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문제 정의
- 본 연구는 주식으로 소비되는 곡류와 그 부산물의 생리적 활성 연구로서 노화와 당뇨병의 저해에 대한 연관성을 탐색하였다. 다양한 농도의 메탄올과 클로르포름으로 보리, 미강, 율무를 추출하여 항산화능과 포도당/지방산 대사를 측정하였다.
- 본 연구에서는 율무, 보리, 미강을 유기용매로 추출한 추출물의 항산화능을 측정하고, 분화된 지방세포에서 세포 내포도당 및 지방산의 유입과 대사 조절에 대한 영향을 분석하여 곡류 추출물이 포도당/지방산 대사에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 용액을 필터로 여과한 후, 37℃에서 측정한다. 20 ㎖의 시료과 980 ㎖의 ABTS 용액을 10 min간 반응시키면서 O.D.를 측정한 후 항산화능을 측정하였다. DPPH radical과 ABTS radical의 소거능은 항산화능은 아래와 같은 공식에 의하여 구하였다(Brand-Williams 등 1995).
- DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical) 소거능력은 spectrophotometer를 이용해 측정하였다. 추출물 시료를 준비한 후, 517 ㎚에서 0.
- Vitamin C Equivalent Antioxidant Capacity(VCEAC)는 vitamin C 표준용액을 준비하여 DPPH와 ABTS에 대한 항산화능을 측정하고 표준 회기곡선을 구한 후 각 곡류 추출물 100 ㎎/ 100 ㎖에서 항산화능을 측정하여 그에 대비하는 vitamin C의 농도(X ㎖/100 ㎖)를 계산한다.
- 각 추출물을 48시간 동안 처리한 후 Trizol로 RNA를 추출하고 cDNA synthesis kit(Invitrogen)을 이용하여 cDNA를 합성한다. 유전자 발현은 각 유전자에 대한 primer와 SYBR Green Master mix(Applied Biosystem)을 이용하여 7300 Real-Time PCR system(Applied Biosystem)으로 측정한다(Park 등 2008).
- 간세포인 HepG2 세포를 배양한 후 각 추출물 2,000 ㎍/㎖ 농도의 시료를 처리하여 항산화능을 측정하였다. 양성 대조 군으로 10 ㎛의 quercetin을 처리하여 비교하였을 때 80% 메탄올로 추출된 율무와 미강에서 유의적으로 높은 항산화능을 나타내었다.
- 본 연구는 주식으로 소비되는 곡류와 그 부산물의 생리적 활성 연구로서 노화와 당뇨병의 저해에 대한 연관성을 탐색하였다. 다양한 농도의 메탄올과 클로르포름으로 보리, 미강, 율무를 추출하여 항산화능과 포도당/지방산 대사를 측정하였다. 일부 추출물의 항산화능은 잘 알려진 항산화물질인 비타민 C에 비교했을 때 낮으나 유의적인 효능을 보였으며 세포에서 항산화능을 측정하였을 때 quercetin에 비해 낮지만 유의적인 효능이 세포에서도 관찰되었다.
- 율무, 보리, 미강을 10%, 80% 메탄올, 클로로포름 : 메탄올 (2 : 1)로 각각 추출하고, 추출물에 의한 활성산소 제거능의 생리활성을 측정하였다. 먼저 ABTS에 대한 free radical 소거능으로 항산화능을 측정하였다. 보리, 미강, 율무 모두 80% 메탄올로 추출한 샘플에서 가장 높은 항산화능을 나타내었으며, 추출물의 농도가 증가함에 따라 항산화능이 증가함을 발견할 수 있었다.
- 7의 값을 나타내도록 DPPH 용액을 맞춰 놓았다. 시료 0.1 ㎖와 DPPH 용액 2.9 ㎖를 섞은 뒤 30 min 간암반응시키고 표준물질의 O.D.에 대한 농도의 표준 회기곡선을 구한 뒤 시료의 항산화능을 백분율로 측정하였다(van den Berg 등 1999).
- 이후 1 ㎍/㎖ 인슐린을 포함한 FBS/DMEM에서 2일 동안 배양한다. 율무, 보리, 미강을 10% 메탄올, 80% 메탄올, 클로로포름 : 메탄올(2 : 1)로 각각 추출한후 동결 건조한 분말을 dimethylsulfoxide(DMSO)에 용해하여 100 ㎍/㎖ 농도의 FBS/DMEM으로 48시간 동안 분화된 3T3-L1 세포에 처리하였다.
- 율무, 보리, 미강을 10%, 80% 메탄올, 클로로포름 : 메탄올 (2 : 1)로 각각 추출하고, 추출물에 의한 활성산소 제거능의 생리활성을 측정하였다. 먼저 ABTS에 대한 free radical 소거능으로 항산화능을 측정하였다.
- 지방세포인 3T3-L1 세포를 분화시킨 후 각 추출물을 첨가 하여 포도당/지방산 유입 및 대사에 관련된 유전자 발현 조절에 대한 영향을 관찰하였다. 포도당의 세포 내 유입에 관여하는 glucose transporter(GLUT) 1은 미강 메탄올 10%, 율무 메탄올 80%, 보리 클로로포름 : 메탄올(2 : 1) 추출물에 의해 발현이 감소되었고 다른 포도당 유입 관련 단백질인 GLUT4는미강 메탄올 10%, 율무 메탄올 80%, 보리 메탄올 80%, 율무와 보리 클로로포름 : 메탄올(2 : 1) 추출물에 의해 유전자발현이 감소하였다.
대상 데이터
- 율무, 미강, 찰보리는 농협 하나로 마트에서 구입하였고, 실험에 사용된 시약 및 표준품은 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하여 사용하였다. 분쇄한 율무(adlay), 찰보리(barley), 미강(rice bran) 10 g을 10% 메탄올(Me10), 80% 메탄올(Me80), 클로로포름과 메탄올 혼합용매(2 : 1)(Ch : Me) 100 ㎖로 각각 실온에서 12시간 추출한 후 상등액을 동결건조하여 본 실험에 사용하였다.
- 율무, 미강, 찰보리는 농협 하나로 마트에서 구입하였고, 실험에 사용된 시약 및 표준품은 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하여 사용하였다. 분쇄한 율무(adlay), 찰보리(barley), 미강(rice bran) 10 g을 10% 메탄올(Me10), 80% 메탄올(Me80), 클로로포름과 메탄올 혼합용매(2 : 1)(Ch : Me) 100 ㎖로 각각 실온에서 12시간 추출한 후 상등액을 동결건조하여 본 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 분석 결과에 대한 통계 분석은 Prizm 3.0(GraphPad Software)을 이용하여 평균, 표준편차, t-test를 수행하였다. p<0.
성능/효과
- 하지만 나머지 그룹에서는 거의 세포 내 항산 화능을 나타내지 않았다. 10 ㎛의 quercetin과 같은 정도의 항산화능을 나타내기 위해서는 미강 메탄올 80% 추출물은 1,097 ㎍/㎖ 또는 율무 메탄올 80% 추출물 1,058 ㎍/㎖ 정도의 고농도가 요구됨을 알 수 있었다. 클로로포름 : 메탄올 추출물의 경우 세포 항산화능이 나타나지 않았는데, 이는 지용성 성분의 용해도가 원인일 것으로 사료된다(Table 5).
- 이 결과를 항산화 효과의 표준물질인 비타민 C와의 비교한 상대적인 소거능(Vitamin C Equivalent Antioxidant Capacity; VCEAC)으로 비교 및 분석하면 Table 4와 같다. 그러나 모든 시료에서 현저히 높은 VCEAC는 관찰되지 않았으며, 메탄올 80% 추출물에서 메탄올 10% 추출물이나 클로로포름 : 메탄올 추출물보다 항산화 활성이 더 높게 나타났다. 보리에서 메탄올에 의해 추출된 폴리페놀은 약 30% 증가된 TBA 항산화능을 나타내는 연구결과가 보고되고 있어(Seog 등 2002) 메탄올 80% 추출물에서 관찰된 상대적으로 높은 항산화능은 폴리페놀 류의 배당체에 기인하는 것으로 추측된다.
- 먼저 ABTS에 대한 free radical 소거능으로 항산화능을 측정하였다. 보리, 미강, 율무 모두 80% 메탄올로 추출한 샘플에서 가장 높은 항산화능을 나타내었으며, 추출물의 농도가 증가함에 따라 항산화능이 증가함을 발견할 수 있었다. 이때 보리 = 미강 > 율무 순으로 활성이 나타났으나(Table 2) Ch : Me 추출물에서는 항산화 활성이 나타나지 않았는데(data not shown).
- 본 연구에서 관찰된 곡류 추출물에 의해 PPARγ 활성화의 영향을 받는 유전자인 CD36와 aP2가 일부 추출물에 의해 발현이 증가되는 결과는 혈중 지방산 감소의 가능성을 제시하고 있다.
- 일부 추출물의 항산화능은 잘 알려진 항산화물질인 비타민 C에 비교했을 때 낮으나 유의적인 효능을 보였으며 세포에서 항산화능을 측정하였을 때 quercetin에 비해 낮지만 유의적인 효능이 세포에서도 관찰되었다. 분화된 지방세포 3T3-L1에서 일부 추출물의 처리는 포도당 유입체인 GLUT1과 GLUT4의 유전자 발현을 감소시켰으며, PDK4의 발현을 증가시켜 포도당의 유입의 저해와 해당과정의 저해를 초래할 것으로 예상된다. 한편, 지방산 유입 및 대사 유전자인 CD36 와 aP2의 발현이 증가되었다는 사실은 지방세포 내 지방산의 유입이 증가되어 지방세포의 성숙에 추출물이 기여한다는 증거를 보여주고 있다.
- 다양한 농도의 메탄올과 클로르포름으로 보리, 미강, 율무를 추출하여 항산화능과 포도당/지방산 대사를 측정하였다. 일부 추출물의 항산화능은 잘 알려진 항산화물질인 비타민 C에 비교했을 때 낮으나 유의적인 효능을 보였으며 세포에서 항산화능을 측정하였을 때 quercetin에 비해 낮지만 유의적인 효능이 세포에서도 관찰되었다. 분화된 지방세포 3T3-L1에서 일부 추출물의 처리는 포도당 유입체인 GLUT1과 GLUT4의 유전자 발현을 감소시켰으며, PDK4의 발현을 증가시켜 포도당의 유입의 저해와 해당과정의 저해를 초래할 것으로 예상된다.
- 지방세포인 3T3-L1 세포를 분화시킨 후 각 추출물을 첨가 하여 포도당/지방산 유입 및 대사에 관련된 유전자 발현 조절에 대한 영향을 관찰하였다. 포도당의 세포 내 유입에 관여하는 glucose transporter(GLUT) 1은 미강 메탄올 10%, 율무 메탄올 80%, 보리 클로로포름 : 메탄올(2 : 1) 추출물에 의해 발현이 감소되었고 다른 포도당 유입 관련 단백질인 GLUT4는미강 메탄올 10%, 율무 메탄올 80%, 보리 메탄올 80%, 율무와 보리 클로로포름 : 메탄올(2 : 1) 추출물에 의해 유전자발현이 감소하였다. 이는 일부 추출물에 의해 포도당 transporter의발현이 감소되어 포도당 유입이 감소된다는 것을 의미한다.
- 이 원인은 ABTS 항산화능 측정방법이 수용성 용액을 사용하기 때문에 유기용매 추출물의 용해도가 낮은 원인 때문으로 사료된다. 항산화능 측정의 또 다른 대표적 분석 방법인 DPPH 분석법을 이용하여 추출 물의free radical 소거능을 측정하였을 때에도 보리, 미강, 율무 모두 80% methanol로 추출한 샘플에서 가장 높은 항산화능을 나타내었다. 이 경우에는 보리 > 미강 > 율무 순으로 활성이 나타났다(Table 3).
- 이는 일부 추출물에 의해 포도당 transporter의발현이 감소되어 포도당 유입이 감소된다는 것을 의미한다. 해당과정에서 피루브산이 acetyl CoA로 변화하는 데 관여하는 pyruvate dehydrogenase를 조절하는 pyruvate dehydrogenase kinase 4(PDK4)가 미강 메탄올 80%과 미강 클로로포름 : 메탄올(2 : 1) 추출물에 의해 유전자 발현이 증가함으로써 포도당의 해당 과정이 저해된다는 것을 알 수 있었다(Table 6). PDK4 의 경우, 세포 내 지질 증가에 따라 발현이 조절되어 해당과정과 지방산 산화 정도를 결정하는 효소로 유기용매에 의해 추출된 지용성 성분에 의해 발현이 증가되는 것으로 사료된다.
후속연구
- 결론적으로 곡류 추출물에서 나타나는 항산화 효과는 활성산소의 감소를 초래하여 세포의 노화를 예방할 수 있을 것으로 예상한다. 또한, 지방세포에서 나타나는 포도당 유입감소 및 지방산 유입증가는 혈중 지방산의 감소를 초래하여 성인성 만성질환의 예방에 기여할 수 있는 영양학적 효능을 가질 수 있을 것으로 사료된다
- 결론적으로 곡류 추출물에서 나타나는 항산화 효과는 활성산소의 감소를 초래하여 세포의 노화를 예방할 수 있을 것으로 예상한다. 또한, 지방세포에서 나타나는 포도당 유입감소 및 지방산 유입증가는 혈중 지방산의 감소를 초래하여 성인성 만성질환의 예방에 기여할 수 있는 영양학적 효능을 가질 수 있을 것으로 사료된다
- 또한 율무, 메밀, 보리의 섭취가 비만에 기인하여 발병하는 성인성 만성 질환의 여러 위험인자들을 억제됨이 최근 l보고되었다(Son 등 2008). 이와 같이 대사성 질환의 원인으로 알려진 비만이 곡류 및 곡류 추출물의 섭취에 의해 예방된다는 사실에 비추어 볼 때 잡곡류 성분의 생리활성을 이용하여 비만에 대한 영양학적 효능을 갖는 기능성 식품으로서의 개발이 가능할 것이다.
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