선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 최근 일부 외국 제조회사나 특허 전문기업들이 우리나라 제조업체에 지나친 특허료를 징수하고, 지적소유권 분쟁을 일으키는 사례가 많으며, 이러한 상황에서 우리 고유의 농업 원천기술의 확보는 매우 중요하다. 본 연구에서는 국내 기후와 환경에 적합하고 미생물농약으로 사용할 수 있는 새로운 항 진균물질 생산 균주를 선별하고 동정 하였으며 , 새로운 미 생물농약으로서 의 가능성에 대한 기초자료를 확보하고자 하였다.
제안 방법
- DY5 균주는 푸른곰팡이병균, 시들음병균, 탄저병균, 균핵병균, 잎집 무늬 마름 병균에 강한 생장 억제효괴를 나타냈으며, 위상차현미경과 SEM으로 관찰한 결괴-, 티원형의 내성포자(endospo)를 형성하는 그람양성 긴균임을 확인하였디, . API 50 CIIB test의 산생성능, 형태적 및 생화학적 실험결괴를 분석하여 균주를 동정한 결괴-, DY5 균주는 Bacillus circukms와 Paenibacillus polymyxcfe 가장 가까운 근연성을 나티내었디. 세포내 지방산 조성 분석을 통하여 동정한 결괴-, DY5 균주는 Paenibacillus 속에 속하는 균주로 확인되 었디' DY5의 16SrRNA 염기서열은 Paenibacillus polymyxa 균주와 98% 이상의 유사성을 나타내었다.
- 시행하였다. API kit 시험을 위하여 BHI 액체배지에 균주를 접종한 후 35℃에서 18~24시간 배양한 배양액을 사용하였으며, APi 50 CHB kit와 API 20E kit의 사용은 제조사의 표준적인 실험방법에 따라 실험하였다. 실험 결과는 30℃에서 2일간 배양한 후 판독하였다.
- Paenibacillus polymyxa DY5 균주가 생산하는 항균물질을 생물농약으로 사용할 수 있는 지를 알아보기 위하여 느티리버섯 푸른곰핑-이 병을 유발하는 Trichodemia koningii 균을 사용하여 적용실험을 하였디, .
- 50/.d 떨어뜨린 다음 27℃에서 4S시간 배양한 후, 생장 억제대(투명환)의 직경을 측정하여 항균물질의 활성을 조사하였다.
- 각각의 buiier 50ul와 항균물질이 포함된 배양여과액 50ul 를 혼합한 디음 30℃에서 30분 반응시킨 후 디스크 확산법으로 생장억제대의 직경을 측정하여 pH에 대한 안정성을 조사하였디.
- 균사체를 생장시킨 병 배지를 15℃에서 14일간 배양하여, 균사체가 병 배지의 3/4 이상으로 자랐을 때 균 긁기를 시행하고, 상대습도가 90% 이상이고 통기가 잘 되는 15℃ 배양기에서 배양하여 자실체 형성에 미치는 영향을 조사하여, Paenibacillus polymyxa DY5 균주가 생산하는 항균물질을 생물농약으로 사용할 수 있는지를 알아보았다.
- 대암산 용늪 토양게서 직물병원성 진균에 대하여 항균 활성을 갖는 새로운 균주 DY5를 분리하고, 동정하였다. DY5 균주는 푸른곰팡이병균, 시들음병균, 탄저병균, 균핵병균, 잎집 무늬 마름 병균에 강한 생장 억제효괴를 나타냈으며, 위상차현미경과 SEM으로 관찰한 결괴-, 티원형의 내성포자(endospo)를 형성하는 그람양성 긴균임을 확인하였디, .
- 또한, 항균물질 생산균주를 동정하기 위하여 당으로부터 산생성능을 알아보는 API 50 CHB test를 시행하였다. API 50 CHB test를 시행하여 49 종류의 당으로부터 산생성능을 조사한 결과 L-arabinose 등 24 종의 당에는 양성반응을 나타냈으나, erythritol 등 25 종의 당에는 음성반응을 나타냈다(Table 3).
- 생화학적 특성을 알아보기 위하여 API 20E kit(Bio Merieux Co, France) 시험과 API 50 CHB kit(Bio Merieux Co, France) 시험을 시행하였다. API kit 시험을 위하여 BHI 액체배지에 균주를 접종한 후 35℃에서 18~24시간 배양한 배양액을 사용하였으며, APi 50 CHB kit와 API 20E kit의 사용은 제조사의 표준적인 실험방법에 따라 실험하였다.
- 선택배지 (penicilline G 4 /zg/inl. polymyxin B sulfate 5 /g/ml)를 이용하여, 항 진균물질을 생산하는 종 11 균주를 분리하였으며 , 이 균주를 DY1에서 DY11 로 명명하였디, . 분리한 11균주 증 DY5 균주가 직물병원균에 대한 생장 억제 효과가 가장 높은 것으로 나타났다.
- 1 ml을 선택배지 (SM: 4 /zg/ml penicillin Q 5 polymixin B sulfhte)에 도말하고 28℃에서 48 시간 배양하였다. 선택배지에서 생장한 각각의 집락을 백금이로 취하여 NB 배지에 1 백금이 접종하여 30℃에서 48시간 배양한 후, 배양액의 일부는 균의 동정에 사용하였고, 남은 일부는 항균 물질생산 여부를 확인하는데 사용하였다.
- 항균물질 생산군-주의 동정은 B&'geys Mamai of Systematic Bacteriology(David and CasteiJiol. 2001)와 Hie Genus BacillusfGordoii et al., 1973)의 분류키를 이용하여 속을결정하였디, . 아울러 16S rRNA 유전자염 기서열 결과와 Reva 등(2001)의 호기성 포자형성 균의 분류키에 따라 균주를동정하였다.
- 항균물질 생산균주의 형태적 특성을 알아보기 위하여 NA 배지에 24시간 배양한 균주를 그람염색 하여 균의 크기, 모양 및 parasporal cystal 형성 등의 형태학적 특성을 조사하였으며, 전자현미경 (SEM; Hitachi S 0570, Japan)을 이용하여 균의 형태를 검경하였다.
- 항균물질의 온도에 대한 안정성을 알아보기 위하여, 항 진균 물질을 10℃에서 60℃까지 10℃간격으로 각각의 온도에서 30분 반응시킨 후, 디스크확산 법으로 생장억제대의 직경을 측정하여 온도에 대한 안정성을 조사하였다.
대상 데이터
- 강원도 양구군에 위치한 대암산 용늪 주변에서 산림이 잘 보존되어 있는 활엽수림의 50 장소를 선정하여, 멸균된 시약 스푼으로 2~5 cm 깊이의 토양을 약 50-100 g 채취하였다. 채취된 토양을 멸균된 비닐봉지에 넣어 Ice box에 보관하여 실험실로 옮겨 4 냉장고에 보관하면서 항균물질을 생산하는 균주를 분리하기 위한 실험재료로 사용하였다.
- 순수 분리된 Paenibacillus polymyxa DY5의 항균활성을 알아보기 위하여 국립농업과학원에서 분양받은 5종의 작물 병원균을 실험 균주로 사용하였다 (Table 1).
- 실험에 사용한 배지는 균 보존배지로 Nutrint agaifNA), Potato dextrose agar(PDA) 배지를 사용하였고, 길 항균 주를 분리하기 위한 배지로 선택배지 (Selestive media)를 사용하였으며, 세균의 증 균용 배지로 Nutrint broth(NB), Brain heart infUsion(BHI), Muller hinton(MH) 배지를, 진균의 증 균용 배지로 Potato dextrose broth(PDB) 배지를 사용하였다.
- 채취하였다. 채취된 토양을 멸균된 비닐봉지에 넣어 Ice box에 보관하여 실험실로 옮겨 4 냉장고에 보관하면서 항균물질을 생산하는 균주를 분리하기 위한 실험재료로 사용하였다.
이론/모형
- , 1973)의 분류키를 이용하여 속을결정하였디, . 아울러 16S rRNA 유전자염 기서열 결과와 Reva 등(2001)의 호기성 포자형성 균의 분류키에 따라 균주를동정하였다.
성능/효과
- 분리한 11균주 증 DY5 균주가 직물병원균에 대한 생장 억제 효과가 가장 높은 것으로 나타났다. DY5 균주를 배양한 후 원심분리하여 얻은 상등 액을 느티리버섯 푸른곰팡이병균 (Trichodemia koningii), 시들음병균(Fusarium oxysponmi\ 탄저 병 균(gloeosporioides\ 균핵 병 균(Sclerotinia sclerotionun), 잎집무늬마름병균(Rhizocnia solani AG- 1(IA)]이 접종된 PDA 평핀배지에 50 "씩 떨어뜨린 후 디스크 확산 법으로 27℃에서 48시간 배양 후, 생장 억제대(투명환)를 조사한 결괴-, DY5 균주는 5종의 진균 생장에 강한 억제력을 나타냈다(Fig. 1).
- 4. Eftcct of temperature on the stability of antiftmgal substance of the isolate DY 5. The antiftmgal activity against Trichoderma koningii was measured after incubation of the antiftmgal sustancc for 30 min at diftcrcrcnt temperatures.
- 시행하였다. API 50 CHB test를 시행하여 49 종류의 당으로부터 산생성능을 조사한 결과 L-arabinose 등 24 종의 당에는 양성반응을 나타냈으나, erythritol 등 25 종의 당에는 음성반응을 나타냈다(Table 3). API 50 CHB te아 결과를 이용하여 균주를 동정한 결과 DY5 균주는 Bacillus circulans 에 89.
- API 50 CHB test를 시행하여 49 종류의 당으로부터 산생성능을 조사한 결과 L-arabinose 등 24 종의 당에는 양성반응을 나타냈으나, erythritol 등 25 종의 당에는 음성반응을 나타냈다(Table 3). API 50 CHB te아 결과를 이용하여 균주를 동정한 결과 DY5 균주는 Bacillus circulans 에 89.6%, Paenibacillus polymyxa 에 98.8%의 유사도를 나타냈다. 장내세균 인지를 알아보기 위하여 API 20E test를 한 결과 ONPG(Ortho-nitro-phenyl-b-D-galacctopyranoside) test, IND(Indol production) test, VP(Vbges - Proskauer) 시험, GEL(Gelatmase) 반응에서는 양성반응을 나타냈으며, ADH(Argine dihydrolase) test, LDC(Lysine decarboxylase) test, ODC(Omithin decarboxylase) test, CIT(Citrate utilization) test, H2S 생성반응, URE(Urase) test, TDA(Tryptophane deaminase) 반응에는 음성반응을 나타내어 (Table 2) DY5 균주는 장내세균이 아닌 것으로 판별되었다.
- DY5 균주는 푸른곰팡이병균, 시들음병균, 탄저병균, 균핵병균, 잎집 무늬 마름 병균에 강한 생장 억제효괴를 나타냈으며, 위상차현미경과 SEM으로 관찰한 결괴-, 티원형의 내성포자(endospo)를 형성하는 그람양성 긴균임을 확인하였디, . API 50 CIIB test의 산생성능, 형태적 및 생화학적 실험결괴를 분석하여 균주를 동정한 결괴-, DY5 균주는 Bacillus circukms와 Paenibacillus polymyxcfe 가장 가까운 근연성을 나티내었디.
- PCR 로 얻은 1, 445 bp의 16S rRNA 유전자염기서 열 (Fig. 3)은 NCBI BLAST 검색 결과 Paenibacillus polymyxa 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열(accession number AY 359632)과 98% 이상의 유사성을 나타내었다. 계통분석 결과 DY5 균주는 P.
- Paenibacillus polymyxa DY5 균주에서 생산되는 항균물질의 온도에 대한 안정성을 조사한 결과 30℃에서 30분 반응시켰을 때 , 최대 활성인 22 mm의 억제 환을 나티냈으며 , 40℃와 50℃에서도 활성이 있는 것으로 나타났디, . 하지만 60℃에서는 전혀 활성이 나타나지 않아(Fig.
- pH에 대한 안정성을 조사한 결과 pll 3, 4, 5 에서는 항진균 활성이 전혀 나티나지 않았으나, pll 6, 7, 8, 9 에서는 30분 동안 반응 시 pll 9에서 23 mm의 최대 억 제 환을 나타낸 것으로 보아(Fig. 5) 이 물질은 호 알칼리성 (Alkalophilic) 물질로 판단된다.
- 3)은 NCBI BLAST 검색 결과 Paenibacillus polymyxa 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열(accession number AY 359632)과 98% 이상의 유사성을 나타내었다. 계통분석 결과 DY5 균주는 P. polymyxa, P. jamilae, P. peoriae, P. kriblbeis와 유연관계가 매우 높은 것으로 나타났다. 이상의 형태 및 생리생화학 시험에 기반 한 분류키 검색(Reva et al, 2001) 등, 계통분류학적 결과를 종합하여 DY5 균주는 기존의 Paenibacillus polymyxa DSM36 균주와 98% 이상의 유사성을 나타내는 새로운 균주로 판명되었다.
- 76% 함유하고 있음을 확인하였다(Table 4). 균주 내 지방산 조성 분석결과 분리균주 DY5는 다른 Gram 양성 균들의 특징인 iso-type과 ante iso-type 지방산이 주요 구성성분이었으며,ante iso-type이 iso-typee] 비해 큰 비중을 차지하고 있음을 확인하였다. 이들 지방산 조성을 MIDI library에서 동정한 결과 DY5 균주는 Paenibacillus 속 (genus)에 속하는 균주로 확인되었다.
- 그람염색 반응을 통하여 그람양^균으로 확인되었으며(Fig. 2A), 혐기성 조건 성장 여부, egg-yolk lecithinase 활성도, hemolysis 여부, 운동성, oxidase 활성도 반응 등에서 모두 음성으로 나타났고(Table 2), 위상차현미경 및 SEM으로 검경한 결과 타원형의 내성포자(endospore)를 형성하는 간균임을 확인하였다(Fig. 2B, 2C).
- 단백질 분해효소에 대한 영향을 조사한 결과 Paenibacillus polymyxa DY5 가 생산하는 항균물질은 proteinase KM] 용해농도가 25 ug/ml. 50 ug/ml.
- polymyxin B sulfate 5 /g/ml)를 이용하여, 항 진균물질을 생산하는 종 11 균주를 분리하였으며 , 이 균주를 DY1에서 DY11 로 명명하였디, . 분리한 11균주 증 DY5 균주가 직물병원균에 대한 생장 억제 효과가 가장 높은 것으로 나타났다. DY5 균주를 배양한 후 원심분리하여 얻은 상등 액을 느티리버섯 푸른곰팡이병균 (Trichodemia koningii), 시들음병균(Fusarium oxysponmi\ 탄저 병 균(gloeosporioides\ 균핵 병 균(Sclerotinia sclerotionun), 잎집무늬마름병균(Rhizocnia solani AG- 1(IA)]이 접종된 PDA 평핀배지에 50 "씩 떨어뜨린 후 디스크 확산 법으로 27℃에서 48시간 배양 후, 생장 억제대(투명환)를 조사한 결괴-, DY5 균주는 5종의 진균 생장에 강한 억제력을 나타냈다(Fig.
- 세포 내 지방산 분석에서 DY5 균주 내에는 주로 isobranched fetty acid와 ante iso-branched fatty acid로 구성되 어있으며, 그 중 C15;o ante iso-fatty acid가 65.09%로 가장 높은 함유량을 보이며 , C15;o iso-fetty acid# 6.85%, C16;0 isofatty acid를 6.76% 함유하고 있음을 확인하였다(Table 4). 균주 내 지방산 조성 분석결과 분리균주 DY5는 다른 Gram 양성 균들의 특징인 iso-type과 ante iso-type 지방산이 주요 구성성분이었으며,ante iso-type이 iso-typee] 비해 큰 비중을 차지하고 있음을 확인하였다.
- API 50 CIIB test의 산생성능, 형태적 및 생화학적 실험결괴를 분석하여 균주를 동정한 결괴-, DY5 균주는 Bacillus circukms와 Paenibacillus polymyxcfe 가장 가까운 근연성을 나티내었디. 세포내 지방산 조성 분석을 통하여 동정한 결괴-, DY5 균주는 Paenibacillus 속에 속하는 균주로 확인되 었디' DY5의 16SrRNA 염기서열은 Paenibacillus polymyxa 균주와 98% 이상의 유사성을 나타내었다. 본 연구에서 분리 동정된 이 Paenibacillus polymyxa DY5가 생산하는 항균물질은 중온성이며, 호알칼리성이고, 단백질성 물질로 판단되며, 작물 병원균에 강한 활성을 나타내 앞으로 생물농약으로 개발될 잠재력을 가진 균으로 판단된다.
- 6). 이 실험 결과로 Paenibacillus polymyxa DY5 균주가 생산하는 항 진균물질은 단백질성 물질로 판단된다.
- 균주 내 지방산 조성 분석결과 분리균주 DY5는 다른 Gram 양성 균들의 특징인 iso-type과 ante iso-type 지방산이 주요 구성성분이었으며,ante iso-type이 iso-typee] 비해 큰 비중을 차지하고 있음을 확인하였다. 이들 지방산 조성을 MIDI library에서 동정한 결과 DY5 균주는 Paenibacillus 속 (genus)에 속하는 균주로 확인되었다. 이 결과는 Ybon 등 (2003)이.
- kriblbeis와 유연관계가 매우 높은 것으로 나타났다. 이상의 형태 및 생리생화학 시험에 기반 한 분류키 검색(Reva et al, 2001) 등, 계통분류학적 결과를 종합하여 DY5 균주는 기존의 Paenibacillus polymyxa DSM36 균주와 98% 이상의 유사성을 나타내는 새로운 균주로 판명되었다.
- 8%의 유사도를 나타냈다. 장내세균 인지를 알아보기 위하여 API 20E test를 한 결과 ONPG(Ortho-nitro-phenyl-b-D-galacctopyranoside) test, IND(Indol production) test, VP(Vbges - Proskauer) 시험, GEL(Gelatmase) 반응에서는 양성반응을 나타냈으며, ADH(Argine dihydrolase) test, LDC(Lysine decarboxylase) test, ODC(Omithin decarboxylase) test, CIT(Citrate utilization) test, H2S 생성반응, URE(Urase) test, TDA(Tryptophane deaminase) 반응에는 음성반응을 나타내어 (Table 2) DY5 균주는 장내세균이 아닌 것으로 판별되었다.
- 항균물질이 실제로 느티리 버섯 푸른곰핑이 병균인 Trichodenm koningiie 대해 방제효과가 있는지를 알아보기 위하여 적용실험을 시행한 결과, Fig. 7에서와 같이 Trichoderma koningiie 접종 한 배지(Fig. 7B)를 제외하고, 아무것도 처리하지 않은 배지 (Fig. 7A), 배양여과액을 첨가한 배지 (Fig. 7C). Trichoderma koningiie 배양여과액을 같이 첨가한 배지(Fig.
- 형태 및 생화학적 특성 분석에서 DY5 균주의 크기는 1 /o 이상이었으며, catalase 및 egalactosidase 효소활성도 검사에서 양성반응을 나타냈다 (Table 2). 그람염색 반응을 통하여 그람양^균으로 확인되었으며(Fig.
후속연구
- 세포내 지방산 조성 분석을 통하여 동정한 결괴-, DY5 균주는 Paenibacillus 속에 속하는 균주로 확인되 었디' DY5의 16SrRNA 염기서열은 Paenibacillus polymyxa 균주와 98% 이상의 유사성을 나타내었다. 본 연구에서 분리 동정된 이 Paenibacillus polymyxa DY5가 생산하는 항균물질은 중온성이며, 호알칼리성이고, 단백질성 물질로 판단되며, 작물 병원균에 강한 활성을 나타내 앞으로 생물농약으로 개발될 잠재력을 가진 균으로 판단된다.
- , 2009) 등에서 분리되었다. 이 균주가 다양한 생태적 환경에서 분리된 것으로 보아, 이 세균의 생태적 환경에 대한 조사가 더 이루어져야 될 것이다.
- 7D)에서는 느타리버섯 자실체가 형성되었다.이는 Paenibacillus polymyxa DY5 균주가 생산한 항균물질이 Trichoderma 加沥滅의 생장을 억제했기 때문인 것으로 Paenibacillus polymyxa DY5 균주가 생산하는 항균물질은 생물농약으로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.