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문제 정의
- 본 연구에서는 마늘의 가공 편의를 높이고, 생리활성을 증대시킬 수 있는 부재료가 첨가된 가공품 개발을 위한 기초자료를 확보하고자 하였다. 즉, 열풍 건조를 통하여 단순 가공한 마늘 추출물에 자양강장, 면역증진, 원기회복 및 갈변 물질에 의한 항산화활성, 면역기능증진 등의 효능이 있음이 알려져 있는 홍삼⑺ 추출물을 적정 비율로 혼합한 조성 물의 항산화 활성, tyrosinase와 glucosidase 저해활성 및 항암 활성을 실험하였다.
제안 방법
- 각 암세포는 4x104 cells/mL로 농도를 조절하여 각각 100 uL씩을 96 well plate에 접종하였다. 37oC, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 제거한 다음 50, 100, 200, 500 및 1,000 ug/mL로 농도를 조정한 free RPMI 배지를 각 100 uL씩 가하여 동일한 조건에서 다시 24시간 배양하였다. 이때 대조군으로는 시료를 함유하지 않은 free RPMI 배지를 첨가하였다.
- 4 mL를 차례로 가한 후 진탕 혼합하여 실온에서 15분간 방치한 다음 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 Griess 시약 대신 증류수를 가하여 측정하였으며, nitrite 소거능은 100—[(시료 첨가구의 흡광도/무 첨가 구의 흡광도)X10이으로 나타내었다.
- 마늘 열수추출물에 홍삼 추출물을 무게비로 각각 5%, 10% 및 15% 첨가한 혼합물을 시료로 하여 탈이온수를 가해 500, 1,000, 2, 500, 5,000 및 10, 000 ug/mL로 농도 조정한 다음 생리활성 실험용 시료로 사용하였다.
- 배양된 각각의 암세포는 PBS로 세척한 후 0.05% tryp- sin-EDTA 로 부착된 세포를 분리한 다음 세포를 모두 모아 원심분리 하여 집적된 암세포를 배지에 다시 분산시킨 다음 20 此를 취해 tryphanblue 20 uL와 잘 혼합하여 세포 수를 확인하였다. 각 암세포는 4x104 cells/mL로 농도를 조절하여 각각 100 uL씩을 96 well plate에 접종하였다.
- 열풍건조 마늘 및 홍삼 추출물과 혼합물의 생리활성을 평가하고자 마늘 열수추출물에 홍삼 열수추출물을 5-15% (v/v) 첨가한 혼합물을 제조하여 500-10, 000 ug/mL 농도에서 항산화활성, tyrosinase 및 glucosidase 저해활성, 위암 및 대장암 세포에 대한 생육저해 활성을 실험하였다. 열풍 건조 마늘과 홍삼 추출물의 전자공여능은 1,000 ug/mL 이하의 농도에서는 15% 미만으로 낮았으나, 이들의 혼합물의 경우 38% 이상의 높은 활성을 나타내었다.
- 배양 후 PBS에 5 mg/mL 의 농도로 제조한 MTT(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5- diphenyl tetrazolium bromide) 용액을 각 well에 10 uL씩가한 후 3시간 동안 37oC incubator에서 배양하였다. 이 때 생존하는 세포와 MTT와의 반응으로 생성된 formazan 결정을 배지를 제거한 후 DMSO 100 uL에 녹여 plate shake (MX2, FINEPCR, Seoul, Korea) 에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 암세포의 성장 억제율을 산출하였다.
- 전자공여 작용은 Blois(8)의 방법을 변형하여 1, 1-di- phenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 에 대한 전자공여 효과 로그 활성을 측정하였다. 즉 일정농도의 시료 추출물에 DPPH 용액을 가하여 혼합한 다음 실온에서 20분간 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 측정하였다. 즉, 반응기질인 2.5 mM p-nitrophenyl a-D-glucopyranoside를 0.1 M potassium phosphate buf- fer(pH 6.8) 에 첨가한 후 a-glucosidase와 시료 추출물을 넣고 그 혼합액에 효소용액을 첨가한 후 37C 에서 20분간 반응시키고 0.1 M NaOH 100 uL를 가하여 반응을 정지시키고 기질인 p-nitrophenyl a-D-glucopyranoside로부터 유리되어 나오는 반응 생성물인 p-nitrophenol을 405 nm에서 측정하여 a-glucosidase 활성의 억제정도를 측정하였다.
- 확보하고자 하였다. 즉, 열풍 건조를 통하여 단순 가공한 마늘 추출물에 자양강장, 면역증진, 원기회복 및 갈변 물질에 의한 항산화활성, 면역기능증진 등의 효능이 있음이 알려져 있는 홍삼⑺ 추출물을 적정 비율로 혼합한 조성 물의 항산화 활성, tyrosinase와 glucosidase 저해활성 및 항암 활성을 실험하였다.
- 추출물은 여과 후 회전식진공건조기를 이용하여 완전건조 시켰으며, 건조물의 무게를 측정한 다음 -20oC 동결고에 보관해 두고 실험에 사용하였다. 추출수율은 추출 전후 시료에 대한 추출물의 완전건조 후 무게백분율로 계산하였다.
- 추출물은 여과 후 회전식진공건조기를 이용하여 완전건조 시켰으며, 건조물의 무게를 측정한 다음 -20oC 동결고에 보관해 두고 실험에 사용하였다. 추출수율은 추출 전후 시료에 대한 추출물의 완전건조 후 무게백분율로 계산하였다.
- 1 mL를 차례로 가한 다음 37oC에 서 30분간 반응시킨 후 470 nm에서 흡광도(Sod)를 측정하였다. 효소액 대신에 증류수를 넣고 측정한 흡광도(Bod) 및 시료액 대신에 증류수를 첨가하여 측정한 흡광도 (Cod) 를 이용하여 다음의 식에 따라 tyrosinase 저해능을 측정하였다.
대상 데이터
- 이때 열풍 건조 마늘과 홍삼의 건조 수율은 각각 45%와 18%였다. 시료는 모두 블랜드(Magic gold 520, Daesung, Bucheon, Korea) 를 이용하여 분쇄한 다음 -20oC 에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 열풍건조 마늘 및 홍삼은 새 남해농협(남해군)으로부터 제공받은 것을 사용하였다. 열풍건조 마늘은 깐 마늘을 80oC 에서 30시간 열풍 건조한 것을 시료로 하였으며, 홍삼은 세척한 수삼을 증삼기에서 65oC에서 1시간증삼한 후 85oC에서 3시간 2차 증삼한 다음 65oC 건조기에서 최소 8시간 건조시켜 제조한 것을 사용하였다.
- 제공받은 것을 사용하였다. 열풍건조 마늘은 깐 마늘을 80oC 에서 30시간 열풍 건조한 것을 시료로 하였으며, 홍삼은 세척한 수삼을 증삼기에서 65oC에서 1시간증삼한 후 85oC에서 3시간 2차 증삼한 다음 65oC 건조기에서 최소 8시간 건조시켜 제조한 것을 사용하였다. 이때 열풍 건조 마늘과 홍삼의 건조 수율은 각각 45%와 18%였다.
- 인체 위암 세포주인 AGS 와 인체 결장암 세포인 HT-29 은 한국 세포주 은행으로부터 분양 받았으며, 각각의 암세포는 5000 unit/mL의 penicillin-streptomycin과 10%의 FBS 가 함유된 RPMI 1640을 사용하여 37oC, 5% CO2 incubator 에서 배양하였다. 배양된 세포는 48시간 간격으로 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 0 package를 사용하여 분산분석 하였으며, 결과는 평균士표준편차로 나타내었다. 각 실험군에 대한 유의성 검정은 분산분석을 한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple test를 실시하였다.
- 반복 실험하여 얻은 결과는 SPSS 12.0 package를 사용하여 분산분석 하였으며, 결과는 평균士표준편차로 나타내었다. 각 실험군에 대한 유의성 검정은 분산분석을 한 후 p<0.
이론/모형
- Nitrite 소거능은 Kato 등⑼과 Kim 등(10)의 방법에 따라 1 mM NaNO2 용액 1 mL에 농도별 시료액 1 mL를 가하고 0.1 N HCl과 0.2 M 구연산 완충액 (pH 2.5)을 가하여 총 부피를 10 mL로 하였다. 이 용액을 37oC에서 1시간 반응시킨 후 각 반응액 1 mL를 취하여 2% 초산용액 3 mL와 30% 초산용액 에 용해한 Griess 시 약(1% sulfanilic acid: 1% naphthylamine=1:1) 0.
- Tyrosinase 활성 저해능 측정은 tyrosinase의 작용 결과 생성되는 DOPA chrome을 비색법에 의해 측정하는 Yagi 등(11)과 Jeon 등(12)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, pH 6.
- a-Glucosidase 활성 억제 측정은 Choe 등(13)의 방법을 참고하여 讥 庆zro에서 기질과의 반응역학분석 방법으로 억제율을 측정하였다. 즉, 반응기질인 2.
성능/효과
- 결과는 Table 2와 같다. 2, 500 ug/mL 이상의 농도에서 아질산염 소거능은 열풍건조 마늘 추출물에서 가장 높고 다음으로 홍삼 추출물 15% 첨가군, 10% 첨가군, 홍삼 추출물 및 5% 첨가군의 순이었다, 10, 000 ug/mL 농도에서 열풍 건조 마늘 추출물의 아질산염 소거활성은 60.74%로 대표적인 항산화 물질인 비타민 C(50.26%) 보다 더 활성이 우수하였다.
- 억제되었다. 50 ug/mL 농도에서 열풍건조 마늘 추출물의 암세포 성장 억제능은 31.30%로 여타 시료에 비하 여유의 적으로 활성이 높았으며 다음으로 홍삼 추출물이 21.81%, 홍삼 추출물을 5~15% 첨가한 시료의 경우 활성은 15.47~18.09%였다. 500 ug/mL 농도에서는 열풍건조 마늘과 홍삼 추출물은 시료간의 유의적인 차이 없이 48.
- 09%였다. 500 ug/mL 농도에서는 열풍건조 마늘과 홍삼 추출물은 시료간의 유의적인 차이 없이 48.6% 정도의 활성을 나타내었으며 홍삼 추출물 혼합액의 경우 15% 첨가군의 활성이 가장 높아 27.63%였다. 시료의 첨가 농도가 증가하여 1,000 ug/mL일 때 마늘 및 홍삼 추출물의 HT-29 세포 성장 억제능은 각각 52.
- 이상의 농도에서 더 활성이 높았다. 50과 100 ug/mL 농도에서 AGS 세포 성장억제능은 20% 이하로 낮았으나 1000 ug/mL 농도에서는 홍삼 추출물은 29.11%, 열풍 건조 마늘 추출물은 33.22%로 활성이 증가하였으며 홍삼 추출물을 5%~15% 첨가할 경우 활성은 40.96~45.15%로 크게 증가하였다.
- 27%로 유의적으로 증가하였다. AGS 세포 성장억제 능은 시료의 첨가농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하였으며 열풍건조 마늘이나 홍삼 단독 추출액에 비하여 이들의 혼합 시료에서 더 활성이 높았다. HT-29 세포의 성장도 시료의 첨가 농도에 의존적으로 억제되었는데, 1,000 ug/ mL 농도에서 열풍건조 마늘과 홍삼 추출물의 암세포 성장억제 능은 50% 이상이었으나 이들의 혼합물의 경우 활성이 저하하여 28.
- 억제활성과 다소 상이한 결과를 나타내었다. AGS 세포의 성장 억제능은 마늘이나 홍삼 단독 처리구에 비하여 이들의 혼합액 처리구에서 더 활성이 높았으나 대장암인 HT-29 에 대한 활성은 마늘이나 홍삼 단독 처리구가 더 활성이 높았고 이들의 혼합액은 활성이 유의적으로 낮았다. 마늘의 열수 추출물을 제조하여 여러가지 암세포의 성장억제 능을 평가한 결과 1% 처리군에서 백혈병 세포인 U937 및 HL60에서 가장 감수성이 높아 50% 이상의 억제 효과를 가졌으며 간암세포에서는 약 10%, 직장암 세포에서는 20~ 40% 정도의 증식 억제효과를 나타낸다는 Choi 등(27)의 보고가 있다.
- ASG 세포 성장억제능(Table 5)은 시료의 첨가농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하였으며 열풍건조 마늘이나 홍삼 단독 추출액에 비하여 이들의 혼합 시료에서 200 ug/ mL 이상의 농도에서 더 활성이 높았다. 50과 100 ug/mL 농도에서 AGS 세포 성장억제능은 20% 이하로 낮았으나 1000 ug/mL 농도에서는 홍삼 추출물은 29.
- AGS 세포 성장억제 능은 시료의 첨가농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하였으며 열풍건조 마늘이나 홍삼 단독 추출액에 비하여 이들의 혼합 시료에서 더 활성이 높았다. HT-29 세포의 성장도 시료의 첨가 농도에 의존적으로 억제되었는데, 1,000 ug/ mL 농도에서 열풍건조 마늘과 홍삼 추출물의 암세포 성장억제 능은 50% 이상이었으나 이들의 혼합물의 경우 활성이 저하하여 28.25-39.62%에 불과하였다.
- 59%이던 것이 이들의 혼합물에서는 그 활성이 급격히 저하하여 15% 미만이었다. a-Glucosidase 저해활성은 열풍건조 마늘 추출물에서 더 높아 10, 000 ug/mL 농도에서 22.22%였고, 동일 농도에서 홍삼 추출물의 경우 13.84%, 이들의 15% 혼합물에서 활성은 25.27%로 유의적으로 증가하였다. AGS 세포 성장억제 능은 시료의 첨가농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하였으며 열풍건조 마늘이나 홍삼 단독 추출액에 비하여 이들의 혼합 시료에서 더 활성이 높았다.
- 22%였다. 또 10, 000 ug/mL 농도에서 홍삼을 5%와 10% 첨가한 경우는 마늘 추출물에 비하여 활성이 낮았으나 15% 첨가구의 경우 활성은 25.27%로 유의적으로 더 높았다. 열풍건조 마늘 추출물과 홍삼 15% 첨가 구에서는 20% 이상의 a-glucosidase 활성을 저해하였으므로 탄수화물의 소화과정에서 a-amylase 와 a-glucosidase 에 의해 이당류인 maltose 의 분해 억제 및 단당류 생성을 저해함으로써 탄수화물의 소화와 흡수를 지연시키고 식사 후 혈당의 급격한 상승을 억제하는 효과를 나타낼 것으로 예상된다.
- 홍삼 및 마늘 첨가 구는 5,000 ug/mL 이상의 농도에서 유의성 있는 차이를 보였으며, 마늘에 비해 홍삼 첨가구에서 유의적으로 활성이 높았다. 마늘추출물에 홍삼 추출물을 5, 10 및 15% 첨가하여 복합물을 제조하였을 때, 홍삼 추출물의 첨가 농도가 높아질수록 tyrosinase 활성 억제효과도 상승되 었다, 10, 000 ug/mL 첨가 시 5% 첨가구는 9.61%였으나, 10%와 15% 첨가 구에서는 각각 11.98%와 12.80%로 5% 첨가구에 비해 유의적으로 약간 높은 활성을 보였다.
- 90%의 범위로 가장 높았으며 활성은 건조방법의 영향을 받지 않는다고 보고한 바 있다. 상기의 결과들과 본 실험의 결과를 비교하여볼 때 열풍건조 마늘과 홍삼 열수 추출물의 아질산염 소거 활성에는 마늘과 홍삼에 함유된 페놀성 화합물 및 유기산이 주된 역할을 하였을 것으로 추정된다.
- 결과는 Table 1과 같다. 시료 추출물의 전자공여능은 마늘과 홍삼 추출물 모두 500과 1,000 ug/mL의 농도에서는 15% 미만의 활성을 보였으나 그 이상의 시료 농도에서는 시료의 첨가 농도가 증가함에 따라 그 활성도 유의적으로 증가하여 10, 000 ug/mL 농도에서 전자공여능은 각각 45.76% 와 43.14%였다. 시료의 전자공여능은 열풍건조 마늘 추출액에 홍삼 추출액을 5-15% 비율로 첨가하였을 때 각각의 시료 추출물의 활성 에 비하여 월등히 증가하여 500 ug/mL 농도에서도 38% 이상의 높은 활성을 나타내 었으며, 1,000 ug/ mL 농도에서는 50%정도로 그 활성이 증가하였다.
- 시료의 대장암 세포 성장 억제능은 위암세포인 AGS 에대한 억제활성과 다소 상이한 결과를 나타내었다. AGS 세포의 성장 억제능은 마늘이나 홍삼 단독 처리구에 비하여 이들의 혼합액 처리구에서 더 활성이 높았으나 대장암인 HT-29 에 대한 활성은 마늘이나 홍삼 단독 처리구가 더 활성이 높았고 이들의 혼합액은 활성이 유의적으로 낮았다.
- 14%였다. 시료의 전자공여능은 열풍건조 마늘 추출액에 홍삼 추출액을 5-15% 비율로 첨가하였을 때 각각의 시료 추출물의 활성 에 비하여 월등히 증가하여 500 ug/mL 농도에서도 38% 이상의 높은 활성을 나타내 었으며, 1,000 ug/ mL 농도에서는 50%정도로 그 활성이 증가하였다.
- 63%였다. 시료의 첨가 농도가 증가하여 1,000 ug/mL일 때 마늘 및 홍삼 추출물의 HT-29 세포 성장 억제능은 각각 52.33%와 53.01%로 증가하였으며 홍삼 추출물 10%와 15% 혼합한 경우 각각 35.76% 와 39.62%로 35% 이상의 활성을 나타내었다.
- 열풍 건조 마늘과 홍삼 추출물의 전자공여능은 1,000 ug/mL 이하의 농도에서는 15% 미만으로 낮았으나, 이들의 혼합물의 경우 38% 이상의 높은 활성을 나타내었다. 2, 500 ug/mL 이상의 농도에서 아질산염 소거능은 열풍건조 마늘 추출물에서 가장 높고 다음으로 홍삼 추출물 15% 첨가군, 10% 첨가 군의 순이었다.
- 27%로 유의적으로 더 높았다. 열풍건조 마늘 추출물과 홍삼 15% 첨가 구에서는 20% 이상의 a-glucosidase 활성을 저해하였으므로 탄수화물의 소화과정에서 a-amylase 와 a-glucosidase 에 의해 이당류인 maltose 의 분해 억제 및 단당류 생성을 저해함으로써 탄수화물의 소화와 흡수를 지연시키고 식사 후 혈당의 급격한 상승을 억제하는 효과를 나타낼 것으로 예상된다. a-Glucosidase 저해제들은 혈당강하제 중 소화관에서 포도당 흡수를 지연시키는 약물로 당뇨 치료에 주로 사용이 되고 있으며(24, 25), 현재 acarbose와 voglibose 등과 같은 a-glucosidase 저해제가 판매되고 있으나 부작용이 많아 천연 소재에서 이들 저해제들을 개발하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다.
- 측정한 결과는 Table 3과 같다. 홍삼 및 마늘 첨가 구는 5,000 ug/mL 이상의 농도에서 유의성 있는 차이를 보였으며, 마늘에 비해 홍삼 첨가구에서 유의적으로 활성이 높았다. 마늘추출물에 홍삼 추출물을 5, 10 및 15% 첨가하여 복합물을 제조하였을 때, 홍삼 추출물의 첨가 농도가 높아질수록 tyrosinase 활성 억제효과도 상승되 었다, 10, 000 ug/mL 첨가 시 5% 첨가구는 9.
- 저해활성을 측정한 결과이다. 홍삼 추출물에 비하여 열풍 건조 마늘 추출물의 a-glucosidase 저해활성이 더 높아 10, 000 ug/mL 농도에서 홍삼 추출물의 경우 13.84%, 열풍 건조 마늘 추출물은 22.22%였다. 또 10, 000 ug/mL 농도에서 홍삼을 5%와 10% 첨가한 경우는 마늘 추출물에 비하여 활성이 낮았으나 15% 첨가구의 경우 활성은 25.
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