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문제 정의
- 본 연구에서는 숙성기간이 다른 머루와인의 품질적 특성을 페놀 화합물의 함량과 와인의 색을 중심으로 분석하고, 페놀 화합물의 종류와 항산화 활성과의 상관관계를 규명함으로써 머루와인의 품질에 미치는 숙성기간의 영향을 조사하였다.
가설 설정
- 3 ㎖를 차례로 가하였다. 대조군은 시료 대신 증류수 1 ㎖를 가하였다. 시작 시간으로부터 6분이 경과한 후 1 MNaOH 2 ㎖를 가하고 증류수를 추가로 가하여 10 ㎖로 만든 다음, 510 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
제안 방법
- 총 탄닌 함량은 Ribereau-Gayon & Stonestreet법(1966)에 따라 다음과 같이 실시하였다. 2개의 시험관에 1/50로 희석한 와인 1 ㎖와 증류수 0.5 ㎖, 12 N HCl 1.5 ㎖를 혼합한 용액을 각각 가하고 1개의 시험관은 30분간 중탕 가열한 후 냉각시키고 나머지 시험관은 실온에 정치시켰다. 양 시험관에 95% 에탄올 0.
- 알코올 함량은 증류장치로 와인을 증류한 증류액을 주정계로 측정한 값을 Gay Lussac표에 대비하여 산출하였다(NTSTI 1999). pH는 pH meter(HM-30G, DKK TOA Cop. Japan)로 측정하였고, 총 산도는 자동적정장치(AUT-211, TOA Electronics Ltd. Japan)에 증류수 100 ㎖와 시료 2 ㎖를 가하고 0.1 N NaOH로 pH 8.3이 될 때까지 적정하여 소비된 NaOH ㎖수를 주석산으로 환산하여 나타내었다(NTSTI 1999). 환원당 함량은 DNS법으로 측정하여 포도당 양으로 나타내었다(Miller GL 1959).
- 와인 50 ㎖에 젤라틴 용액 5 ㎖를 가하고 3일간 정치한 다음, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 얻은 상등액으로 탄닌 함량(C1)을 측정하였다. 대조군은 젤라틴을 넣기 전에 탄닌 함량(C0)을 측정하였다. 젤라틴 지수는 다음 식을 이용하여 계산하였다.
- 5 ㎖와 2 M 아황산나트륨 20 ㎕를 가한 후, 5분간 정치한 다음 420 ㎚와 520 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하고, 두 파장의 흡광도 값을 합하여 IC(SO2)를 구하였다. 두 번째 시험관에는 와인 0.5 ㎖에 모델와인 4.5 ㎖와 증류수 20 ㎕를 가한 후, 5분간 정치한 다음 420 ㎚와 520 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하고, 두 파장의 흡광도 값을 합하여 IC(H2O)를 구하였다. 색소 중합체 비는 IC(SO2)/IC(H2O)×100의 식으로 계산하였다.
- 머루의 당도가 높아(22 °brix 내외) 보당은 하지 않았으며, 아황산 농도는 150 ppm을 첨가하였다.
- , Japan)를 이용하여 Hunter's value인 L, a, b값을 측정하였고, Glories Y(1978)의 분광분석법에 준하여 색의 강도와 색소 중합체를 분석하였다. 먼저 각 와인시료를 420 ㎚, 520 ㎚, 620㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 색의 강도(CI=420+520+620)와 채도(hue=420/520)를 계산하였다. 색소 중합체(PP) 측정은 첫 번째 시험관에 와인 0.
- 9 ㎖에 희석한 시료와인 100 ㎕를 혼합하고 folin-ciocalteu 시약 500 ㎕를 가하여 5분간 방치하였다. 상기 혼합액에 포화 탄산나트륨용액 500 ㎕를 첨가하여 실온에서 30분간 정치한 후 725 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 페놀 함량은 gallic acid equivalent(GAE) ㎎/ℓ로 표시하였다.
- 먼저 각 와인시료를 420 ㎚, 520 ㎚, 620㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 색의 강도(CI=420+520+620)와 채도(hue=420/520)를 계산하였다. 색소 중합체(PP) 측정은 첫 번째 시험관에 와인 0.5 ㎖에 모델와인(12% 에탄올, 주석산 5 g/ℓ, pH 3.2) 4.5 ㎖와 2 M 아황산나트륨 20 ㎕를 가한 후, 5분간 정치한 다음 420 ㎚와 520 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하고, 두 파장의 흡광도 값을 합하여 IC(SO2)를 구하였다. 두 번째 시험관에는 와인 0.
- 5 ㎖를 혼합한 용액을 각각 가하고 1개의 시험관은 30분간 중탕 가열한 후 냉각시키고 나머지 시험관은 실온에 정치시켰다. 양 시험관에 95% 에탄올 0.25 ㎖를 가한 후, 550 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 탄닌 함량은 시료군의 흡광도 값에서 대조군의 흡광도 값을 뺀 값에 19.
- 오크통에서 숙성기간이 다른 머루와인의 페놀 화합물 함량과 색, 항산화 활성 등을 분석하였다. 페놀 화합물의 함량은 숙성기간이 긴 머루와인일수록 감소하였는데, 그 경향은 종류에 따라 차이가 있었다.
- 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH)에 대한 전자공여능(electron donating ability, EDA)을 통한 항산화 활성은 Blois MS(1958) 방법에 따라 측정하였다. 와인 0.2 ㎖에 0.4 mM DPPH 3.8 ㎖를 가하고 10초간 혼합한 후, 실온에서 30분간 반응하고 517㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군은 시료대신 에탄올을 동량 첨가하여 실험하였고, 양성대조군으로는 상용 항산화제인 butylated hydroxyanisole(BHA, Sigma Co.
- 표백법(Ribereau-Gayon & Stonestreet 1965)으로 다음과 같이 측정하였다. 와인 1 ㎖, 0.1% HCl/에탄올 1 ㎖, 2% HCl 20 ㎖를 혼합하여 용액 A를 만든 후, 대조군에는 용액 A 2 ㎖와 증류수 0.8 ㎖를 가하고, 시료군에는 용액 A 2 ㎖에 증류수 0.4 ㎖와 아황산나트륨(D=1.24) 0.4 ㎖를 가한 다음, 실온에서 20분간 정치한 후 520 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 안토시아닌 함량은 대조군의 흡광도 값에서 시료군의 흡광도 값을 뺀 값에 875을 곱한 값을 ㎎/ℓ로 표시하였다.
- 머루의 당도가 높아(22 °brix 내외) 보당은 하지 않았으며, 아황산 농도는 150 ppm을 첨가하였다. 와인 숙성을 위한 용기는 유럽산 오크통을 사용하였으며, 저온(10℃ 이하)에서 각각 1년(WG1), 2년(WG2), 3년(WG3)을 숙성시켰다. 비교군으로 사용한 포도와인은 마주앙사에서 수입 제조한 2006년산 Cabernet Sauvignon 와인(CS)을 사용하였다.
- 8 ㎖를 가하고 10초간 혼합한 후, 실온에서 30분간 반응하고 517㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군은 시료대신 에탄올을 동량 첨가하여 실험하였고, 양성대조군으로는 상용 항산화제인 butylated hydroxyanisole(BHA, Sigma Co.), quercetin(Sigma Co.)을 이용하여 동일한 방법으로 실시하였다. EDA는 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 값를 구하여 다음 식으로 계산하여 백분율로 표시하였다.
- 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(1999)이 개발한 분광분석법을 이용하여 측정하였다. 즉, 증류수 4 ㎖에 희석 시료와인1 ㎖를 가하고 5분이 경과한 다음, 5% NaNO2 0.3 ㎖와 10% AlCl3 0.3 ㎖를 차례로 가하였다. 대조군은 시료 대신 증류수 1 ㎖를 가하였다.
대상 데이터
- 분석에 사용한 머루와인은 김천 소재 수도산 산머루농산에서 2006년, 2007년, 2008년에 생산된 머루를 사용하여 제조한 것으로 제조과정은 일반적인 와인 제조방법에 따라 22℃ 온도 하에 스테인레스 탱크에서 실시하였다. 주모로 사용한 효모종균은 자연에서 분리한 Saccharomyces cerevisiae sp.
- 와인 숙성을 위한 용기는 유럽산 오크통을 사용하였으며, 저온(10℃ 이하)에서 각각 1년(WG1), 2년(WG2), 3년(WG3)을 숙성시켰다. 비교군으로 사용한 포도와인은 마주앙사에서 수입 제조한 2006년산 Cabernet Sauvignon 와인(CS)을 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험은 독립적으로 3회 반복 실시하여 얻은 결과를 실험군당 평균으로 나타내었고, SPSS 통계프로그램(Version 10.0, SPSS Inc. USA)을 이용하여 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)과 Duncan´s multiple range test(p<0.05)로 유의성을 검정하였다.
- 05)로 유의성을 검정하였다. 페놀 화합물과 항산화 활성의 상관관계는 단회 기분석(simple regression analysis)을 통하여 분석하였다.
이론/모형
- 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH)에 대한 전자공여능(electron donating ability, EDA)을 통한 항산화 활성은 Blois MS(1958) 방법에 따라 측정하였다. 와인 0.
- HCl 지수(IHCl)는 Ribereau-Gayon 등(2000)이 개발한 분광분석법을 이용하여 측정하였다. 와인 1 ㎖에 12 N HCl 1.
- 안토시아닌 함량은 SO2 표백법(Ribereau-Gayon & Stonestreet 1965)으로 다음과 같이 측정하였다.
- 알코올 함량은 증류장치로 와인을 증류한 증류액을 주정계로 측정한 값을 Gay Lussac표에 대비하여 산출하였다(NTSTI 1999). pH는 pH meter(HM-30G, DKK TOA Cop.
- 와인의 색도 분석은 색차계(SP-80, TOKYO Denshoku Co., Japan)를 이용하여 Hunter's value인 L, a, b값을 측정하였고, Glories Y(1978)의 분광분석법에 준하여 색의 강도와 색소 중합체를 분석하였다.
- 젤라틴 지수(Igelatin)는 Glories(1978)가 개발한 분광분석법에 따라 실시하였다. 와인 50 ㎖에 젤라틴 용액 5 ㎖를 가하고 3일간 정치한 다음, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 얻은 상등액으로 탄닌 함량(C1)을 측정하였다.
- 총 탄닌 함량은 Ribereau-Gayon & Stonestreet법(1966)에 따라 다음과 같이 실시하였다.
- 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu법으로 측정하였다(Singleton & Rossi 1965).
- 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(1999)이 개발한 분광분석법을 이용하여 측정하였다. 즉, 증류수 4 ㎖에 희석 시료와인1 ㎖를 가하고 5분이 경과한 다음, 5% NaNO2 0.
- 3이 될 때까지 적정하여 소비된 NaOH ㎖수를 주석산으로 환산하여 나타내었다(NTSTI 1999). 환원당 함량은 DNS법으로 측정하여 포도당 양으로 나타내었다(Miller GL 1959).
성능/효과
- 결과적으로, 페놀 화합물과 와인의 색을 중심으로 봤을 때, 머루와인은 포도와인에 비하여 안토시아닌 함량이 높아 색의 강도와 적색도가 높지만 숙성기간이 길수록 페놀 화합물의 함량이 급격히 줄어들고, 특히, 항산화 활성과 연관성이 높은 탄닌의 함량과 중합도가 감소하는 경향을 보여 와인의 body와 풍미에는 부정적일 것으로 생각된다. 따라서, 포도와인과 달리 숙성기간을 단기간(1년 이내)으로 유지하는 것이 머루와인의 품질 유지에 적합할 것으로 사료된다.
- 결과적으로, 페놀 화합물과 와인의 색을 중심으로 봤을 때, 머루와인은 포도와인에 비하여 안토시아닌 함량이 높아 색의 강도와 적색도가 높지만 숙성기간이 길수록 페놀 화합물의 함량이 급격히 줄어들고, 특히, 항산화 활성과 연관성이 높은 탄닌의 함량과 중합도가 감소하는 경향을 보여 와인의 body와 풍미에는 부정적일 것으로 생각된다. 따라서, 포도와인과 달리 숙성기간을 단기간(1년 이내)으로 유지하는 것이 머루와인의 품질 유지에 적합할 것으로 사료된다.
- 이는 대조군인 포도와인(CS)의 활성(83%)보다 약간 낮은 결과로 머루와인의 항산화 활성이 포도와인의 활성과 크게 차이가 없음을 나타낸다. 머루와인 내 페놀 화합물의 종류별 함량과 항산화 활성의 상관관계를 회기 분석한 결과, 총 페놀, 플라보노이드, 안토시아닌, 탄닌의 상관계수(r2)가 각각 0.7625, 0.7005, 0.1136, 0.9189로 나타났다. 이러한 결과는 탄닌 함량이 머루와인의 항산화 활성과 강하게 연관되어 있음을 나타낸다.
- 1과 같다. 숙성 1년 머루와인(WG1)의 자유라디칼 포획효과가 87% 내외로, 합성 항산화제인 BHA(90%)와 포도 내의 대표적인 항산화 물질인 Quercetin(92%)만큼 높은 활성을 나타내었다. 이러한 활성은 장기 숙성와인(WG2, WG3)에서도 80% 내외를 유지하였다.
- 숙성기간이 길어질수록 안토시아닌 함량이 감소하는 것은 안토시아닌 분자가 와인 내에서 매우 불안정하고, 분해에 매우 민감하여 pH, 온도, 효소, 빛, 안토시아닌의 구조와 농도, 복합체를 형성하는 화합물-플라보노이드, 페놀산, 금속- 등의 존재 여부에 영향을 받기 때문이다(Markakis P 1982). 숙성기간이 같은 포도와인(CS)과 비교했을 때 머루와인(WG3)은 상대적으로 낮은 탄닌 함량을 가지고 있음을 알 수 있었으며, 이는 탄닌의 중합도(IHCl)와 축합된 탄닌(Condensed tannin, Igelatin)의 비율에서도 확인할 수 있었다. 탄닌의 중합도와 축합된 탄닌의 함량도 숙성기간에 따라 감소하는 경향을 나타내었으나 유의성은 없었다.
- 탄닌의 중합도와 축합된 탄닌의 함량도 숙성기간에 따라 감소하는 경향을 나타내었으나 유의성은 없었다. 와인의 명도(L*)는 숙성기간이 길수록 높아져 점차 밝은 색으로 변화하였으나 색의 강도(CI)는 감소하였는데, 대조군인 포도와인의 강도보다는 높았다. 머루와인의 적색소(a)는 감소하였고, 노란색소(b)와 색상(hab)은 점차 증가하는 경향을 보였다.
- 본 연구에서도 오크통 숙성을 수행하였기 때문에 비록 탄닌의 중합도는 낮지만 이러한 축합체 생성이 와인의 색에 영향을 준 것으로 생각된다. 와인의 채도(C*)는 숙성기간에 따른 차이가 없었으며, 색상(hab)은 숙성기간에 따라 증가하는 경향을 보였다. 색상 값의 증가는 direct condensation 산물의 비율과 pyranoanthocyanin의 비율(특히, 4-vinylphenol adduct)의 증가 덕분으로, 이는 와인의 색을 purple-red에서 red-orange로 전환시키는 bathochromic shift를 유발한다(Boido 등 2006).
- 8%로 숙성기간에 따른 차이는 없었다. 총 산은 숙성기간이 길수록 약간 감소하는 추세를 나타내었으나, 모든 머루와인에서 대조군인 Cabernet Sauvignon 와인(CS)의 산도보다 1.5배 이상 높은 수치를 나타내었다. 그러나 pH는 머루와인군과 포도와인에 큰 차이가 없었다.
- 페놀 화합물의 함량은 숙성기간이 긴 머루와인일수록 감소하였는데, 그 경향은 종류에 따라 차이가 있었다. 총 페놀, 안토시아닌, 탄닌은 숙성기간이 길수록 감소하였고 플라보노이드는 숙성 2년 와인에서 크게 낮았으나 그 이후에는 차이가 없었다. 특히, 총 페놀과 안토시아닌은 유의성 있는 함량 차이를 보였다.
- 모든 종류의 페놀 화합물이 숙성시간이 길어질수록 감소하였는데, 그 경향에서는 차이가 있었다. 총 페놀, 안토시아닌은 숙성기간이 길수록 유의성 있게 감소하는 경향을 보였는데, 숙성 1년 와인(WG1) 기준으로 총 페놀의 경우, 74%(WG2)와 43%(WG3)의 함량을, 안토시아닌의 경우, 53%(WG2), 45%(WG3)의 함량이 각각 존재하는 것으로 분석되었다. 반면에 플라보노이드는 숙성 2년(WG2)이후 52%로 감소한 후 더 이상 줄어들지 않았다.
- 총 페놀, 안토시아닌, 탄닌은 숙성기간이 길수록 감소하였고 플라보노이드는 숙성 2년 와인에서 크게 낮았으나 그 이후에는 차이가 없었다. 특히, 총 페놀과 안토시아닌은 유의성 있는 함량 차이를 보였다. 탄닌의 중합도와 축합된 탄닌의 함량도 숙성기간에 따라 감소하는 경향을 나타내었으나 유의성은 없었다.
- 이는 대조군인 포도와인(CS)의 활성(83%)보다 약간 낮은 결과로 머루와인의 항산화 활성이 포도와인의 활성과 크게 차이가 없음을 나타낸다. 머루와인 내 페놀 화합물의 종류별 함량과 항산화 활성의 상관관계를 회기 분석한 결과, 총 페놀, 플라보노이드, 안토시아닌, 탄닌의 상관계수(r2)가 각각 0.7625, 0.7005, 0.1136, 0.9189로 나타났다. 이러한 결과는 탄닌 함량이 머루와인의 항산화 활성과 강하게 연관되어 있음을 나타낸다.
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