관절 연골 세포의 p-ERK1/2 가 활성화됨을 알수 있었다.
- 5). PGE2 농도 변화는 산화적 스트레스를 주지 않았을 때 0.30±0.04 ng/㎖, 과산화수소 50 μM 처리 후 4시간 후에 0.83 ±0.03 ng/㎖로 유의하게 증가되었다 (P<0.05). 저강도 초음파만 시간별(0, 1, 5, 10분)로 처리하고, 1분일 때 0.
- 또한 세포질 내 PGE2의 농도감소에도 유의한 영향을 미쳤다. 결론적으로, 본 연구에서 관절연골세포에서 저강도 맥동성 초음파는 ERK 를 매개로 관절연골세포의 증식과 ERK 발현 및 PGE2 농도변화에 영향을 미쳐 세포 증식 관련 신호전달에 관여하는 것으로 보인다. 본 연구결과를 바탕으로 하여 저강도 맥동성 초음파와 관절연골세포의 신호전달기전에 있어 ERK1/2 가 중요한 영향을 미칠 것으로 사료된다.
- 알아보았다. 과산화수소수 50 μM과 저강도 맥동성 초음파 0.25W/㎠처리 후 60분 후에 p-ERK 가 발현되었고, 두 가지를 병합 시에도 발현이 활성화됨을 보였으나 병합 처리 시 더욱 인산화가 증폭되지는 않았다. ERK 선택적 억제제인 PD 98059를 10-8 M 과 10-5 M 을 60분 전처리 시 과산화수소수와 저강도 맥동성 초음파에 의하여 증가되는 p-ERK 1/2 활성화를 10-5 M에서 유의하게 억제하였다(Fig.
- 25 W/㎠ 를 5분 동안 처리한 후 10분 후부터 p-ERK 가 발현되기 시작하여 시간이 증가함에 따라 점차 증가되어 60분에 최대로 발현된 후 90분부터 감소하였다. 과산화수소수, 저강도 초음파는 p-ERK의 활성화를 증가시켰으며 이러한 ERK 증가는 PD 98059(10-5M) 에 의해 유의한 활성화 억제 반응을 보였다 (P<0.05). 또한 세포질 내 PGE2의 농도감소에도 유의한 영향을 미쳤다.
- 세포 고사 유도 후 관절연골세포의 형태학적인 변화는 핵 내분열이나 응축 등 전형적인 세포고사의 특징을 보였다. 관절연골세포에 과산화수소수 50 μM을 24시간 처리 후에 Hoechst 염색으로 관찰한 결과 연골세포의 핵 내 응축 현상이 현저히 일어났다. DiPietrantonio 등30)에 의하면 H2O2는 세포고사를 유도한다고 하였고, 이외 반응성 산소종(ROS), 일산화질소 등은 관절염, 세포노화, 암, 허혈성 손상 등의 다양한 질환을 유발하며 세포 내에서 많이 생성되어지는 물질로 알려져 있다.
- 유도하였다. 배양 현미경 소견 상 정상관절 연골세포에 비해 (Fig. 3A) 산화적 스트레스로 인한 세포고사 유도 시 연골세포의 세포질의 위축및 세포 수가 감소함을 나타내었다(Fig. 3B). Hoechst 염색을 통하여 핵 내 염색질 응축 (condensation) 을 형광 현미경을 통해 관찰한 결과 정상관절 연골세포 (Fig.
- 결론적으로, 본 연구에서 관절연골세포에서 저강도 맥동성 초음파는 ERK 를 매개로 관절연골세포의 증식과 ERK 발현 및 PGE2 농도변화에 영향을 미쳐 세포 증식 관련 신호전달에 관여하는 것으로 보인다. 본 연구결과를 바탕으로 하여 저강도 맥동성 초음파와 관절연골세포의 신호전달기전에 있어 ERK1/2 가 중요한 영향을 미칠 것으로 사료된다.
- 생체 내에서 신장 (stretch) 과 유압 (shear stress) 과 같은 기계적 스트레스는 특정 세포형태 내 DNA 합성을 유도하고, 기계적 스트레스는 세포외 신호조절에 관여하는 ERK1/2 를 활성화 시킨다25). 본 연구결과에서 관절연골세포에서 0.25 W/㎠의 저강도 맥동성 초음파 처리 시 10분에서부터 유의한 p-ERK1/2의 증가가 관찰되었다. 다른 세포시스템 내에서 ERK1/2 활성화는 세포의 신장과 같은 직접적인 기계적 자극이 세포의 증식을 유도하며, 기계적 스트레스를 간접적으로 적용 시 비생리학적 기계적 에너지의형태가 관여하는 것으로 보인다26).
- 2 W/㎠의 강도로 세포 주를 자극했을 때 Jun N-terminal kinase(JNK) 와 extracellular signal-regulated kinase (ERK)를 경유하여 type II collagen 과 aggrecan 의 합성을 촉진시킨다고 하였다. 본 연구결과에서도 세포외 기질 물질의 증가는 검사하지 않았지만 0.25 W/㎠에서 p-ERK1/2의 활성화를 촉진하여 세포 증식에 영향을 주는 것으로 사료된다. 본 연구에서 사람의 퇴행성 골관절염과 같은 상황을 유도하기 위해 세포에 세포고사를 유도하는 물질로서 사용한 H2O2(hydrogen peroxide)는 높은 산화적 물질이며, 자유라디칼의 하나로 단백질, 지질, 핵산의 산화 과정을 통해 세포고사를 유도하여, 세포 기능 손상과 세포 고사를 유도하게 된다.
- Asada 등33)의 연구에서 Bovine 관절연골세포에서 과산화수소수는 연골세포의 자가 고사를 유도하였으며, 이는 Ca2+ 신호전달과 p-ERK의 활성화를 통해 세포의 자가고사를 유도한다고 하였다. 본 연구에서 염증성 사이토카인과 관련하여 저강도 초음파가 PGE2의 농도에 미치는 영향을 관찰한 결과 저강도 초음파와 적용 시 산화적 스트레스로 인해 증가되었던 PGE2 가 유의하게 감소되었다. H2O2 로 인한 세포 내 염증성물질인 PGE2의 증가는 세포의 산화적 스트레스로 인한 물질로 생각되어지며, Reyes-Martin 등쾌의 연구에서 신장의 원위세뇨관 내 Madin-Darby cells (MDCK) 에서 H2O2 를 이용하여 급성 신부전염을 유도 시에 S-ketoprofen 은 cyclooxyge- nases (COX-1 and COX-2), PGE2 생성과 caspase 의존성 세포고사를 억제한다고 보고한바가 있다.
- DiPietrantonio 등30)에 의하면 H2O2는 세포고사를 유도한다고 하였고, 이외 반응성 산소종(ROS), 일산화질소 등은 관절염, 세포노화, 암, 허혈성 손상 등의 다양한 질환을 유발하며 세포 내에서 많이 생성되어지는 물질로 알려져 있다. 본 연구에서는 과산화수소수로 유도한 세포고사에서 p-ERK1/2 활성과 저강도 맥동성 초음파가 자극한 p-ERK1/2의 인산화는 PD 98059 (10-5M)에서 유의한 차단 효과를 보였다. 따라서 관절연골세포에서 저강도 맥동성 초음파에 의한 ERK 경로를 통해 증식에 영향을 주는 것으로 보여진다.
- 1B). 상기의 실험결과에 따르면 1 W/㎠보다 0.25 W/㎠ 초음파 처리 시 배양된 관절연골세포의 세포 분열 증식이 높다는 것을 관찰하였다.
- 본 연구에서 사람의 퇴행성 골관절염과 같은 상황을 유도하기 위해 세포에 세포고사를 유도하는 물질로서 사용한 H2O2(hydrogen peroxide)는 높은 산화적 물질이며, 자유라디칼의 하나로 단백질, 지질, 핵산의 산화 과정을 통해 세포고사를 유도하여, 세포 기능 손상과 세포 고사를 유도하게 된다. 세포 고사 유도 후 관절연골세포의 형태학적인 변화는 핵 내분열이나 응축 등 전형적인 세포고사의 특징을 보였다. 관절연골세포에 과산화수소수 50 μM을 24시간 처리 후에 Hoechst 염색으로 관찰한 결과 연골세포의 핵 내 응축 현상이 현저히 일어났다.
- 연골세포에서 초음파를 1 W/cm와 0.25 W/㎠의 강도로 0, 1, 2, 5, 10분 간 처리하여 24시간과 72시간 후에 연골세포의 생존율을 관찰한 결과 1W/㎠로 처리한 후 24시간과 72시간 후 변화는 0분일 때보다 시간 의존적으로 세포 증식이 유의한 세포증식의 억제효과를 보였으며(p<0.001), 0.25 W/㎠의 강도에서는 0분일 때 보다시간 의존적으로 유의한 세포증식의 효과를 보였다 (p<0.001). 저강도 맥동성초음파 0.
- 저강도 맥동성 초음파는 세포 내 특정 신호전달체계인 ERK1/2 를 거쳐 세포 증식에 변화에 영향을 미치고 있음을 관찰하였다. 이러한 결과를 바탕으로 좀더 다양한 변수의 초음파를 적용하여 초음파가 세포 내 어떠한 수용기와 다른 신호전달체계에도 어떤 경로를 거쳐 작용을 하는지 구체적인 연구들이 다각적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 저강도 맥동성 초음파의 강도를 달리하여 1 W/㎠와 0.25 W/㎠을 적용하여 세포의 증식을 확인한 결과 1 W/㎠를 적용했을 때는 오히려 세포의 증식이 24시간과 72 시간 배양 시 현저히 떨어지는 것을 관찰할 수 있었으며, 0.25 W/㎠ 적용 시에는 세포 증식이 유의하게 증가하였다 (p<0.05). 이는 1 W/㎠로 사용시 연골세포의 손상을 가져와 세포 증식을 오히려 억제하는 것으로 보여 지며, 0.
- 산화적 스트레스로 세포고사를 유도 후 저강도 초음파 처리 결과는 다음과 같다. 초음파 1분일 때 0.80±0.03 ng/㎖, 2분일 때 0.64±0.01 ng/㎖, 90초일 때 0.7±0.04 ng/㎖로 저강도 초음파 5분과 10분에서 유의한 PGE2의 농도의 감소를 보였다 (P<0.05)(Fig. 5).
후속연구
- 저강도 맥동성 초음파는 세포 내 특정 신호전달체계인 ERK1/2 를 거쳐 세포 증식에 변화에 영향을 미치고 있음을 관찰하였다. 이러한 결과를 바탕으로 좀더 다양한 변수의 초음파를 적용하여 초음파가 세포 내 어떠한 수용기와 다른 신호전달체계에도 어떤 경로를 거쳐 작용을 하는지 구체적인 연구들이 다각적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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