보고서 정보
주관연구기관 |
인하대학교 InHa University |
연구책임자 |
박소라
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2004-06 |
과제시작연도 |
2003 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201300001724 |
과제고유번호 |
1460003764 |
사업명 |
보건산업진흥(보건의료기술인프라개발) |
DB 구축일자 |
2013-05-20
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키워드 |
초음파자극.관절연골세포.세포증식.대사작용.기계적자극전달.퇴행성관절염.ultrasound.articular chondrocyte.proliferation.metabolism.mechanotransduction pathway.osteoarthritis.
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초록
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◆ 연구목적
최종 연구개발 목표: 관절 연골세포에서 초음파 자극의 기계적 자극전달 기전(mechanotransduction pathway)를 규명하므로 골관절염 치료를 위한 초음파 기기 개발에 기초적인 지식을 제공하고자 하였음.
1차년도: 초음파자극이 연골세포에 미치는 영향에 관한 in vitro 연구
2차년도: 초음파자극이 연골세포에 미치는 세포내 기계적 자극전달 기전 연구
◆ 연구방법
1. 실험에 사용된 관절 연골세포
1) 1차 분리세포: 토끼 무릎 관절연골, 사람 무릎 관절연골에서 효소처리하여
◆ 연구목적
최종 연구개발 목표: 관절 연골세포에서 초음파 자극의 기계적 자극전달 기전(mechanotransduction pathway)를 규명하므로 골관절염 치료를 위한 초음파 기기 개발에 기초적인 지식을 제공하고자 하였음.
1차년도: 초음파자극이 연골세포에 미치는 영향에 관한 in vitro 연구
2차년도: 초음파자극이 연골세포에 미치는 세포내 기계적 자극전달 기전 연구
◆ 연구방법
1. 실험에 사용된 관절 연골세포
1) 1차 분리세포: 토끼 무릎 관절연골, 사람 무릎 관절연골에서 효소처리하여 분리된 세포사용.
2) 사람 관절연골세포주: 미국 Harvard Univ. Dr. Goldring으로부터 immortalized human juvenile costal chondrocytes (C28I2)를 공급받아 사용하였음.
2. 연골세포 in vitro 배양법:
실험 목적에 따라 단층배양, 조직배양, alginate bead 배양법을 사용하였음.
3. 골관절염 동물모델:
토끼의 무릎인대 파열로 유도된 관절염 모델을 사용하였음.
4. 연골세포의 생존률, 증식 관찰: 3H-thymidine uptake, Live/Dead cell kit
5. 생화학적 분석법: 35S-sulfate, 3H-proline uptake, DMB assay, Sircoll assay
6. 분자생물학적 분석법: RT-PCR, Western blot, Northern blot
7. 조직학적 분석법: H/E, alcian blue, safranin-O, 면역화학적 분석, 전자현미경 관찰
8. Calcium imaging: calcium sensitive fluoresence로 confocal microscope에서 관찰
9. 초음파 자극: Duplogen에서 제작된 자극기를 사용하였으며, 주파수는 0.8 MHz, 자극강도는 단층배양에서는 100, 200, 300 mW/cm2, 조직배양에서는 40, 200, 500, 700 mW/cm2의 강도로 실험하였고, 자극시 배양기와 transducer 사이는 젤을 사용하여 공기층 제거하였음.
◆ 연구결과
1. 연골세포에서의 초음파자극 효과를 다양한 배양법에서 관찰한 결과 저강도 초음파자극은 연골세포의 증식과 세포외기질의 합성을 촉진하였다.
1) 단층배양법 (monolayer culture)에서 관찰한 결과 초음파 자극은 연골세포의 증식을 촉진하였음.
2) 조직배양법 (explant culture)에서 관찰한 결과 교원질과 당단백의 합성을 촉진하였음.
3) Alginate 배양법 (삼차원 배양)에서 관찰한 결과 초음파자극에 의하여 연골세포의 생존력이 증가하였으며, 연골세포의 표현형 유지, 교원질과 당단백의 합성이 증가되었음.
4) 이와 같은 초음파자극은 자극강도에 매우 예민하게 반응하였으며, 고자극강도에서는 오히려 증식과 세포외기질의 합성을 감소시켰다.
2. 초음파자극은 연골기질의 합성을 촉진할 뿐 아니라 연골기질의 분해를 감소시켰다. 초음파자극에 의하여 교원질 분해를 유발하는 MMP-1 mRNA 발현이 감소되었으며, MMP의 작용을 억제하는 TIMP-1의 발현이 증가되었다.
3. 초음파자극의 연골세포 대사작용 증가 효과는 조직학적 실험에서도 확인할 수 있었다.
1) 연골조직 특이 세포외기질 염색법인 safranin O에서 양성인 부분이 증가하였으며, 면역조직화학염색 결과 type II collagen의 분비가 증가함을 관찰하였음.
2) 전자현미경으로 세포미세구조의 변화를 관찰한 결과 초음파자극에 의하여 연골세포 세포질 내의 rER, mitochondria가 증가하였음.
4. 골관절염 동물모델에서 초음파자극의 in vivo 효과를 관찰하였음.
1) 골관절염 치료제로 알려진 HA의 활액막 흡수가 초음파자극에 의하여 증가되었으며, 관절연골과 활액막의 조직학적 소견 상 관절염 특징이 감소하였다.
2) 이와 같은 결과들은 초음파자극이 골관절염의 직접적인 치료효과를 가질수 있으며, 또한 골관절염의 치료제의 작용을 더욱 촉진시킬수 있는 가능성을 제시한다.
5. 초음파자극은 관절연골세포에서 mechanotransduction signaling pathway를 통하여 자극이 전달되었음.
1) Stretch activated channel과의 관계: 초음파 자극에 의한 type II collagen의 발현 증가는 stretch activated channel blocker인 gadolinium에 의하여 억제되었으며, 이는 초음파자극의 mechanotransduction pathway에 stretch activated channel이 관여하는 것으로 생각된다.
2) Integrin과의 관계: 초음파 자극에 의한 type II collagen의 발현 증가가 integrin에 의한 mechanotransduction pathway에 의한 것으로 관찰되었다.
3) 세포내 자극전달 경로 중 MAPKinase와의 연관성.
초음파 자극이 MAPKinase 중 ERK (extracellular signal-regulated kinase) 활성화에 미치는 영향을 관찰한 결과 초음파자극 직 후 ERK의 phosphorylation은 증가하였고, 이는 stretch activated channel의 blocker인 gadolinium에 의하여 억제되었다. 이와 같은 결과는 초음파의 stretch activated channel 자극 효과는 세포내 신호전달 체계인 ERK 활성화와 연관될 가능성을 의미한다.
4) 세포내 자극전달 경로 중 JNK와 p38과의 연관성
초음파 자극에 의하여 p38의 phosphorylation은 크게 변화하지 않았지만 JNK의 phosphorylation은 자극 5분부터 증가하기 시작하였다.
5) 세포내 calcium 이동과의 연관성
초음파 자극에 의한 세포내 Ca2+ 증가를 fluoro3를 이용하여 confocal microscope으로 측정한 결과 초음파 자극에 의하여 세포내 Ca2+ 이동이 증가하는 것을 관찰하였다. 추후 세포막 Ca2+channel과 세포내 Ca2+ 저장소와의 관계에 관한 실험이 요구된다.
결론: 본 연구에서는 저강도 초음파자극에 의하여 관절 연골세포의 증식과 세포외기질 합성이 증가됨을 in vitro에서 관찰하였으며, 초음파가 관절연골세포의 자극전달기전으로는 세포막에 존재하는 stretch activated channel, integrin receptor가 mechanoreceptor로 작용하며, 세포 내에서는 MAPK pathway가 활성화됨을 관찰하였다. 또한 in vivo 실험을 통하여 초음파자극이 골관절염을 치료하는 효과를 관찰하였으며, 이와 같은 치료효과는 초음파자극의 직접적인작용 뿐 아니라 hyaluronic acid와 같은 골관절염 치료제의 무릎 관절강 내 흡수를 촉진하므로 유발된 다는 사실을 관찰하였다.
◆ 기대효과
1) 본 연구결과에서 관찰된 초음파자극의 관절연골세포 자극 효과 및 골관절염 치료 효과는 이때 까지는 보고된 바가 없는 최초의 연구결과임.
2) 초음파자극을 통한 골관절염 치료제인 hyaluronic acid의 활액막 흡수 증가 역시 기존의 논문에서 발표된 바가 없는 연구결과임.
3) 저자극강도의 초음파 자극이 세포에 미치는 직접적인 생물학적 효과를 증명하였으며, 이와같은 생물학적 효과가 stretch receptor, integrin, MAPK activation 등의 mechanotransduction pathwy를 통한 자극전달기전에 의함을 관찰하였음.
4) 본 연구의 결과들은 골관절염의 새로운 치료 기법으로 저자극 강도 초음파 자극이 사용될수 있는 이론적 근거를 제시하였음.
5) 초음파 자극의 골관절염 치료효과를 극대화를 유발하기 위하여 초음파 자극의 적정화가 필요할 것이며, 이를 위하여 초음파자극의 자극강도, 빈도, 파형 종류 등에 따른 다양한 실험이 추후 필요할 것임.
Abstract
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◆ Objectives
This study was to study the feasibility of ultraound stimulation on cartilage regeneration by means of analyzing the proliferation and metabolic activity of chondrocytes. We also evaluated the possible mechanotransduction pathway in ultrasound stimulation.
Ist year (Part I): To st
◆ Objectives
This study was to study the feasibility of ultraound stimulation on cartilage regeneration by means of analyzing the proliferation and metabolic activity of chondrocytes. We also evaluated the possible mechanotransduction pathway in ultrasound stimulation.
Ist year (Part I): To study effects of low intensity ultrasound (LIUS) on articular chondrocytes in different culture conditions
2nd year (Part II): to evaulate the possible mechanotransduction pathwy in LIUS stimulation.
◆ Materials and method
1. Part I: Articular cartilage was harvested from the hip, knee and shoulder joints of 10-week-old white rabbits. Chondrocytes isolated by collagenase digestion were cultured in a monolayer culture dish, and also embedded in suspended alginate beads, and were cultured in DMEM for 1-2 weeks. The US apparatus, Noblelife (Duplogen, suwon) was used to deliver an ultrasound signal with spatial and temporal average intensities of 0, 100, 200, 300 mW/cm2. The frequency was 0.8 MHz signal with continous wave. US treatments were administered for 10 min for every 12h under culture dishes. Cell number, histological findings, Western blot, Northern blot, RT-PCR, immunostaining, and TEM of the chondrocyte-alginate gel composites were analyzed.
2. Part II: Immortalized human chondrocytes (C28I2, from Harvard Ins of Med) were cultured in DMEM. Cells were collected, and protein and total RNA was isolated for molecular biological evaluation (Western blot, Northern blot, RT-PCR). To examine the role of stretch activated channel in US stimulated pathway, gadolinium was treated 15 minutes of US stimulation. To examine the role of integrin, the pharmacologic inhibitor was treated. To identify whether the MAPKs are involved in the mechanotransduction process during US stimulation by Wstern blot, p38 and JNK protein expression and their phosphorylation was examined. To determine a change of calcium concentration by LIUS, Floro 3-AM was used used on chondrocytes treated LIUS.
◆ Results
1. Part I:
In alginate culture, the cell viability increased more than 1.6-fold but had no effect on cell proliferation. Proteoglycan synthesis and collagen synthesis after ultrasound stimulation at 200 mW/cm2 increased 30% and 50 % over that of the control group, reapectivily. In monolayer culture, a significant increase in the proliferation of chondrocytes was observed in greater than 25 % at 150 or 200 mW/cm2 and the viability was approximately 90% for all monolayer cultures.Proteoglycan and collagen synthesis have no significant difference after LIUS treatment. Additionally, The number of RER and mitochondria were increased significantly with respect to control for subcellular organelles in cells exposed at 200 mW/cm2 intensity. These results demonstrated that the application of LIUS can improve the quality of chondrocyte. However, the changes in catabolic and anabolic mechanism were dependent on the specific mode of the applied culture condition and mechanical forces, with LIUS stimulation eliciting the greater effect. This finding suggests that chondrocytes may respond differently to different modes of applied forces.
1. Part II:
LIUS increased the mRNA levels of type II collagen in time dependent manner after US stimulation. Gadolinium, the blocker of stretch-activated ion channel activity inhibit the increase of collagen type II expression, meaning that this channel involves pathway of chondrocyte responses to US stimuli. Roles for integrins and integrin-associated signaling molecules in the mechanotransduction pathway activated after US stimulation became evident by showing that integrin inhibitor GRGDSP inhibit the collagen type II expression. The ERK phosphorylation was increased after US stimulation. US-induced ERK activation was inhibited by gadolinium. The JNK phosphorylation was increased after US stimulation. These results provides the first evidence for the activation of the US-activated mechanotransduction pathway. LIUS can enhance collagen type II synthesis by time dependent manner. LIUS is likely to use the stretch-activated ion channel and integrin as a mechanoreceptor, sequentially activating MAPK pathway. Also, LIUS can influence the calcium concentration in the chondrocytes.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 3
- 목차 ... 4
- Ⅰ. 연구개발결과 요약문 ... 5
- (한글)초음파 자극이 관절 연골세포의 증식 및 대사작용에 미치는 영향 ... 5
- (영문)ESUMMARY ... 7
- Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 15
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 20
- 4. 사업화 목표 달성도 및 계획(개발과제만 해당) ... 21
- 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 22
- 6. 연구개발결과의 파급효과 ... 26
- 7. 첨부서류 ... 27
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