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문제 정의
- 본 연구에서는 비만 치료와 관련하여 천연물질을 이용한 지방축적억제 활성물질을 개발하고자 민간요법으로 이용되는 지유, 옥발, 적하수오와 삼백초 4종을 혼합한 생약복합물을 대상으로 지방세포인 3T3-L1 preadipocyte를 이용하여 지방세포로 분화 시 지방축적과 지방 축적에 관여하는 효소인 GPDH의 활성을 측정하고, in vivo에서 항비만 효과를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 100 mM triethanolamine-HCl buffer, pH 7.5, 0.12 mM NADH, 2.5 mM EDTA, 0.2 mM dehydroxy acetone phosphate, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 동일한 양의 단백질을 사용하여 340 nm에서 1분 간격으로 10분간 흡광도 변화를 측정하여 GPDH의 활성을 계산하였다.
- 3T3-L1 adipocytes에서 HEM의 세포독성을 조사하기 위하여 0～100 μg/mL 농도의 HEM을 처리하였을 때, 대조군인 DMSO만을 처리한 것과 비교하여 세포증식의 변화 정도를 계산하여 세포독성을 조사하였다(Fig. 3).
- 3T3-L1 adipocytes의 지방축적율을 조사하기 위하여 배양된 세포에 분화유도물질과 함께 HEM을 0, 20, 40, 60, 80그리고 100 μg/mL로 처리하였다.
- 4종의 식물을 동량으로 혼합하여 10배의 물을 사용하여 가열 추출과 감압농축 과정을 거쳐 HEM을 조제하였다. In vitro 실험으로서 3T3-L1 preadipocyte가 adipocyte로 분화 유도과정에서 0～100 μg/mL 농도로 분화유도물질과 함께 48시간 처리 후 배지를 교환하여 6일 후 Oil-Red O 염색법으로 축적된 지방을 염색하였고, 분화유도물질만을 처리한 군과 비교 시 HEM의 처리 농도가 증가함에 따라 유의적으로 지방축적이 감소되었으며(Fig.
- 동물실험에서 5주간 고지방식이만을 섭취한 군과 고지방식이에 100 또는 200 mg/kg HEM이 첨가된 HEM1과 HEM2군을 비교하여 항비만에 대한 효과를 관찰하였다. HEM의 효과는 체중변화, 식이효율과 혈중 triglyceride와 total cholesterol 측정 및 부고환과 신장 주위의 지방 무게 측정 및 간 무게를 측정하여 판단하였다. HEM 섭취에 따른 체중과 식이효율의 감소는 처리군에서 유의성 있게 감소하였으며 (Table 3), 특히 HEM2는 식이섭취량이 HEM1보다 많았으나 식이효율에서는 낮아 지방축적억제 효과성이 있는 것으로 사료된다.
- 검액의 효과를 조사하기 위해서 0～100 μg/mL을 분화유도 배지에 첨가하였다.
- 동물실험에서 5주간 고지방식이만을 섭취한 군과 고지방식이에 100 또는 200 mg/kg HEM이 첨가된 HEM1과 HEM2군을 비교하여 항비만에 대한 효과를 관찰하였다. HEM의 효과는 체중변화, 식이효율과 혈중 triglyceride와 total cholesterol 측정 및 부고환과 신장 주위의 지방 무게 측정 및 간 무게를 측정하여 판단하였다.
- 배양중인 preadipocyte 상태인 3T3-L1을 탈착시켜 24 well plate에 동일한 수(2×104 )로 cell을 seeding하여 3T3- L1 cell이 confluent stage에 도달하면 분화유도 물질인 0.25μM Dex, 0.5 mM Mix와 10 μg/mL Ins을 첨가한 배양액으로 4일간 배양하여 분화유도 후, 4일간 10 μg/mL Ins만을 첨가한 배양액으로 교환하여 지방을 축적시켰다.
- 사육실 온도는 22±1℃, 습도는 50±5%로 유지하였고, 명암은 12시간 간격으로 조절하였다.
- 식이는 AIN-93G를 기준으로 변형된 식이를 실험에 사용하였으며, 대조군은 lard, casein, vitamin mix, mineral mix, sugar와 starch 등이 함유된 고지방 식이, 실험군은 대조군 식이에 100 또는 200 mg/kg HEM을 첨가한 고지방 식이로 조제하여 사용하였다(Table 1). 식이섭취량은 1주일에 2회 측정을 하였으며, 식이와 물은 제한 없이 자유 공급하였다.
- 실험 종료 후 마우스를 12시간 동안 절식시키고 에테르로 마취한 후, 지방조직의 무게를 조사하기 위하여 부고환주위 지방(좌/우), 신장주위지방(좌/우)과 간을 적출하여 생리식염수로 세척한 다음 여과지로 수분을 제거한 후 중량을 측정하였다.
- 6주령의 수컷 ICR mouse 18마리를 (주)셈타코에서 구입하여 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험에 사용한 군은 대조군인 HFD(high fat diet group)군과 실험군인 HEM1(HFD supplemented with 100 mg/kg HEM group)군과 HEM2(HFD supplemented with 200 mg/kg HEM group)군으로 나누었고, 각 군당 6마리씩 하였다. 실험은 5주간 체중변화, 식이섭취량, 식이효율, blood total cholesterol(BTC) 및 blood triglyceride(BTG)와 간 무게 및 부고환과 신장 주위의 지방의 무게를 측정하였다.
- 실험에 사용한 군은 대조군인 HFD(high fat diet group)군과 실험군인 HEM1(HFD supplemented with 100 mg/kg HEM group)군과 HEM2(HFD supplemented with 200 mg/kg HEM group)군으로 나누었고, 각 군당 6마리씩 하였다. 실험은 5주간 체중변화, 식이섭취량, 식이효율, blood total cholesterol(BTC) 및 blood triglyceride(BTG)와 간 무게 및 부고환과 신장 주위의 지방의 무게를 측정하였다. 사육실 온도는 22±1℃, 습도는 50±5%로 유지하였고, 명암은 12시간 간격으로 조절하였다.
- 지방축적에 관여하는 효소인 GPDH 활성을 측정하기 위해서 지방축적 억제율이 높고 세포 독성을 보이지 않은 농도인 100 μg/mL을 선별하여 실험을 하였다.
- 체중 변화와 식이효율에 미치는 HEM의 효과를 알아보기 위해서 고지방식이에 HEM을 각각 100, 200 mg/kg을 식이에 첨가하여 5주간 투여하고 그 결과를 Table 3에 나타내었다. 고지방식이만을 섭취한 군과 비교 시 HEM1과 HEM2의 체중 변화는 각각 52%와 50% 낮았으며, HEM2군은 통계학적으로 유의한 차이(p<0.
대상 데이터
- 6주령의 수컷 ICR mouse 18마리를 (주)셈타코에서 구입하여 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험에 사용한 군은 대조군인 HFD(high fat diet group)군과 실험군인 HEM1(HFD supplemented with 100 mg/kg HEM group)군과 HEM2(HFD supplemented with 200 mg/kg HEM group)군으로 나누었고, 각 군당 6마리씩 하였다.
- 경동시장에서 4종의 식물을 구입하여 동일한 양으로 혼합하여 10배수의 물을 가하여 100℃, 3시간 2회 추출하여, 그 추출액을 감압 농축하여 물 추출물(이하 HEM(herbal extract mixture)로 표기)을 제조하였다. 세포 실험에 사용할 시료는 DMSO를 이용하여 100 mg/mL로 녹여 stock solution을 만든 후, 적정 농도로 희석하여 사용하였다.
- 실험에 사용된 3T3-L1 세포는 한국세포주은행에서 분양을 받았고, 세포 유지는 10% BS, 1% PS가 함유된 DMEM을 사용하여 CO2 incubator(37℃, 5% CO2)에서 배양을 하였고, 3～4일 간격으로 계대배양을 실시하였다. 이러한 조건하에서 3T3-L1은 preadipocyte 상태를 유지한다고 알려져 있다(26).
- 실험에 사용한 시약은 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM, Lonza), fetal bovine serum(FBS, Lonza), bovine serum(BS, Gibco), trypsin(Lonza), penicillinstreptomycin(PS, Lonza), phosphate buffered saline(PBS, Lanza), 3-[4,5-dimethyltheazol-2-l]-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Sigma), dexamethasone(Dex, Sigma), insulin(Ins, Sigma), 3-isobutyl-1-methylxanthine(Mix, Sigma), Oil-Red O(Sigma), NaF(Sigma), EDTA(Sigma), benzamidin(Sigma), phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF, Sigma), Tris-HCl(Sigma), triethanolamine-HCl(Sigma), NADH(Sigma), dehydroxy acetone phosphate(Sigma), βmercaptoethanol(Sigma) 등을 사용하였으며, 그 외 시약은 1급 시약을 사용하였다.
- 실험에 사용한 시약은 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM, Lonza), fetal bovine serum(FBS, Lonza), bovine serum(BS, Gibco), trypsin(Lonza), penicillinstreptomycin(PS, Lonza), phosphate buffered saline(PBS, Lanza), 3-[4,5-dimethyltheazol-2-l]-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Sigma), dexamethasone(Dex, Sigma), insulin(Ins, Sigma), 3-isobutyl-1-methylxanthine(Mix, Sigma), Oil-Red O(Sigma), NaF(Sigma), EDTA(Sigma), benzamidin(Sigma), phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF, Sigma), Tris-HCl(Sigma), triethanolamine-HCl(Sigma), NADH(Sigma), dehydroxy acetone phosphate(Sigma), βmercaptoethanol(Sigma) 등을 사용하였으며, 그 외 시약은 1급 시약을 사용하였다. 혈액 분석에 사용한 triglyceride와 total cholesterol kit는 아산제약에서 구입을 하였고, 측정 기계는 ELISA reader(model 550, Bio-Rad), CO2 incubator(3111, Thermo), inverted microscope(CK40, Olympus), UV spectrophotometer(8452A, HP) 등을 사용하였다.
- 혈액은 실험 종결 후 복강대정맥에서 채혈한 후 원심분리 후 얻어진 혈장을 시료로 사용하였다. 혈장 triglyceride는 Muller방법(31)에 준한 효소법에 의한 kit를 사용하였으며, 혈장 total cholesterol은 Richmond방법(32)에 준한 효소법에 의한 kit를 사용하여 각각 550, 500 nm에서 UV spectrophotometer를 사용하여 생화학 검사를 수행하였다.
데이터처리
- 본 실험결과는 각 항목에 따라 평균치±표준오차(standard error, SE)를 구하였으며, Student's t-test로 검증하였으며, p value<0.05는 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
이론/모형
- Cell cytotoxicity test는 Mosmann의 방법(27)을 변형한 Skaper 등의 방법(28)을 응용한 MTT 측정법을 사용하였다. HEM 시료 0～100 μg/mL을 DMSO에 녹인 후 배양된 세포에 처리하여 24시간 배양하였다.
- 단백질 정량은 Bradford법(30)을 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 단백질 함량을 계산하여 세포 내 총 단백질량을 측정하였다.
- 혈액은 실험 종결 후 복강대정맥에서 채혈한 후 원심분리 후 얻어진 혈장을 시료로 사용하였다. 혈장 triglyceride는 Muller방법(31)에 준한 효소법에 의한 kit를 사용하였으며, 혈장 total cholesterol은 Richmond방법(32)에 준한 효소법에 의한 kit를 사용하여 각각 550, 500 nm에서 UV spectrophotometer를 사용하여 생화학 검사를 수행하였다.
성능/효과
- 또한 지방 축적에 관여하는 효소인 GPDH의 활성을 억제함으로써 세포내 지방이 축적되는 것을 억제하였다. 5주간의 동물실험 결과 대조군과 비교하여 HEM1과 HEM2군 모두 체중 변화와 식이효율이 줄어드는 것으로 나타났으며, 혈액 분석에서 HEM군은 혈중 중성지방과 총콜레스테롤에 효과를 보이지 않았다. 해부학적인 측면에서 부고환 및 신장 주위의 지방무게와 간 무게 또한 낮았다.
- HEM의 효과는 체중변화, 식이효율과 혈중 triglyceride와 total cholesterol 측정 및 부고환과 신장 주위의 지방 무게 측정 및 간 무게를 측정하여 판단하였다. HEM 섭취에 따른 체중과 식이효율의 감소는 처리군에서 유의성 있게 감소하였으며 (Table 3), 특히 HEM2는 식이섭취량이 HEM1보다 많았으나 식이효율에서는 낮아 지방축적억제 효과성이 있는 것으로 사료된다.
- HEM1은 대조군과 비교 시 혈중 중성지방과 총콜레스테롤 수치가 각각 38%, 29% 감소되었으나, HEM2는 혈중 중성지방은 대조군보다 증가하였으나 총콜레스테롤은 17% 낮았다(Table 3).
- HEM의 처리 농도가 증가함에 따라 지방축적이 감소가 되었고, 고농도에서도 독성을 보이지 않아 고농도인 100 μg/ mL로 GPDH의 활성을 측정한 결과, 분화유도물질만을 처리한 군(MDI)의 GPDH 활성이 129.36 U/mg으로 처리하지 않은 군(Control)에 비해서 약 5.8배 활성이 증가되었으며, 100μg/mL HEM을 분화유도물질과 함께 처리한 군(MDI＋ HEM)은 분화유도물질만을 처리한 것과 비교 시 GPDH의 활성이 59% 감소되었다(Table 2).
- In vitro 실험으로서 3T3-L1 preadipocyte가 adipocyte로 분화 유도과정에서 0～100 μg/mL 농도로 분화유도물질과 함께 48시간 처리 후 배지를 교환하여 6일 후 Oil-Red O 염색법으로 축적된 지방을 염색하였고, 분화유도물질만을 처리한 군과 비교 시 HEM의 처리 농도가 증가함에 따라 유의적으로 지방축적이 감소되었으며(Fig. 1, 2), 동일 농도에서 세포독성 또한 없음을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 고지방식이만을 섭취한 군과 비교 시 HEM1과 HEM2의 체중 변화는 각각 52%와 50% 낮았으며, HEM2군은 통계학적으로 유의한 차이(p<0.05)를 나타내었다.
- 지방축적에 관여하는 효소인 GPDH 활성을 측정하기 위해서 지방축적 억제율이 높고 세포 독성을 보이지 않은 농도인 100 μg/mL을 선별하여 실험을 하였다. 그 결과 분화유도 물질만을 처리한 군과 비교 시 GPDH 활성이 59 % 감소하였다(Table 2). 전지방세포에서 지방세로 분화가 진행될수록 GPDH 활성은 증가되는 것으로 알려져 있고(25), 반면 GPDH 활성이 감소되면 지방축적이 감소된다고 보고되어져 있다(55-57).
- 3T3-L1 adipocytes의 지방축적율을 조사하기 위하여 배양된 세포에 분화유도물질과 함께 HEM을 0, 20, 40, 60, 80그리고 100 μg/mL로 처리하였다. 그 결과 분화유도물질만을 처리한 것과 비교 시 HEM의 처리 농도가 증가함에 따라 지방세포 내 지방함량은 56, 56, 48, 42 그리고 32%로 감소하였고(Fig. 1), Oil Red O로 염색을 하여 비교하였을 경우에도 HEM의 농도가 증가함에 따라 염색된 지방이 감소함을 알 수 있었다(Fig. 2). 이는 지방세포에 지방이 축적되는 것을 HEM이 억제시키는 것으로 사료된다.
- 05)를 보였다. 또한 간 무게를 측정한 결과 대조군과 비교하여 HEM1과 HEM2는 16%와 2% 낮았으나 유의적인 차이는 보이지 않았다(Table 4).
- 민간요법 중에서 비만 치료에 사용되는 4종의 식물인 지유, 옥발, 적하수오 및 삼백초를 동량으로 혼합하여 10배의 물을 사용하여 가열추출 후 감압농축 하여 HEM을 조제하였고, 이렇게 조제된 HEM을 사용하여 0～100 μg/mL 농도로 3T3-L1의 지방축적 억제율을 측정한 결과 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하였으며, 동일 농도에서 세포독성은 없었다. 또한 지방 축적에 관여하는 효소인 GPDH의 활성을 억제함으로써 세포내 지방이 축적되는 것을 억제하였다. 5주간의 동물실험 결과 대조군과 비교하여 HEM1과 HEM2군 모두 체중 변화와 식이효율이 줄어드는 것으로 나타났으며, 혈액 분석에서 HEM군은 혈중 중성지방과 총콜레스테롤에 효과를 보이지 않았다.
- 민간요법 중에서 비만 치료에 사용되는 4종의 식물인 지유, 옥발, 적하수오 및 삼백초를 동량으로 혼합하여 10배의 물을 사용하여 가열추출 후 감압농축 하여 HEM을 조제하였고, 이렇게 조제된 HEM을 사용하여 0～100 μg/mL 농도로 3T3-L1의 지방축적 억제율을 측정한 결과 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하였으며, 동일 농도에서 세포독성은 없었다.
- 본 연구는 HEM이 지방세포의 분화와 지방축적을 억제하고 지방세포 내의 GPDH의 활성을 억제한다는 결과를 얻었으며, 동물실험에서도 HEM 투여군은 체중 증가가 억제되었다. 이러한 원인은 부고환 및 신장 주위의 지방이 감소한 결과였다.
- 실험 종결 후 군별 조직의 지방의 무게를 측정한 결과, 대조군과 비교하여 HEM1과 HEM2에서 부고환주위의 지방 무게가 각각 7%와 18% 적었으나 유의성은 보이지 않았으며, 신장주위의 지방무게는 44%와 41% 유의적인 감소 (p<0.05)를 보였다.
- 해부학적인 측면에서 부고환 및 신장 주위의 지방무게와 간 무게 또한 낮았다. 이러한 결과를 통해, 본 실험에서 사용한 생약복합물은 항비만 소재로써 체지방 축적억제에 효과성이 있음을 확인하였다.
- 지방조직 무게 측정에서 HEM1과 HEM2군 모두 신장과 부고환주위의 지방량이 대조군보다 적었으며, 간 무게 또한 낮았다(Table 4). 조직주위의 지방량 감소는 체중 감소에 영향을 주고, 체지방 축적과 관련하여 신장과 부고환 주위 지방량이 낮음은 체중감소와 직접적인 연관성이 있다는 결과(58)와 동일하게 본 실험에서도 체중증가 억제 효과가 나타났다.
- 지방조직 무게 측정에서 HEM1과 HEM2군 모두 신장과 부고환주위의 지방량이 대조군보다 적었으며, 간 무게 또한 낮았다(Table 4). 조직주위의 지방량 감소는 체중 감소에 영향을 주고, 체지방 축적과 관련하여 신장과 부고환 주위 지방량이 낮음은 체중감소와 직접적인 연관성이 있다는 결과(58)와 동일하게 본 실험에서도 체중증가 억제 효과가 나타났다.
- 이러한 원인은 부고환 및 신장 주위의 지방이 감소한 결과였다. 혈중 total cholesterol과 triglyceride에는 영향을 주지 않았으며, 이는 HEM이 혈액의 변화에 대한 작용보다는 지방세포 및 이와 관련된 인자에 영향을 주어 지방세포의 감소와 지방축적에 영향을 미쳐 결과적으로 체중이 감소되는 것으로 사료된다.
후속연구
- Cho 등(60)과 Kang 등(61)의 연구에서는 동물실험에서 triglyceride의 감소 효과가 상이하게 나타났으며, Choo와 Shin(62)은 capsaicin의 투여에 의한 total cholesterol과 triglyceride가 동물실험에서 다른 연구자와 상이한 결과가 나타난 것은 식이의 지방함량, 약물의 투여기간 및 방법 그리고 동물의 종과 계통에 의하여 달라질 수 있다고 하였다. 본 연구에서 HEM2군의 triglyceride 수치는 대조군보다 상승하였으나 유의성이 없어 혈중 중성지방의 변화에 영향을 주지 않는 것으로 판단되며(Table 3), Song과 Kim(59)의 결과처럼 약물의 효과가 늦게 나타날 수 있는 점도 고려할 수 있으나 HEM1군에서의 triglyceride의 감소만으로 HEM의 효과성에 대한 근거로는 미약하므로 14주 이상의 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 또한 혈중 total cholesterol은 고지방식이 섭취 시 증가되는데 비해 HEM 처리군에서는 혈중 total cholesterol이 감소하였으며(Table 3), 항비만 효과가 있는 생약제의 섭취는 혈중 total cholesterol을 감소시킨다는 보고(63-65)와 일치하였다.
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