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문제 정의
- 특히 유자 씨를 종피와 배유로 분리하여 생리활성을 밝힌 연구는 없다. 따라서 본 연구에서는 유자씨의 기능성 성분 및 생리활성을 평가하기 위하여 유자청 제조 후 폐기되어지는 유자 씨를 종피와 배유로 분리하여 그 각각의 유효 성분을 추출하고, 추출물의 다양한 기능성을 평가하여 유자씨의 새로운 기능성 식품 소재로서 활용할 수 있는 기초 자료를 제공하고자 하였다.
가설 설정
- 92 및 39.18 mg AA eq/g으로(Table 2) DPPH 라디칼소거능의 결과와 유사하였다. 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량 및 총 항산화력의 상관관계를 분석한 결과 총 폴리페놀과 총 항산화력 사이에는 0.
- 3)ND: not detected.
제안 방법
- 45 um syringe filters(Millipore, Billerica, MA, USA)로 여과한 다음 HPLC(Younglin ACME 9000 system, Anyang, Korea)로 분석하였다. Columne Nova-pak C18(3.9 mm x 150 mm, 4 um, Waters Corp., Milford, MA), mobile phase는 A를 10 mM phosphoric acid(pH 2.5), B를 Methan이로 사용하여 A:B의 초기비율을 100:0으로 시작하여 8분에 40:60, 13분에 0:100, 18분에 100:0의 비율로 단계적인 gradient system을 사용하였다. Flow rate는 0.
- 각각의 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)과 100 U/mL penicillin G, 50 ug/mL streptomycin을 첨가한 RPMIT640과 DMEM(Gibco Co., New York, USA) 배지를 사용하여 5% CO2, 37oC 배양기에서 배양하였으며, 세포 밀도가 높아지면 5분간 trypsin-EDTA를 처리하여 계대배양 하였다. 암세포에 대한 암세포 성장억제 효과를 측정하기 위해 Ishiyama 등(19)의 방법에 따라 MTT assay로 실험하였다.
- 각각의 추출물에 대한 ACE 저해능은 Kwon 등(17)의 방법을 변형하여 측정하였다. Positive contr이로는 Angintensin Converting Enzyme Inhibitor(Sigma-Aldrich) 5 ug/mL로 사용하였다.
- 1x105 cell/well 농도로 96 well plate에 100 uL 분주 후 37oC, 5% CO2, incubator에서 24시간 배 양 후, 전 배 양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 일정 농도로 희석된 추출물을 100 uL를첨가하여 다시 24시간 배양하였다. 배양 완료 후 2 mg/mL 농도의 MTT시약을 well당 100 uL씩 분주한 다음 37°C, 5% CO2, incubator어〕서 4시간 후 MTT시약이 포함된 배지를 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO) 100 uL를 가한 후 상온에서 발색시키고, ELISA microplate reader(ELx808, Bio-tek® Inc., Highland Park, USA)를 이용, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 분쇄된 유자씨의 종피와 배유부분은 각각 10배량의 n-hexane을 가하여 400 rpm에서 3시간, 3회 반복 교반 추출하였으며, 남은 잔사는 50oC에서 진공건조 하여 n-hexane을 제거한 후 10배량의 70% ethan이을 가하여 1시간씩 3회 반복 초음파 추출하였다. 종피 n-hexane 추출물을 CSH1, 배유 n-hexane 추출물을 CSH2, 종피 ethanol 추출물을 CSE1 그리고 배유 ethanol 추출물을 CSE2로 명명하였다.
- 각각의 추출물은 여과한 후 감압농축기(Rotary vacuum evaporator, EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 추출용매를 제거하였다. 용매분획은 우수한 생리활성을 나타낸 ethanol 추출물을 증류수에 용해한 후 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 및 water 순으로 순차 분획하였으며 이들 분획물들을 질소 농축 및 감압 농축하여 분말형태로 제조하여 실험에 사용하였다.
- 유자씨 종피와 배유부분에 대한 n-hexane 및 ethanol 추출물에 대한 항산화활성, ACE 저해활성, a-glucosidase 억제 활성 및 항암활성을 살펴보았다. 항산화활성은 종피 nhexane 추출물(CSH1), 배유 n-hexane 추출물(CSH2), 종피 70% ethanol 추출물 (CSE1) 및 배유 70% ethanol 추출물 (CSE2) 가운데 CSE1 이 가장 높은 활성을 나타내었으며, CSE1 의 용매분획물 가운데 ethylacetate 층이 2 mg/mL의 농도에서 라디칼소거 능이 73.
- 초음파 추출하였다. 종피 n-hexane 추출물을 CSH1, 배유 n-hexane 추출물을 CSH2, 종피 ethanol 추출물을 CSE1 그리고 배유 ethanol 추출물을 CSE2로 명명하였다. 각각의 추출물은 여과한 후 감압농축기(Rotary vacuum evaporator, EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 추출용매를 제거하였다.
- 처리조건별 유자씨 추출물의 DPPH radical 소거활성 (Electron donating ability, EDA)은 Choi 등(15)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 시료 0.
- 검량선을 작성한 후 총 폴리페놀 함량은 시료 100 g 중의 mg garlic acid로 나타내었다. 총 플라보노이드 함량은 Zia 등(14)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 총 플라보노이드 함량은 추출물 250 uL에 증류수 1 mL와 5% NaNO2 75 uL를 가한 다음, 5분 후 10% AlCls -6H2O 150 uL를 가하여 6분 방치하고 1 N NaOH 500 uL를 가하였다.
- Positive contr이로는 Angintensin Converting Enzyme Inhibitor(Sigma-Aldrich) 5 ug/mL로 사용하였다. 추출물 100 uL에 0.2 mU ACE 정제효소액 80 uL와 5 mM HHL(Hippuryl-His-Leu) 기 질 100 uL를 가한 다음 37oC에서 60분 방치 한 다음 1 M HCl 250 uL를 가하여 반응을 정지시킨 후 0.45 um syringe filters(Millipore, Billerica, MA, USA)로 여과한 다음 HPLC(Younglin ACME 9000 system, Anyang, Korea)로 분석하였다. Columne Nova-pak C18(3.
- 8 mL를 가한 후, vortex mixer로 10초간 진탕하고 30분 후에 분광광도계 spectrophotometer를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도를 측정할 때 셀에 분주되는 각 시료에 의한 흡광도의 차이는 ethan이만의 흡광도를 측정하여 보정해 주었고, 이때 전자공여능은 시료 첨가구와 비첨가구의 흡광도 차이를 백분율(%)로 구하였으며, 추출물의 EDA(%) 값을 50% 감소시키는 ICHInhibition concentration)으로 표시하였다.
대상 데이터
- 즉, 총 플라보노이드 함량은 추출물 250 uL에 증류수 1 mL와 5% NaNO2 75 uL를 가한 다음, 5분 후 10% AlCls -6H2O 150 uL를 가하여 6분 방치하고 1 N NaOH 500 uL를 가하였다. 11분 후, 반응액의 흡광도 값을 510 nm에서 측정하였고, 표준물질로 (+)-catechin hydrate(Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 검량선을 작성한 후 총 플라보노이드 함량은 시료 100 g 중의 mg (+)-catechin hydrate로 나타내었다.
- Louis, MO, USA) 100 uL를 7가호} 였다. 30분 후, 반응액의 흡광도 값을 750 nm에서 측정하였고, 표준물질로 garlic acid(Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 검량선을 작성한 후 총 폴리페놀 함량은 시료 100 g 중의 mg garlic acid로 나타내었다.
- 본 실험에 사용한 유자씨는 2008년 10월 전라남도 고흥에서 생산된 유자의 과피와 과육을 제거한 것으로 (주)미드미 (Cheongwon, Korea) 에서 제공받아 수세 건조한 후 -20oC의 냉동고에 보관하면서 사용하였다. 유자씨는 종피와 종피를 제거한 배유부분으로 분리하여 18 mesh로 분쇄(Blixer® 4 mono, Robot-Coupe, Bourgogne, France)한 다음 시료로 人 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 암세포는 HCT 116(colorectal carcinoma: KCLB 10247), NCI-H460(lung large cell carcinoma: KCLB 30177), HepG2(ling hepatoblastoma KCLB 88065), MCF-7(mammary gland adenocarcinoma: KCLB 30022) 및 PC-3(prostate adenocarcinoma: KCLB 21435) 이 었으며, 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받아 사용하였다. 각각의 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)과 100 U/mL penicillin G, 50 ug/mL streptomycin을 첨가한 RPMIT640과 DMEM(Gibco Co.
데이터처리
- 2)Any means in the same column followed by the different superscripts are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- Antiproliferation effects of citron seed extracts on the human breast cancer cells (MCF-7). Different letters on the bars of same items indicate a significant difference (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 통계분석은 SPSS 통계프로그램 (Statistical Package for the Social Science, Ver 12.0 SPSS Inc., Chicago, USA)을 이용하여 각 측정 군의 평균과 표준편차를 산출하고 처리 간의 차이 유무를 one-way ANOVA로 분석한 뒤 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의성을 검정하였으며, Pearson 상관관계분석을 실시하였다.
이론/모형
- 각각의 추출물에 대한 a-glucosidase 억제활성은 Kim (18)의 방법에 의하여 측정하였다. 조효소를 추출하기 위해서 0.
- , New York, USA) 배지를 사용하여 5% CO2, 37oC 배양기에서 배양하였으며, 세포 밀도가 높아지면 5분간 trypsin-EDTA를 처리하여 계대배양 하였다. 암세포에 대한 암세포 성장억제 효과를 측정하기 위해 Ishiyama 등(19)의 방법에 따라 MTT assay로 실험하였다. 1x105 cell/well 농도로 96 well plate에 100 uL 분주 후 37oC, 5% CO2, incubator에서 24시간 배 양 후, 전 배 양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 일정 농도로 희석된 추출물을 100 uL를첨가하여 다시 24시간 배양하였다.
- 처리조건별 유자씨 추출물의 총 항산화력은 ABTS' cation decolorization assay 방법(16)에 의하여 측정하였다. 2, 2’-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS, Sigma-Aldrich) 7.
- 총 폴리페놀함량은 Dewanto 등(13)의 방법에 따라 Folin-Ciocalteu reagent가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다. 즉, 각 추출물 100 应에 2% Na2CO3 용액 2 mL 를 가한 후 3분간 방치한 다음 50% Folin-Ciocalteu re-agent(Sigma-Aldrich, St.
성능/효과
- 96 및 11.28 mg AA eq/g으로 (Table 1) 배유보다 종피추출 물에서 총 항산화력이 높게 나타났다. 가장 높은 총 항산화력을 보인 CSE1에 대한 용매분획물의 총 항산화력 (AEAC)은 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 및 water 층에서 각각 5.
- 25 mg/mL)에서는 유방암세포의 증식을 억제하지 못하는 것으로 나타났다. CSE1과 CSH1 은 2.5 mg/ mL 의 농도에서 각각 83.74%와 69.79%의 유방암세포 생존율을 보였지만 5 mg/mL의 고농도에서는 각각 14.09%와 48.54%로 증식억제에 효과가 있는 것으로 나타났다. 이에 반해 CSH2 및 CSE2는 5 mg/mL의 고농도에서도 유방암세포의 증식을 억제하지 못하였다.
- 22%로 높은 성장억제효과를 나타내었다. CSE2 와 CSH2는 5 mg/mL의 고농도에서 60.46%와 50.15%의 생존율을 보여 배유 추출물 중에는 폐암세포의 증식을 억제하는 유효성분이 적은 것으로 판단되었다(Fig. 3). 대장암세포 (HCT-116 cell) 증식 억 제율은 CSE1의 경우 저농도에 서는 증식 억 제효과가 낮았지 만 2.
- 30%의 생존율을 보여 높은 증식 억제효과를 나타내었지만 종피 ethanol 추출물 (CSE1)보다는 낮게 나타났다. CSE2는 저농도에서는 증식억제 효과가 낮았지만 1.25~2.5 mg/mL의 농도에서는 57.46 ~62.49% 그리고 5 mg/mL의 고농도에서는 31.56%의 생존율을 보여 증식억제효과가 있는 것으로 나타났다. 또한 CSH2 도 저농도에서는 증식억제효과가 낮았지만 고농도인 5 mg/mL의 농도에서는 24.
- 14%로 높은 증식 억제 효과를 나타내었다. CSE2은 고농도인 5 mg/ mL의 농도에서 52.97%의 생존율을 보였고, CSH2은 2.5와 5 mg/mL의 농도에서 각각 56.84%와 39.57%의 생존율을 보였다. 가장 뚜렷한 대장암세포 증식억제효과를 보이는 5 mg/mL의 농도에서 비교해 보았을 때 ethanol 추출물이 높은 증식억제효과를 보였으며, 배유보다는 종피에서 그 효과가 높게 나타났다(Fig.
- 12%로 높은 증식억제효과를 나타내었다. CSH1 도 2.5와 5 mg/mL의 농도에서 각각 71.23%와 48.95% 로 간암세포 증식을 억제하는 것으로 나타났지만 CSH2 와 CSE2는 5 mg/mL의 고농도에서는 간암세포의 증식을 억제하지 못하는 것으로 나타났다(Fig. 2). 폐암세포(NCI-H460 cell) 증식억제율을 측정한 결과 CSE1은 저농도(0.
- 12%로 매우 높은 증식억제효과를 나타내었다. CSH1 은 0.63~2.5 mg/mL의 농도에서 47.14~56.79%의 생존율을 나타내었으며, 5 mg/mL의 농도에서는 26.30%의 생존율을 보여 높은 증식 억제효과를 나타내었지만 종피 ethanol 추출물 (CSE1)보다는 낮게 나타났다. CSE2는 저농도에서는 증식억제 효과가 낮았지만 1.
- 7% 범위의 활성을 보였다는 연구와 비교해 볼 때 과육과 과피 추출물보다 유자씨 추출물이 더 높은 라디칼소거능을 나타내었다. 가장 높은 라디칼소거능을 나타낸 CSE1에 대한 용매 분획물의 라디칼소거능(EDA(%))을 측정한 결과 2 mg/mL의 농도에서 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 및 water 층의 EDA(%) 값은 각각 15.59, 21.95, 73.81, 31.96 및 55.27%로 ethyl acetate 층이 가장 높은 항산화력을 나타내었다(Table 2).
- 57%의 생존율을 보였다. 가장 뚜렷한 대장암세포 증식억제효과를 보이는 5 mg/mL의 농도에서 비교해 보았을 때 ethanol 추출물이 높은 증식억제효과를 보였으며, 배유보다는 종피에서 그 효과가 높게 나타났다(Fig. 4). 전립선암세포(PC-3 cell) 증식억제율을 측정한 결과 Fig.
- 17%로 가장 높은 활성을 나타내었다. 각각의 추출물에 대한 유방암, 간암, 폐암, 대장암 및 전립선암세포에 대한 증식억제효과는 모든 암세포에 대하여 5 mg/mL의 농도에서 종피 ethanol 추출물(CSE1)이 가장 높은 암세포 증식억제효과를 보였다.
- 이에 반해 CSH2 및 CSE2는 5 mg/mL의 고농도에서도 유방암세포의 증식을 억제하지 못하였다. 간암세포(Hep-G2 cell) 증식 억제율을 측정한 결과 CSE1은 저농도(0.32~2.5 mg/mL) 에서는 간암세포의 증식억제효과가 작았지만 고농도인 5 mg/mL에서는 19.12%로 높은 증식억제효과를 나타내었다. CSH1 도 2.
- 64 mg AA eq/g으로 우수한 항산화활성을 나타내었다. 또한 ACE 저해활성과 a-glucosidase 억제활성도 CSE1 이 각각 31.63% 및 45.17%로 가장 높은 활성을 나타내었다. 각각의 추출물에 대한 유방암, 간암, 폐암, 대장암 및 전립선암세포에 대한 증식억제효과는 모든 암세포에 대하여 5 mg/mL의 농도에서 종피 ethanol 추출물(CSE1)이 가장 높은 암세포 증식억제효과를 보였다.
- 01) 의 높은 상관관계를 보였다. 또한 IC50값과 총 항산화력의 상관관계를 분석한 결과 -0.526의 음의 상관관계를 보였다 (data not shown).
- 19% 로 높은 추출수율을 나타내었다. 또한 유자씨 종피 ethanol 추출물에 대한 용매분획물의 추출수율은 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 및 water 층에서 각각 2.72, 11.62, 8.05, 20.90 및 56.42%로 나타났다(Table 2).
- 유자씨 추출물에 대한 유방암세포(MCF-7 cell) 증식 억제율을 측정한 결과(Fig. 1) CSH1, CSH2, CSE1 및 CSE2 모두 저농도(0.32~1.25 mg/mL)에서는 유방암세포의 증식을 억제하지 못하는 것으로 나타났다. CSE1과 CSH1 은 2.
- ACE 저해제는 ACE 의 작용을 저해함으로써 angiotensin-U 의 생성저해, aldoterone 분비감소, 혈관확장제인 bradykinin의 증가 등의 과정을 통해 신장혈관을 확장시켜 sodium 의 배설을 촉진함으로써 혈압을 낮추어 줄 수 있다(26). 유자씨 추출물은 1 mg/mL의 농도에서 ACE저해활성을 보았으며 CSE1 에서 31.61%로 나타나 가장 높은 활성을 보였다. 이 값은 다른 추출물과 비교해보았을 때 약 2배 정도 높은 활성을 나타내었다(Table 3).
- 이용된다. 유자씨 추출물은 10 mg/mL의 농도에서 a-glucosidase 억제 활성을 보았으며 CSE1에서 45.17%로 나타나 가장 높은 활성을 보였다(Table 3).
- 4). 전립선암세포(PC-3 cell) 증식억제율을 측정한 결과 Fig. 5에서 보는 바와 같이 CSE1은 저농도(0.32~0.63 mg/mL)에서는 증식억제효과가 작았지만 1.25 mg/mL의 농도에서는 59.00%, 5 mg/mL의 농도에서는 9.12%로 매우 높은 증식억제효과를 나타내었다. CSH1 은 0.
- 종피 n-hexane 추출물(CSH1), 배유 n-hexane 추출물(CSH2), 종피 ethanol 추출물(CSE1) 및 배유 ethanol 추출물(CSE2) 에 대한 추출수율은 각각 4.86, 32.40, 8.40 및 18.79%이었다. 종피는 ethanol 추출물이 더 높은 추출수율을 나타내었고, 배유는 n-hexane 추출물이 더 높은 추출수율을 나타내었다.
- 18 mg AA eq/g으로(Table 2) DPPH 라디칼소거능의 결과와 유사하였다. 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량 및 총 항산화력의 상관관계를 분석한 결과 총 폴리페놀과 총 항산화력 사이에는 0.85(p<0.01), 플라보노이드와 IC50값 사이에는 0.71(p<0.01) 의 높은 상관관계를 보였다. 또한 IC50값과 총 항산화력의 상관관계를 분석한 결과 -0.
- 67 mg/g의 함량을 나타낸 Woo(20) 등의 보고와 유사한 경향을 나타내었다. 총폴리 페놀 함량은 종피보다는 배유 추출물에서 높은 함량을 보였지만 플라보노이드 함량은 배유보다 종피에서 높은 함량을 나타내었다(Table 1). Park 등(10)은 유자와 탱자 과피추출물의 총 폴리페놀 함량을 각각 75와 61 mg/100 g, 플라보노이드 함량을 각각 42와 34 mg/100 g로 보고하였는데 본 실험에 사용한 유자씨가 유자와 탱자 과피에 비해 더 많은 총 폴리페놀을 함유하고 있는 것으로 나타났다.
- 2). 폐암세포(NCI-H460 cell) 증식억제율을 측정한 결과 CSE1은 저농도(0.32~1.25 mg/mL) 에서는 폐암세포의 증식을 억제시키지 못하였지만 2.5 mg/mL의 농도에서는 78.43%, 5 mg/mL의 농도에서는 12.29%로 폐암세포의 증식을 억제하는 것으로 나타났다. CSH1 은 0.
- 및 항암활성을 살펴보았다. 항산화활성은 종피 nhexane 추출물(CSH1), 배유 n-hexane 추출물(CSH2), 종피 70% ethanol 추출물 (CSE1) 및 배유 70% ethanol 추출물 (CSE2) 가운데 CSE1 이 가장 높은 활성을 나타내었으며, CSE1 의 용매분획물 가운데 ethylacetate 층이 2 mg/mL의 농도에서 라디칼소거 능이 73.81% 그리고 총항산화력 이 56.64 mg AA eq/g으로 우수한 항산화활성을 나타내었다. 또한 ACE 저해활성과 a-glucosidase 억제활성도 CSE1 이 각각 31.
후속연구
- 현재 국내 유자는 고흥을 중심으로 전남 해안지역일대가 전체 생산량의 약 70%를 차지하고 있다(4). 그러나 현재 유자의 이용은 주로 과육 및 과피를 사용하여 유자청으로 제조되어 유자차로 소비되고 있어(5, 6) 유자 중량의 14~16%를 차지하고 있는 유자 씨는 연간 1, 800톤 이상 발생되고 있는 실정으로(7) 유자 씨를 활용할 수 있는 다양한 방법이 모색되어야 할 것이다.
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