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문제 정의
- 본 연구는 발아종자 발달단계의 cDNA 합성과 발아종자에서 발현하는 발현유전자의 대량 염기서열 분석 및발현유전자 정보종합화를 목적으로 수행하였다. 이러한발아종자 발현유전자정보의 종합화는 벼 및 식물전반의구조 및 기능유전체를 연구하는 연구자들에게 보다 유익한 정보를 제공할 수 있을 것이며 발아종자 유전자의 발현특성을 분석함으로써 종자 발아에 관련된 발아율 향상, 수발아 방지 및 농업형질개선 등의 실용화 연구에 기여할 수 있을 것으로 기대되어 진다.
- 이 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원 어젠더 2-7-11 “벼 변이집단 및 생물정보를 이용한 유용 농업형질 유전자탐색” 과제, “벼.배추의 생장 및 대사관련 유전자발현네트워크구축” 과제 및 “바이오그린21사업” 과제지원에의해 수행되었다. 본 연구수행 중 발아종자 EST DNA 분리와 염기서열 분석은 최은영, 양희은양이 수고해 주었다.
- 종자성숙 및 발아 시기의 일련의 과정에서 이루어지는 유전자들의 발현 특성분석을 위하여 미숙종자와 발아 종자 공통적으로 발현하는 다양한 유전자를 동정하고자 한다.
제안 방법
- 양을 얻을 수 있었다. 각각의 발아종자 발현유전자클론의 염기서열 결정은 96well PCR plate 를 이용하여 각 well 당 200 ng 의 DNA, 5 pm 이의 SK primer, 2 의 Bigdye terminater sequence reaction, 1 ul 의 5 X buffer 를 넣은 후 염기서열분석 반응을 시키고 ABI3100 과 ABI3730 염기서열분석기를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 발아종자 염기서열분석은 총 22, 272 (96well 232plate) 개의 발현유전자를 분석하였으며 이들 클론 중에서 150 bp 이하 길이의염기서열정보를 가진 클론과 불량 염기서열부분의 제거를 행하여 최종적으로 18, 101개 클론의 염기서열정보를얻을 수 있었다.
- 발아종자 cDNA 100 ng 을 1 ug 의 Uni-ZAP vector 에 삽입한 후 Gigapack Ⅲ Gold Packaging Extract 에 packaging 하여 cDNA 은행제작을 하였다. 개별 유전자 클론의 플라스미드 DNA 분리는 96 well 밀리포어 멀티스크린 (Millipore MANANLY50, MAFBNOB50) 을 이용하여 대량으로 플라스미드 DNA 를 분리하였다. 발아종자 삽입단편의 크기 확인은 플라스미드 DNA 를 EcoRI, XhoI 제한효소로 처 리한 후 1.
- 0e-20 이하인 것들만을 추출하여 유사서열이 아닌 것이 나올 확률을 최소화하였다. 다음으로 이렇게 얻어진 KOG DB 내 단백질 유사서열의 분류정보를 바탕으로 unigene 서열의 기능 분류를 수행하였다.
- 대량 염기서열분석을 위하여 밀리포어 96 well 멀티스크린 시스템을 사용하여 150 ul TB 배지에서 5 - 8 ug의플라스미드 DNA 를 얻을 수 있었으며 무엇보다 균일한 DNA 양을 얻을 수 있었다. 각각의 발아종자 발현유전자클론의 염기서열 결정은 96well PCR plate 를 이용하여 각 well 당 200 ng 의 DNA, 5 pm 이의 SK primer, 2 의 Bigdye terminater sequence reaction, 1 ul 의 5 X buffer 를 넣은 후 염기서열분석 반응을 시키고 ABI3100 과 ABI3730 염기서열분석기를 이용하여 염기서열을 결정하였다.
- KOG DB를 기반으로 하여 수행하였다. 먼저, BLASTX 분석을 통해 KOG DB 내 서열 중 unigene 서열 각각에 대해가장 높은 유사성을 가지는 단백질 서열을 검색하였다. 이때 검색 조건으로 e-value 가 1.
- 하였다. 미숙종자와 발아종자의 공통발현 유전자수 산정은 각각의 미숙종자와 발아종자의 unigene 을 합한 수에서 발아종자와 미숙종자 발현유전자를 같이 assembly 하여 얻어진 unigene 의 개수를 제외하고 얻어진 수를 공통발현 유전자수로서 산정하였다 (Yoon et al. 2009).
-
벼 발아종자 발현 단일유전자 선발
발아종자 EST 염기서열 정보분석을 위하여 각 클론의 발현 유전자 염기서열을 결정한 후 SeqMan 프로그램 (DNASTAR Inc) 을 사용하여 벡터부위를 포함하는 염기서열 부분과 불명확한 염기서열을 제거하였다. 발아종자내발현하는 unigene 선발은 SeqMan 프로그램을 이용하여 100 bp씩 95%의 상동성으로 유전자 염기서열들을 연결하여 얻어진 singleton 유전자와 두개 이상의 유전자로 cluster 된 contig 수를 합하여 얻어진 수를 unigene 수로 결정하였다 (Kikuchi et al.
- 발아종자 cDNA 은행제작은 ZAP-cDNA Gigapack Ⅲ 골드클로닝 kit (Clontech) 를 사용하였다. 발아종자 cDNA 100 ng 을 1 ug 의 Uni-ZAP vector 에 삽입한 후 Gigapack Ⅲ Gold Packaging Extract 에 packaging 하여 cDNA 은행제작을 하였다. 개별 유전자 클론의 플라스미드 DNA 분리는 96 well 밀리포어 멀티스크린 (Millipore MANANLY50, MAFBNOB50) 을 이용하여 대량으로 플라스미드 DNA 를 분리하였다.
- 발아종자 발현유전자 염기서열 결정은 각 클론의 5'말단을 BigDye terminator ver 3.1 (Applied Biosystems)과 SK 프라이머 (5'-cgctctagaactagtggatc-3')를 이용하여 염기서열분석반응을 수행한 후 ABI3100 및 ABI3730 유전자 염기서열분석기 (Applied Biosystems) 를 사용하여 벼 발아 종자 발현 유전자에 대한 염기서열을 결정하였다.
- 개별 유전자 클론의 플라스미드 DNA 분리는 96 well 밀리포어 멀티스크린 (Millipore MANANLY50, MAFBNOB50) 을 이용하여 대량으로 플라스미드 DNA 를 분리하였다. 발아종자 삽입단편의 크기 확인은 플라스미드 DNA 를 EcoRI, XhoI 제한효소로 처 리한 후 1.2% Agarose gel 전기영동으로 하여 삽입 단편을 확인 하였다.
- 발아종자내발현하는 unigene 선발은 SeqMan 프로그램을 이용하여 100 bp씩 95%의 상동성으로 유전자 염기서열들을 연결하여 얻어진 singleton 유전자와 두개 이상의 유전자로 cluster 된 contig 수를 합하여 얻어진 수를 unigene 수로 결정하였다 (Kikuchi et al. 2003, Yoon et al. 2009).
- 발아종자로부터 얻은 unigene 들에 대한 기능분류는 NCBI 에서 애기장대 식물 등 7개 주요 진핵생물 단백질 서열로부터 구축된 KOG (Eukaryotic Clusters of Orthologous Groups) DB 인 KOG DB를 기반으로 하여 수행하였다. 먼저, BLASTX 분석을 통해 KOG DB 내 서열 중 unigene 서열 각각에 대해가장 높은 유사성을 가지는 단백질 서열을 검색하였다.
- 발아 종자의 unigene 분리는 DNASTAR 사의 SeqMan 프로그램을 이용하였으며 발아종자 18, 101개 EST 의 basecalling 과 clustering 을 행한 결과 2개 이상의 클론이 중복된 2, 735개의 contig 와 6, 101개의 singleton 등 8, 836개의 unigene 을 얻었다 (그림 1, 표 1). 발아종자에서 많이 발현하는 유전자들의 분포도 분석은 앞서 SeqMan으로 분석된 clustering 결과를 이용 하였다. 우선 50개 이상의 클론으로 구성된 contig 를분석한 결과 2, 735개 contig 중에서 14개의 contig 가 50개 이상의 클론으로 구성되어있었다 (그림 2).
- 염기서열이 결정되어진 18, 101개의 EST 를 SeqMan 프로그램을 이용하여 cluster 분석을 행한 결과 8, 836개의 unigene을 분리 하였다. 발아종자에서 많이 발현하는 유전자의 완전장 구조분석을 행한 결과 발아종자 특이적으로 발현하는 키티나아제 및 전분분해에 관여하는 아밀라제 유전자등 몇종류의 특이발현 유전자들을 분리 하였으며 이들 유전자들은 GenBank 에 등록하였다.
- 벼 발아종자에 발현하는 유전자들의 발현특성을 분석하기 위하여 우선 발아종자 발현유전자 cluster 분석을 통하여 얻어진 contig 중에서 20개 이상의 클론들로 구성된 발현 유전자들의 완전장 염기서열을 결정하였으며 25개의 유전자를 GenBank 에 등록하였다 (표 2). 이들 종자 발아 발현 유전자들의 염색체내 위치 결정은 RAP DB 와 TIGR Pseudomolecule ver.
- 배추의 생장 및 대사관련 유전자발현네트워크구축” 과제 및 “바이오그린21사업” 과제지원에의해 수행되었다. 본 연구수행 중 발아종자 EST DNA 분리와 염기서열 분석은 최은영, 양희은양이 수고해 주었다.
- 유전자를 GenBank 에 등록하였다 (표 2). 이들 종자 발아 발현 유전자들의 염색체내 위치 결정은 RAP DB 와 TIGR Pseudomolecule ver. 6 DB 에서 BLASTN 분석을 통해 유사성이 99% 이상을 나타내는 염색체 부위를 판별하여 각유전자의 염색체 위치를 결정하였다. 종자발아시기에 가장 많이 발현하는 유전자는 당대사에 관여하는 glyceralde- hyde-3-phosphate dehydrogenase 유전자였다.
- 일품벼 발아종자 EST 의 염기서열 정보분석 및 기능분류를 위하여 발아종자의 unigene 을 분리하였다. 발아 종자의 unigene 분리는 DNASTAR 사의 SeqMan 프로그램을 이용하였으며 발아종자 18, 101개 EST 의 basecalling 과 clustering 을 행한 결과 2개 이상의 클론이 중복된 2, 735개의 contig 와 6, 101개의 singleton 등 8, 836개의 unigene 을 얻었다 (그림 1, 표 1).
- 종자의 발아기에 관여하는 유전자의 기능을 분석하기 위하여 일품 벼를 48시간 발아시킨 후 얻은 발아종자 cDNA 클론의 염기서열을 결정하였다. 염기서열이 결정되어진 18, 101개의 EST 를 SeqMan 프로그램을 이용하여 cluster 분석을 행한 결과 8, 836개의 unigene을 분리 하였다.
대상 데이터
- 일품벼 발아종자 발현유전자은행 (cDNA) 제작을 위한 RNA 분리는 Trizol 시약 (Invitrogen Life Technologies) 을 이용하여 total RNA 를 분리한 후 PolyA Tract mRNA kit (Promega) 를 사용하여 Poly(A) mRNA 를 분리하였다. 발아종자 cDNA 은행제작은 ZAP-cDNA Gigapack Ⅲ 골드클로닝 kit (Clontech) 를 사용하였다. 발아종자 cDNA 100 ng 을 1 ug 의 Uni-ZAP vector 에 삽입한 후 Gigapack Ⅲ Gold Packaging Extract 에 packaging 하여 cDNA 은행제작을 하였다.
- 발아종자 발현유전자단편의 정보분석은 국립 농업과학원 농업생명공학정보센터 (http://www.niab.go.kr) 에 설치된 webblast 및 NCBI 의 BLAST (http:/www.ncbi.nlm .nih.gov)을 이용하여 상동성 검사를 수행하였다.
- 발아종자 발현유전자의 벼 염색체내의 위치결정을 위하여 일본의 벼 명명 프로젝터에서 구축한 데이터베이스(RAP DB, http:/rapdb.dna.affrc.go.jp)와 미국 미시간대학교벼 게놈 명명프로젝터 데이터베이스 (RGAP DB, http:/rice. plantbiology.msu.edu) 의 TIGR Pseudomolecule ver. 6 정보를 이용하였다. 각각의 발아종자 발현유전자들의 염색 체내 위치결정은 BLASTN 분석을 통해 얻어진 발현유전자 염기서열의 유사성이 99% 이상을 나타내는 염색체 내 지역을 판별하여 각 유전자의 염색체내 위치로 나타내었다.
- 본 연구에 사용된 일품 벼 발아종자는 종자의 껍질을벗긴 후 1% 과산화수소용액에 5분 소독한 후 멸균 증류수로 세척을 하였으며 물에 침지하여 24시간 흡습시킨 종자를 30 L 항온기에서 48시간 발아시킨 발아종자를 사 용하였다. 일품벼 발아종자 발현유전자은행 (cDNA) 제작을 위한 RNA 분리는 Trizol 시약 (Invitrogen Life Technologies) 을 이용하여 total RNA 를 분리한 후 PolyA Tract mRNA kit (Promega) 를 사용하여 Poly(A) mRNA 를 분리하였다.
데이터처리
- 일품벼 발아종자와 미숙종자에 공통으로 발현하는 발현유전자분석을 위하여 SeqMan 프로그램을 이용 하였다. 미숙종자와 발아종자의 공통발현 유전자수 산정은 각각의 미숙종자와 발아종자의 unigene 을 합한 수에서 발아종자와 미숙종자 발현유전자를 같이 assembly 하여 얻어진 unigene 의 개수를 제외하고 얻어진 수를 공통발현 유전자수로서 산정하였다 (Yoon et al.
성능/효과
- 6 정보를 이용하였다. 각각의 발아종자 발현유전자들의 염색 체내 위치결정은 BLASTN 분석을 통해 얻어진 발현유전자 염기서열의 유사성이 99% 이상을 나타내는 염색체 내 지역을 판별하여 각 유전자의 염색체내 위치로 나타내었다.
- 미숙종자와 발아종자 공통적으로 발현하는 유전자의 분석을 위하여 미숙종자 25, 668개와 발아종자 18, 101개 등 43, 744개의 유전자를 SeqMan 프로그램으로 cluster 분석을 행한 결과 2, 541개의 공통발현 unigene 을 얻을 수 있었다. 이들 유전자중 alpha-glubulin 및 alcohol dehydrogenase 1 등은 미숙종자와 발아종자에서만 발현을 나타내어 LEA 유전자로 추정되어진다.
- 발아 종자의 unigene 분리는 DNASTAR 사의 SeqMan 프로그램을 이용하였으며 발아종자 18, 101개 EST 의 basecalling 과 clustering 을 행한 결과 2개 이상의 클론이 중복된 2, 735개의 contig 와 6, 101개의 singleton 등 8, 836개의 unigene 을 얻었다 (그림 1, 표 1). 발아종자에서 많이 발현하는 유전자들의 분포도 분석은 앞서 SeqMan으로 분석된 clustering 결과를 이용 하였다.
- 2%로 나타났다. 발아종자 18, 101개 클론으로부터 얻어진 전체 염기서열 길이는 11, 403, 648 bp 였으며 발아종자 발현유전자 1개 클론의 평균 길이는 630 bp 로 확인되었다. 앞서 발표한 미숙종자 발현유전자의 염기서열분석 성공률 76%와 1개 클론 평균 염기서열 길이 550bp (Yoon et al.
- 발아종자 18,101개 EST의 8,836개 unigene에 대한 기능 분류를 위하여 KOG분석을 행한 결과 약 57.4%에 해당하는 5,076개의 unigene이 KOG 분류에 속하였으며 4개의 대 분류군중 Information storage and processing 14.2%, Cellular processes and signaling 27%, Metabolism 24.8%, Poorly characterized 34%의 비율을 나타내었다 (표 3). 발아종자 발현 유전자의 기능분류 결과 번역, 발생, 리보솜 구조 등에 관한 유전자 발현이 많이 나타났으며 특히 전사 후 수정, 단백질 이동, 사페론의 유전자등이 가장 많이 발현하였다.
- 발아종자 8, 836개의 유전자 기능분류를 NCBI KOG DB 를 이용하여 분석한 결과 정보축적 및 처리기능관련유전자 783개 (14.2%), 세포생리기능관련 유전자 1, 484개 (27%), 대사관련 유전자 1, 363개 (24.8%) 그리고 기능미확인 유전자 1, 869개 (34%)의 비율을 나타내었다.
- 8%, Poorly characterized 34%의 비율을 나타내었다 (표 3). 발아종자 발현 유전자의 기능분류 결과 번역, 발생, 리보솜 구조 등에 관한 유전자 발현이 많이 나타났으며 특히 전사 후 수정, 단백질 이동, 사페론의 유전자등이 가장 많이 발현하였다. 앞서 발표한 미숙종자와의 발현분석 비교에서는 번역에 관한 유전자의 발현이 현저히 감소하였으며 에너지대사의 경우는 현저히 높게 발현하는 것으로 나타났다.
- 0 X 106 pfu/ml 의 phagemid 를 얻었다. 발아종자 발현유전자 삽입단편 크기는 1.2% 아가로즈 전기영동으로 확인한 결과 0.5 - 3.0 kb 의 삽입단편을 포함하고 있는 것으로 나타났다 본 연구에서 cDNA 합성을 위하여 사용한 poly(A) RNA 분리 및 oligo(dT) primer 와 reverse transcriptase 효소를 이용한 방법으로는 3 kb 이상 길이를 가진 cDNA 합성에 어려움이 있다. 향후 효율적인 완전장유전자의 분리를 위하여서는 CAP trapper 방법을 이용한 완전장 cDNA 은행제작이 요구되어 진다 (Carnini P, 1996, Kikuchi S, 2003).
- 발아종자 염기서열분석은 총 22, 272 (96well 232plate) 개의 발현유전자를 분석하였으며 이들 클론 중에서 150 bp 이하 길이의염기서열정보를 가진 클론과 불량 염기서열부분의 제거를 행하여 최종적으로 18, 101개 클론의 염기서열정보를얻을 수 있었다. 발아종자 발현유전자 염기서열분석 성공률은 81.2%로 나타났다. 발아종자 18, 101개 클론으로부터 얻어진 전체 염기서열 길이는 11, 403, 648 bp 였으며 발아종자 발현유전자 1개 클론의 평균 길이는 630 bp 로 확인되었다.
- 각각의 발아종자 발현유전자클론의 염기서열 결정은 96well PCR plate 를 이용하여 각 well 당 200 ng 의 DNA, 5 pm 이의 SK primer, 2 의 Bigdye terminater sequence reaction, 1 ul 의 5 X buffer 를 넣은 후 염기서열분석 반응을 시키고 ABI3100 과 ABI3730 염기서열분석기를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 발아종자 염기서열분석은 총 22, 272 (96well 232plate) 개의 발현유전자를 분석하였으며 이들 클론 중에서 150 bp 이하 길이의염기서열정보를 가진 클론과 불량 염기서열부분의 제거를 행하여 최종적으로 18, 101개 클론의 염기서열정보를얻을 수 있었다. 발아종자 발현유전자 염기서열분석 성공률은 81.
- 종자의 발아기에 관여하는 유전자의 기능을 분석하기 위하여 일품 벼를 48시간 발아시킨 후 얻은 발아종자 cDNA 클론의 염기서열을 결정하였다. 염기서열이 결정되어진 18, 101개의 EST 를 SeqMan 프로그램을 이용하여 cluster 분석을 행한 결과 8, 836개의 unigene을 분리 하였다. 발아종자에서 많이 발현하는 유전자의 완전장 구조분석을 행한 결과 발아종자 특이적으로 발현하는 키티나아제 및 전분분해에 관여하는 아밀라제 유전자등 몇종류의 특이발현 유전자들을 분리 하였으며 이들 유전자들은 GenBank 에 등록하였다.
- 발아종자에서 많이 발현하는 유전자들의 분포도 분석은 앞서 SeqMan으로 분석된 clustering 결과를 이용 하였다. 우선 50개 이상의 클론으로 구성된 contig 를분석한 결과 2, 735개 contig 중에서 14개의 contig 가 50개 이상의 클론으로 구성되어있었다 (그림 2). 이러한 경향은 콩 유래 68, 661개의 EST 염기서열로부터 cluster 분석을 한 결과 60개 이상의 클론을 포함하는 contig는 10개 미만인 것으로 보고 한 것과 유사한 결과를 나타내고 있다.
- 우선 앞서 분석된 벼 미숙종자 발현유전자 25, 643개와 발아종자 발현유전자 18, 101개 등 43, 744개의 발현유전자를 SeqMan 프로그램으로 cluster 분석을 행한 결과 13, 989 개의 unigene 을 얻었다. 발아종자와 미숙종자에서 공통적으로 발현하는 유전자를 분석하기위하여 미숙종자의 7, 694개 unigene (Yoon et al.
- 종자발아시기에 가장 많이 발현하는 유전자는 당대사에 관여하는 glyceralde- hyde-3-phosphate dehydrogenase 유전자였다. 이 유전자는 TIGR DB 에서는 벼 염색체내에 6종이 존재하는 것으로 보고되어 있으며 본 연구 결과, 발아시기에 3종의 유전자 (KCG225E10 : GQ848032, KCG185F05 : GQ848031, KCG106H12 : EU267971)의 발현이 많이 나타났다. Mangneschi 등 (2009) 은 산소결핍 상태의 종자발아시기에 발현하는 유전자들 의I 양상을 분석한 결과 3종의 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 유전자의 발현 변화가 나타났으며 이들 유 전자중 2종은 높게 1종은 낮게 발현하는 것으로 보고하고 있다.
- 일품벼 발아종자 cDNA 유전자은행제작 결과 2.0 X 106 pfu/ml 의 phagemid 를 얻었다. 발아종자 발현유전자 삽입단편 크기는 1.
후속연구
- 본 연구를 통하여 얻어진 발아종자관련 정보들은 발 아종자의 생리연구 및 농업형질개선 연구에 기여할 수 있을 것으로 기대되어 진다.
- 이러한발아종자 발현유전자정보의 종합화는 벼 및 식물전반의구조 및 기능유전체를 연구하는 연구자들에게 보다 유익한 정보를 제공할 수 있을 것이며 발아종자 유전자의 발현특성을 분석함으로써 종자 발아에 관련된 발아율 향상, 수발아 방지 및 농업형질개선 등의 실용화 연구에 기여할 수 있을 것으로 기대되어 진다.
- Xiao 등 (2007)은 LEA 유전자를 벼에 과발현시킨 결과 건조저항성이 증대되었다고 보고하였다. 이와같은 결과는 발아특이 발현유전자가 발아시기에 중요한역할을 하고 있음을 나타내며 이들 유전자의 특성을 파악하고 활용함으로서 발아조절 등 농업형질 개선연구에이용할 수 있을 것으로 생각한다.
- 0 kb 의 삽입단편을 포함하고 있는 것으로 나타났다 본 연구에서 cDNA 합성을 위하여 사용한 poly(A) RNA 분리 및 oligo(dT) primer 와 reverse transcriptase 효소를 이용한 방법으로는 3 kb 이상 길이를 가진 cDNA 합성에 어려움이 있다. 향후 효율적인 완전장유전자의 분리를 위하여서는 CAP trapper 방법을 이용한 완전장 cDNA 은행제작이 요구되어 진다 (Carnini P, 1996, Kikuchi S, 2003).
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