이정아
(Bio-center, Gyeonggido Business and Science Accelerator)
,
박영진
(Bio-center, Gyeonggido Business and Science Accelerator)
,
정원식
(Bio-center, Gyeonggido Business and Science Accelerator)
,
홍성수
(Bio-center, Gyeonggido Business and Science Accelerator)
,
안은경
(Bio-center, Gyeonggido Business and Science Accelerator)
본 연구에서는 초과 에탄올 추출물을 이용하여 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포로의 분화 연구를 통해 항비만 활성을 확인하고자 하였다. 초과 에탄올 추출물에 의한 지방세포 분화 억제 활성 및 지방형성에 미치는 영향을 확인하기 위해 3T3-L1 지방전구세포에 분화를 유도하면서 추출물을 농도별로 처리하였고, 그 결과 초과 에탄올 추출물은 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 농도에 의존적으로 감소시켰다. 이 같은 활성에 대한 작용기전을 알아보기 위해 지방세포 분화에 중요한 역할을 담당하고 있는 peroxisome proliferator-activated receptor ${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$)와 CCAAT-enhancer-binding protein${\alpha}$ ($C/EBP{\alpha}$), 그리고 지방세포 분화에 관여하는 유전자들의 활성을 확인해 보았다. 실험 결과 초과 에탄올 추출물은 $PPAR{\gamma}$와 $C/EBP{\alpha}$의 유전자 및 단백질 발현을 유의적으로 감소시켰고 지방세포 분화에 관여하는 adipogenesis marker 유전자들의 발현을 억제 시켰다. 따라서 초과 에탄올 추출물은 지방분화 및 adipogenesis 억제 활성을 통해 항비만 소재로의 가능성이 있을 것으로 기대한다.
본 연구에서는 초과 에탄올 추출물을 이용하여 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포로의 분화 연구를 통해 항비만 활성을 확인하고자 하였다. 초과 에탄올 추출물에 의한 지방세포 분화 억제 활성 및 지방형성에 미치는 영향을 확인하기 위해 3T3-L1 지방전구세포에 분화를 유도하면서 추출물을 농도별로 처리하였고, 그 결과 초과 에탄올 추출물은 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 농도에 의존적으로 감소시켰다. 이 같은 활성에 대한 작용기전을 알아보기 위해 지방세포 분화에 중요한 역할을 담당하고 있는 peroxisome proliferator-activated receptor ${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$)와 CCAAT-enhancer-binding protein ${\alpha}$ ($C/EBP{\alpha}$), 그리고 지방세포 분화에 관여하는 유전자들의 활성을 확인해 보았다. 실험 결과 초과 에탄올 추출물은 $PPAR{\gamma}$와 $C/EBP{\alpha}$의 유전자 및 단백질 발현을 유의적으로 감소시켰고 지방세포 분화에 관여하는 adipogenesis marker 유전자들의 발현을 억제 시켰다. 따라서 초과 에탄올 추출물은 지방분화 및 adipogenesis 억제 활성을 통해 항비만 소재로의 가능성이 있을 것으로 기대한다.
Amomum tsao-ko used as a traditional oriental herbal medicine, is indigenous to several Asia countries. In this study, we investigated anti-obesity activity of the ethanol extract of Amomum Taso-ko (A. tsao-ko). The ethanol extract of A. tsao-ko inhibited adipocyte differentiation using Oil Red O as...
Amomum tsao-ko used as a traditional oriental herbal medicine, is indigenous to several Asia countries. In this study, we investigated anti-obesity activity of the ethanol extract of Amomum Taso-ko (A. tsao-ko). The ethanol extract of A. tsao-ko inhibited adipocyte differentiation using Oil Red O assay in 3T3-L1 cells. Inhibitory effect of the ethanol extract of A. tsao-ko on adipogenesis was modulated by down-regulation adipogenic transcriptional factor such as peroxisome proliferator-activated receptor ${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$), CCAAT-enhancer-binding protein ${\alpha}$ ($C/EBP{\alpha}$) and suppressed expression of fatty acid synthase, aP2, and resistin. We demonstrated that A. tsao-ko significantly inhibited adipogenesis and reduced $PPAR{\gamma}$ and $C/EBP{\alpha}$ expression in a dose-dependent manner. These results suggest that A. tsao-ko has an anti-obesity effect by inhibition of adipogenic transcription factor and adipocyte-specific genes in 3T3-L1 cells.
Amomum tsao-ko used as a traditional oriental herbal medicine, is indigenous to several Asia countries. In this study, we investigated anti-obesity activity of the ethanol extract of Amomum Taso-ko (A. tsao-ko). The ethanol extract of A. tsao-ko inhibited adipocyte differentiation using Oil Red O assay in 3T3-L1 cells. Inhibitory effect of the ethanol extract of A. tsao-ko on adipogenesis was modulated by down-regulation adipogenic transcriptional factor such as peroxisome proliferator-activated receptor ${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$), CCAAT-enhancer-binding protein ${\alpha}$ ($C/EBP{\alpha}$) and suppressed expression of fatty acid synthase, aP2, and resistin. We demonstrated that A. tsao-ko significantly inhibited adipogenesis and reduced $PPAR{\gamma}$ and $C/EBP{\alpha}$ expression in a dose-dependent manner. These results suggest that A. tsao-ko has an anti-obesity effect by inhibition of adipogenic transcription factor and adipocyte-specific genes in 3T3-L1 cells.
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문제 정의
초과를 이용한 항비만 관련 선행연구로는 lipase activity 억제 활성 연구와 동물실험을 통해 초과 메탄올 추출물과 분획물의 체지방 감소 효과를 확인한 연구 결과가 있다(Yu 등, 2010; Changhyun과 Uhee 2012). 그러나 아직까지 초과 에탄올 추출물을 이용한 adipogenesis 억제 활성이나 그에 관한 정확한 작용기전 연구가 없어 본 연구자들은 3T3-L1 지방전구세포의adipogenesis 억제 활성을 통해 초과 에탄올 추출물의 항비만효과를 밝히고자 하였다. 본 연구를 통해 초과 에탄올 추출물은 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 감소시키고 지방세포 분화에 관여하는 adipogenesis marker로 알려진 Fas, aP2, 그리고 resistin의 발현 억제를 통해 지방세포로의 분화를 억제한다는 것을 증명하였다.
그러나 아직까지 초과 에탄올 추출물의 지방세포 분화 억제 활성이나 지방세포 분화 조절에 관여하는 유전자 발현및 작용 메커니즘에 관한 연구는 보고되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 초과 에탄올 추출물을 이용하여 3T3-L1 지방세포 분화 억제 활성 및 지방분화와 관련 있는 유전자들의 조절에 어떤 영향을 미치는지를 평가하고자 하였다.
제안 방법
초과 에탄올 추출물의 3T3-L1 지방전구세포에서의 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 96 well plate에 5×103/well 세포수로 분주하여 배양한 후 초과 에탄올 추출물을 각각 농도별(0, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL)로 24시간 동안 처리하여 실험을 진행하였다. 그 결과, Fig 1에서 보여주는 바와 같이 초과 에탄올 추출물은 100 μg/mL 처리농도까지 세포독성이 나타나지 않았다.
또한 resistin은 지방세포에서 분비되는 adipokine으로 비만과 인슐린 저항성에 관여하며 포도당과 지질대사 유지에 중요한 역할을 하는 호르몬이다(Steppan등, 2001; Rajala 등, 2003; Banerjee 등, 2004). 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 유도하면서 초과 에탄올 추출물을 25, 50, 100 μg/mL 농도로 처리하여 8일 동안 분화시킨 후 real-time PCR을 통해 Fas, aP2와 resistin의 mRNA 발현량을 확인하였다. 그 결과, 초과 에탄올 추출물 처리에 의한 Fas, aP2와 resistin의 mRNA 발현량이 대조군에 비해 농도의존적으로 감소하였으며 50 μg/mL에서는 60 % 이상, 100 μg/mL에서는 90 % 이상의감소 효과를 확인 할 수 있었다(Figs.
그 후 2일마다 10 % FBS DMEM 배양액으로 교체하여 8일 동안 분화를 유도하였다. 지방세포 분화를 유도하는 동안 각 배양액에 초과 에탄올 추출물을 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리하였다.
초과 에탄올 추출물에 의한 지방세포형성(adipogenesis) 억제 효과가 어떠한 작용기전에 의해 유도되는지 확인하기 위해 지방세포 분화 억제 실험방법과 마찬가지로 초과 에탄올 추출물을 농도별로 8일 동안 처리한 후, PPARγ와 C/EBPα의 유전자와 단백질 발현량을 확인해 보았다. 지방전구세포에서 지방세포로 분화되는 과정에는 여러 종류의 adipogenic factor들이 관여하고 지방세포 특이적 유전자들의 발현이 유도된다고 알려져 있다(Cowherd 등, 1999; Rosen 등, 2000).
초과 에탄올 추출물의 지방세포 분화 억제 활성을 확인하기 위해 3T3-L1 지방전구세포에 MDI (0.5 mM IBMX, 1 μM dexametasone, 1 μg/mL insulin)를 처리하여 지방세포로의 분화를 유도시킨 후 분화를 유도하는 8일 동안 세포에 초과 에탄올 추출물을 25, 50, 100 μg/mL 농도로 처리하고 Oil Red O assay를 수행하였다. Oil Red O를 통해 염색된 지방구는 1차적으로 현미경 관찰을 통해 확인하였고 지방구의 염색액은 4% NP-40가 첨가된 isopropyl alcohol 용액으로 추출하여 510 nm에서 흡광도를 측정하여 fold 값으로 나타내었다.
대상 데이터
3T3-L1 (CL-173) 세포는 미국 세포 은행인 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 구입하였고 마우스 지방전구세포인 3T3-L1 세포는 10 % bovine calf serum과 trypsin-EDTA 및 penicillin-streptomycin (Invitrogen, Gaithersburg, MD, USA)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), (ATCC, Manassas, VA, USA) 배지를 넣고 5% CO2, 37oC의 조건하에서 배양하였다. 3T3-L1 지방전구세포 분화 유도를 위해 24 well plate에 5×104/well의 세포수로 분주하고 100 % confluency 상태에서 48시간 더 유지시켰다.
본 실험에 사용된 초과(Amomum tsao-ko)는 2012년 2월 서울 경동시장에서 구입하여 형태학적 평가를 통하여 동정하였다. 초과 표본(G47)은 경기과학기술진흥원 천연물연구팀 표본실에 보관하였다.
지방세포 분화 억제 활성 측정방법과 동일한 방법으로 8일 동안 분화된 3T3-L1 세포는 TRIzol reagent (Invitrogen, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 추출 된 RNA는 SuperScript® III First-Strand Synthesis System을 이용하여 cDNA를 합성한 후 SYBR green과 Table 1에 나타낸 PPARγ, C/EBPα, Fas, aP2, resistin primer를 이용하여 real-time PCR을 수행하였고 대조군 유전자로는 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 사용하였다. Bio-Rad MyiQ program (Bio-Rad, Califonia, CA, USA)을 이용하여 형광신호를 정량하였으며 real-time PCR에 사용한 primer sequence는 Table 1에 나타내었다.
데이터처리
본 실험에서 얻은 결과는 평균(mean)과 표준편차(SD, standard deviation)로 표시하였고, 각 실험군과의 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA) 통계 프로그램을 이용하여 분석한 후, p <0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test로 유의성을 검증하였다(*p <0.05; **p <0.01).
이론/모형
초과 에탄올 추출물의 3T3-L1 지방전구세포에서의 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 96 well plate에 5×103/well 세포수로 분주하여 배양한 후 초과 에탄올 추출물을 각각 농도별(0, 12.
초과 에탄올 추출물의 세포독성은 탈수소 효소작용에 의해 노란색의 수용성 기질인 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) tetrazolium을 청자색의 비수용성 MTT formazan 으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하여 간접적으로 세포생존율을 측정하는 MTT assay 방법을 통해 측정하였다. 3T3-L1 세포를 96 well plate에 5×103/well의 개수로 분주하고 24시간 후 초과 에탄올 추출물을 농도별(12.
성능/효과
그 결과 Figs. 4A, B에서 보여주듯이 초과 에탄올 추출물 처리 농도에 따라 PPARγ와 C/EBPα의 유전자 발현이유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 Western blot을 이용하여 초과 에탄올 추출물에 의한 PPARγ와 C/EBPα의단백질 발현량을 측정해 본 결과, 지방세포 분화를 유도한 MDI처리군에서 증가되었던 PPARγ와 C/EBPα의 단백질 발현량이 초과 에탄올 추출물 처리에 의해 감소하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig.
5, 25, 50, 100 μg/mL)로 24시간 동안 처리하여 실험을 진행하였다. 그 결과, Fig 1에서 보여주는 바와 같이 초과 에탄올 추출물은 100 μg/mL 처리농도까지 세포독성이 나타나지 않았다.
3T3-L1 지방전구세포의 분화를 유도하면서 초과 에탄올 추출물을 25, 50, 100 μg/mL 농도로 처리하여 8일 동안 분화시킨 후 real-time PCR을 통해 Fas, aP2와 resistin의 mRNA 발현량을 확인하였다. 그 결과, 초과 에탄올 추출물 처리에 의한 Fas, aP2와 resistin의 mRNA 발현량이 대조군에 비해 농도의존적으로 감소하였으며 50 μg/mL에서는 60 % 이상, 100 μg/mL에서는 90 % 이상의감소 효과를 확인 할 수 있었다(Figs. 4C, D, E).
4A, B에서 보여주듯이 초과 에탄올 추출물 처리 농도에 따라 PPARγ와 C/EBPα의 유전자 발현이유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 Western blot을 이용하여 초과 에탄올 추출물에 의한 PPARγ와 C/EBPα의단백질 발현량을 측정해 본 결과, 지방세포 분화를 유도한 MDI처리군에서 증가되었던 PPARγ와 C/EBPα의 단백질 발현량이 초과 에탄올 추출물 처리에 의해 감소하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 3).
Fig 2B는 염색된 지방구를 현미경으로 관찰한 것으로, 분화가 유도된 대조군에비해 염색된 지방구의 수가 초과 에탄올 추출물의 농도에 따라 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 본 결과를 통해 초과 에탄올 추출물이 농도 의존적으로 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.
그러나 아직까지 초과 에탄올 추출물을 이용한 adipogenesis 억제 활성이나 그에 관한 정확한 작용기전 연구가 없어 본 연구자들은 3T3-L1 지방전구세포의adipogenesis 억제 활성을 통해 초과 에탄올 추출물의 항비만효과를 밝히고자 하였다. 본 연구를 통해 초과 에탄올 추출물은 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 감소시키고 지방세포 분화에 관여하는 adipogenesis marker로 알려진 Fas, aP2, 그리고 resistin의 발현 억제를 통해 지방세포로의 분화를 억제한다는 것을 증명하였다. 따라서 본 연구결과는 초과 에탄올 추출물이 3T3-L1지방전구세포가 분화하는 동안 PPARγ와 그의 조절인자들의 조절을 통해 지방분화 억제 활성을 갖는다는 것을 보여주고 있다.
앞선 실험에서 보여주듯이 초과 에탄올 추출물은 PPARγ와 C/EBPα 억제를 통해 지방세포 분화 억제 활성을 보였다. Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs)는 지방산합성, 이동, 저장과 에너지 소비와 관련된 유전자의 전사를 매개하는데 이와 관련된 adipogenic marker로 Fas, aP2 등이 있다.
특히 100 μg/mL 처리 농도에서는 분화를 유도하지 않은 수준까지 단백질 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 초과 에탄올 추출물에 의한 지방세포 분화 억제 활성이 지방세포 분화 과정에서 중요한 역할을 담당하고있는 PPARγ와 C/EBPα의 발현 저해를 통한 것임을 보여주었다.
Oil Red O를 통해 염색된 지방구는 1차적으로 현미경 관찰을 통해 확인하였고 지방구의 염색액은 4% NP-40가 첨가된 isopropyl alcohol 용액으로 추출하여 510 nm에서 흡광도를 측정하여 fold 값으로 나타내었다. 초과 에탄올 추출물의 지방세포 분화 억제 활성을 측정한 결과, 농도 의존적으로 지방세포 분화가 억제되는 것을 확인할 수 있었고, 50 μg/mL 농도에서는 34.3 %, 100 μg/mL 농도에서는 80.7 %의 지방세포로의 분화 억제효과를 나타냈다(Fig 2A). Fig 2B는 염색된 지방구를 현미경으로 관찰한 것으로, 분화가 유도된 대조군에비해 염색된 지방구의 수가 초과 에탄올 추출물의 농도에 따라 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
본 연구를 통해 초과 에탄올 추출물은 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 감소시키고 지방세포 분화에 관여하는 adipogenesis marker로 알려진 Fas, aP2, 그리고 resistin의 발현 억제를 통해 지방세포로의 분화를 억제한다는 것을 증명하였다. 따라서 본 연구결과는 초과 에탄올 추출물이 3T3-L1지방전구세포가 분화하는 동안 PPARγ와 그의 조절인자들의 조절을 통해 지방분화 억제 활성을 갖는다는 것을 보여주고 있다.그러나 항비만 활성을 나타내는 여러 가지 반응경로가 있으므로 다른 작용기전 관련 신호전달체계 및 단백질 활성 관한 연구는 좀 더 진행되어야 할 것으로 사료되며, 본 연구결과는 초과 에탄올 추출물의 항비만 소재로서의 활용에 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 기대한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
3T3-L1의 역할은 무엇인가?
지방전구세포인 3T3-L1은 지방세포를 형성하는 다양한 전사인자와 호르몬에 의해 세포 내 중성지방을 축적한다. Peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ)와 CCAAT-enhancer-binding protein α (C/EBPα)는 지방세포형성(adipogenesis) 과정에서 중추적인 역할을 담당하는 전사인자로 알려져 있다 (Darlington등, 1998; Rosen 등, 2001; Ahn 등, 2012).
비만의 원인은 무엇인가?
비만은 체내에 체지방이 과잉 축적되어 있는 상태를 말하며 전세계적으로 비만 환자의 급증과 더불어 유병률도 꾸준히 증가하고 있다. 비만의 원인으로는 생활환경의 변화와 서구화된 식습관, 내분비 장애, 유전적 요인 등을 들 수 있다. 또한 비만은 비만 자체로도 심각한 문제가 되지만 고혈압, 제 2형 당뇨, 고지혈증, 관절염 등과 같은 만성 퇴행성 질환을 유발하는 주요 원인으로 알려지면서 심각한 질환으로 인식되고 있다(Albu 등, 1997; Grundy 등, 1998; Visscher과 Seidell 2001; Leung 등, 2003; Haslam 2005).
초과 에탄올 추출물의 항비만효과의 작용 기전은 무엇인가?
그러나 아직까지 초과 에탄올 추출물을 이용한 adipogenesis 억제 활성이나 그에 관한 정확한 작용기전 연구가 없어 본 연구자들은 3T3-L1 지방전구세포의adipogenesis 억제 활성을 통해 초과 에탄올 추출물의 항비만효과를 밝히고자 하였다. 본 연구를 통해 초과 에탄올 추출물은 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 감소시키고 지방세포 분화에 관여하는 adipogenesis marker로 알려진 Fas, aP2, 그리고 resistin의 발현 억제를 통해 지방세포로의 분화를 억제한다는 것을 증명하였다. 따라서 본 연구결과는 초과 에탄올 추출물이 3T3-L1지방전구세포가 분화하는 동안 PPARγ와 그의 조절인자들의 조절을 통해 지방분화 억제 활성을 갖는다는 것을 보여주고 있다.
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