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문제 정의
- 한편 tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily에 속하는 Fas (CD95/Apo-1) 에 FasL (CD95L) 또는 agonistic anti-Fas 항체 7} 결합하면 Fas clustering, Fas-associated death domain protein (FADD) 및 procaspase-8 이 death-inducing signaling complex (DISC)를 형 성하게 되어 caspase-8의 활성화에 의한 caspases cascade에 의하여 apoptosis를 유발하게 된다[10, 22]. 따라서 EAHF 처리에 의한 apoptosis 유발에 death receptor에속하는 유전자들이 관여하는지를 확인하기 위하여 death receptor와 연관성이 매우 높은 몇 가지 유전자들의 발현 변화를 RT-PCR 및 Western blot analysis 방법으로 조사하였다. 그결과 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포 모두에서 death receptor에 속하는 여러 유전자의 발현에는 유의적인 변화가 나타나지 않았다.
- 이 러한 연구를 하고자 하는 목적은 체계적인 연구를 통하여 객관적 자료를 제시함으로서 관련 산업의 발전과 국민의 건강 증진에 톳의 활용을 위한 근거 자료를 제공하고자 함이다. 또한얻어진 결과들을 대상으로 다양한 용도 특허 획득 및 임상적용 가능성을 제시함으로서 국내 . 외적인 국가 경쟁력을 획득할 수 있을 것이라고 사료된다.
- 본 연구에서는 선행 조사를 통하여 다양한 톳의 유기용매분획물 중 비교적 항암활성이 높았던 ethyl alcohol 추출물 (ethyl alcohol extract of H. fusiforme, EAHF) 이 인체유방암 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포들의 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 아울러 EAHF 처리에 의한 유방암세포의 증식억제가 apoptosis 유발과 연관성이 있는지를 확인하였으며, apoptosis 과정에 관여하는 몇 가지 중요한 유전자들의 발현 변화를 조사하여 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 인체 유방암세포주인 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포의 증식에 미치는 EAHF의 영향과 EAHF의 처리에 의한 암세포 증식억제와 연관된 apoptosis 유발 여부 및 apoptosis 유발 조절과 연관된 관련 유전자들의 변화 여부를 조사하였다. 이를 위하여 먼저 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포의 증식에 EAHF가 어떠한 영향을 미치는 지를 알아보기 위해 MTT assay에 의한 세포 증식억제의 정도를 조사한 결과, en 세포주 모두에서 EAHF를 처리하지 않은 군과 비교하여 EAHF의 처리 농도가 증가할수록 암세포의 증식이 현저하게 억제되는 것을 관찰할 수 있었다.
- fusiforme, EAHF) 이 인체유방암 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포들의 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 아울러 EAHF 처리에 의한 유방암세포의 증식억제가 apoptosis 유발과 연관성이 있는지를 확인하였으며, apoptosis 과정에 관여하는 몇 가지 중요한 유전자들의 발현 변화를 조사하여 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
- 의약 신소재로서의 개발 가능성 여부를 지속적으로 조사하여 왔다. 이 러한 연구를 하고자 하는 목적은 체계적인 연구를 통하여 객관적 자료를 제시함으로서 관련 산업의 발전과 국민의 건강 증진에 톳의 활용을 위한 근거 자료를 제공하고자 함이다. 또한얻어진 결과들을 대상으로 다양한 용도 특허 획득 및 임상적용 가능성을 제시함으로서 국내 .
제안 방법
- 48시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (Sigma)를 이용한 MTT assay를 실시하였으며, 세 번의 실험을 통한 평균 값과 표준 오차를 산출하였다. 아울러 48시간 EAHF 처리 후 도립 현미 경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 200배의 배율로 각 농도에 따른 세포의 형태 변화를 관찰하였다.
- Caspase-3, -8 및 -9의 in vitro 활성 측정을 위한 colorimetric assay kits는 R&D Systems (Minneapolis, MN)에서 구입하여제시된 방법에 준하여 활성의 증감 여부를 조사하였다. 이를 위하여 정상 및 EA#가 처리된 배지에서 48시간 배양된 암세포를 모은 뒤 단백질을 추출하고 정 량하여 각각 100 μg의 단백질을 fluorogenic peptide 기질 100 μM이 함유된 extraction buffer [40 mM HEPES (pH 7.
- EAHF 처리에 의하여 apoptosis가 유발된 세포들의 정량적비교를 위하여 준비된 유방암세포들을 PBS로 두세 번 씻어내고, CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 고정 및 염색을 하고 4℃, 암실에서 30분 동안 반응을 시 킨 다음 DNA flow cytometry (Becton Dickinson)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 분석하였다.
- EAHF 처리에 의한 유방암세포의 증식억제 및 형태적 변형이 apoptosis 유발과 연관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 EAHF가 처리된 유방암세포를 대상으로 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 DAPI 염색을 실시하고 형광현미경을 이용하여 핵의 형태 변화를 관찰하였다. Fig.
- EAHF가 인체 유방암 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 EAHF을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 후 MIT assay를 이용하여 조사하였다. Fig.
- , Carlsbad, CA)를 4℃에서 1시간 동안 처 리하여 total RNA를 분리하여 정량한 후, 각각의 primer (Table 1), DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea) 를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 lx TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 100 V에서 전기영동을 한 다음 EtBr을 이용하여 염색한 후 UV 하에서 발현의 변화 여부를 확인하였다.이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다.
- 다음은 EAHF 처리에 따른 유방암세포의 증식억제 현상에 따른 암세포의 형태 변화를 관찰하기 위하여 정상 및 다양한 농도의 EAHF가 처리된 배지에서 48시간 동안 배양된 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포를 도립현미경을 이용하여 관찰하였다. Fig.
- 다음은 extrinsic 및 intrinsic pathway를 포함하는 apoptosis 유발의 전반적인 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 몇 가지 caspases의 활성에 미치는 EAHF의 영향을 조사하였다. 조사된 caspases 중 caspase-8은 death receptor와 연관된 extrinsic pathway의 과정 에서, caspase-9는 미토콘드리아와 연관된 intrinsic pathway에서 initiation caspase로 작용한다.
- 5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 4℃에서 30분간 반응시킨 후 상층액을 분리하고 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 정량 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 정량하였다. 동량의Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들어 sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH)으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, L2차 항체를처리하고 PBS-T로 세척하여 Enhanced Chemiluminoesence (ECL) 용액 (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL)을 적용시 킨 다음 암하에서 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다.
- 따라서 EAHF 처리에 의한 apoptosis 유발의 정도를 정량적으로 비교평가하기 위하여 동일한 조건으로 배양된 세포들을 대상으로 PI 염색액을 이용하여 핵을 염색한 후 DNA flow cytometry를이용하여 세포주기의 sihGl기에 해당되는 세포들의 빈도를조사하였다. Fig.
- 이러한 EAHF에 대한 apoptosis 감수성의 차이는 MCF-7 세포의 경우 apoptosis 유발 단계 에서 G1 arrest 과정에 더 많은 시간이 소모되므로 MDA-MB-231 세포에 비하여 다소 낮은 것으로 추정된다. 또한 염색질 응축과 함께 apoptosis 유발의 직접적인 증거에 해당[25]하는 DNA fragmentation 여부를 agarose gel 전기 영동으로 조사하였다. 이를 위하여 정상 및 EAHF가 함유된 배지에서 자란 암세포의 총 DNA를 대상으로 조사한 결과, MDA-MB-231 세포에서는 apoptosis가 일어난 세포들에서 볼 수 있는 전형적인 DNA laddering을 관찰할 수 있었지만 MCF-7 세포에서는 DNA laddering이 거의 관찰되지 않았다.
- 나타났다. 또한 염색질 응축과 함께 apoptosis 유발의 직접적인 증거에 해당하는 DNA fragmentation 여부를 agarose gel 전기영동으로 조사하였다. 이를 위하여 정상 및 EAHF 가 함유된 배지에서 자란 유방암세포를 대상으로 총 DNA를 추출하여 조사한 결과는 Fig.
- 본 연구실에서는 우리나라에서 자생하는 해조류 중, 남해안에 많이 생육하는 톳(Hizikia fusiformis)의 효능을 과학적 이고객관적인 실험을 통하여 검증함으로서 기능성 식.의약 신소재로서의 개발 가능성 여부를 지속적으로 조사하여 왔다.
- 그 후 phenol : chloroform : isoamyl alcohol 혼합 용액(25 : 24 : 1, Sigma)을 첨가하고 원심 분리하여 얻어진 상층 액에 적정 량의 isopropanol (Sigma)과 5 M NaCl를첨가한 다음 24시간 정도 4℃에서 반응시켰다. 분리된 DNA pellet에 RNase A가 적당량 들어있는 TE buffer를 첨가하여녹이고 gel loading dye (Bioneer, Daejeon, Korea)를 혼합한후 1.5% agarose gel을 이용하여 1시간 정도 50 V로 전기영동하여 ethidium bromide (EtBr, Sigma)로 염색하고 ultra vilolet (UV) 하에서 관찰하였다.
- 조건.상온에서 15분간 염색시킨 후, PBS 및 증류수로 DAPI 용액을 세척한 다음 absolute alcohol을 이용하여 탈수과정을 거친 slide glass 위에 mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss) 을 이용하여 400배의 배율로 각 농도에 따른 유방암 세포의 핵 형태변화를 관찰하였다.
- 48시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (Sigma)를 이용한 MTT assay를 실시하였으며, 세 번의 실험을 통한 평균 값과 표준 오차를 산출하였다. 아울러 48시간 EAHF 처리 후 도립 현미 경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 200배의 배율로 각 농도에 따른 세포의 형태 변화를 관찰하였다.
- 이러한 증식억제는 세포질의 응축 및 부착력 상실에 따른 부유되는 세포의 증가 현상과 더불어 분지를 형성하는 듯한 구조의 형성 등과 같은 형태적 변형을 동반하였다. 이러한 증식억제 및 형태변형이 apoptosis 유발과 관계가 있는지를 확인하기 위하여 DAPI 염색을 이용한 염색질 응축 형성의 유무를 관찰하였다. 정상 배지에서 배양된 세포의 경우 핵의 전체가 완전한 형태로 염색되는 양상을 보였으나 MDA-MB-231 세포의 경우는 EAHF의 농도가 증가할수록 밀도의 감소와 함께 염색체 응축에 의한 apoptosis/} 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 apoptotic body 의 형성 정도가 증가되었다.
- 즉 EAHF의 처리에 따른 유방암세포의 증식의 억제 및 형태변화가 MDA-MB-231 세포에서는 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있을 것으로 생각되지만 MCF-7 세포에서는 apoptosis에 대한 감수성 이 낮음을 알 수 있었다. 이러한 차이를 정량적으로 비교하기 위하여 flow cytometry를 이용한 apoptosis 유발 세포군에 해당하는 sub-G1 기에 속하는 세포들의 빈도를 측정하였다. MDA-MB-231 세포의 경우는 EAHF의 처리 농도의 증가에 따라 sub-Gl기에 해당하는 세포의 빈도가 증가하여 400 μg/ml의 농도에서는 약 23% 정도로 나타났으나 MCF-7 세포에서는 EAHF의 처리 농도의 증가에 따른 sub-Gl7] 세포의 빈도가 소폭 증가하였다.
- 준비 된 암세포에 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA)를 4℃에서 1시간 동안 처 리하여 total RNA를 분리하여 정량한 후, 각각의 primer (Table 1), DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea) 를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 lx TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 100 V에서 전기영동을 한 다음 EtBr을 이용하여 염색한 후 UV 하에서 발현의 변화 여부를 확인하였다.
- 특정 세포에 apoptosis가 유발되었을 때 관찰될 수 있는 DNA fragmentation의 분석을 위하여 정상 및 EAHF가 처리된 배지에서 48시간 동안 배양된 세포를 모아 lysis buffer [5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.5% Triton X-10이를 4℃에서 30분간 처리한 다음, 그 상층액에 proteinase K (Sigma)를 0.5 mg/ml의 농도로 처리한 다음 50℃에서 3시간동안 반응시켰다. 그 후 phenol : chloroform : isoamyl alcohol 혼합 용액(25 : 24 : 1, Sigma)을 첨가하고 원심 분리하여 얻어진 상층 액에 적정 량의 isopropanol (Sigma)과 5 M NaCl를첨가한 다음 24시간 정도 4℃에서 반응시켰다.
대상 데이터
- MDA-MB-231 및 MCF-7 유방암세포는 한국생명공학연구소(KRIBB, Taejeon, Korea)에서 분주 받았으며, 세포 배 양을위해 90%의 RPMI-1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY), 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL)에 1%의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL)이 포함된 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 본 실험에 사용된 톳은 2006년 7월 기장군에서 채집된 것을 동정하여 사용하였으며, EAHF를 얻기 위하여 톳을 흐르는 물로 24시간 동안 세척하여 소금기를 제거하고 깨끗한 물로 수회 세척한 후 그늘에서 5일 동안 건조시켰다.
- 조건 하에서 배양하였다. 본 실험에 사용된 톳은 2006년 7월 기장군에서 채집된 것을 동정하여 사용하였으며, EAHF를 얻기 위하여 톳을 흐르는 물로 24시간 동안 세척하여 소금기를 제거하고 깨끗한 물로 수회 세척한 후 그늘에서 5일 동안 건조시켰다. 건조된 톳을 잘게 분쇄하여 80% ethyl alcohol에 24시간 동안 담가 유효성분을 추출한 다음, 3, 000 rpm으로 20분간 원심 분리시켜 침전물을 제거하였다.
- 준비된 plate를 37℃에서 2시간 동안 반응시 킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm 의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다. 실험에 사용되는 기질은 caspase-3의 경우에는 Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA), caspase-8의 경우에는 Ile-Glu-Thr-Asp (lETD)-pNA이었으며, caspase-9는 Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA 였다.
이론/모형
- Apoptosis 유발은 크게 mitochondrial pathway라고 알려진 intrinsic pathway 및 death receptor path way 로 알려진 extrinsic pathway로 나누어 질 수 있는데, EAHF 처리에 의한 apoptosis 유발이 어느 경로에 의하여 일어나는지를 조사하기위하여 먼저 death receptor에 속하는 유전자들의 발현 변화를 RT-PCR 및 Western blot analysis 방법으로 조사하였다. Fig.
- MDA-MB-231 (A) and MCF-7 (B) cells were seeded at 5xl04/inl in a 6-well plate and incubated for 24 hr. The cells were treated with variable concentrations of EAHF for 48 hr and the growth inhibition was measured by the metabolic-dye-based MTT assay. The data shown are means±SD of three independent experiments.
성능/효과
- 조사하였다. Fig. 1에서 나타난 바와 같이 EAHF이 두 유방암세포에서 처 리 시간 및 농도 의존적으로 증식을 억제하는 것으로 나타났으나 MDA-MB-231 세포에서 EAHF의 세포독성 효과가 MCF-7 세포에 비하여 다소 높게 나타났다.
- 이용하여 관찰하였다. Fig. 2A에서 알 수 있듯 이두 세포주 모두에서 EAHF의 농도가 증가할수록 세포의 밀도가 감소되었으며, 부착력을 상실하고 배지 위로 부유되는 경향성이 증가하는 것과 같은 심한 형태적 변화가 나타났다.
- 이용하여 핵의 형태 변화를 관찰하였다. Fig. 2B에서 나타난 바와 같이 정상 배지에서 배양된 세포의 경우 핵의 전체가 완전한 형태로 염색되었으나 MDA-MB-231 세포의 경우는 EAHF의 처리 농도가 증가할수록 apoptosis가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 염색질 응축의 정도가 매우 증가되었다. 그러나 MCF-7 세포에서는 염색질 응축의 정도가 MDA-MB-231 세포와 비교해서 매우 낮게 나타났다.
- 따라서 EAHF 처리에 의한 apoptosis 유발의 정도를 정량적으로 비교평가하기 위하여 동일한 조건으로 배양된 세포들을 대상으로 PI 염색액을 이용하여 핵을 염색한 후 DNA flow cytometry를이용하여 세포주기의 sihGl기에 해당되는 세포들의 빈도를조사하였다. Fig. 3A 및 B에 나타낸 결과에서 알 수 있듯이MDA-MB-231 세포의 경우는 EAHF의 처리 농도의 증가에 따라 sibGl기에 해당하는 세포의 빈도가 증가하여 400 |ig/ml 의 농도에서는 약 23% 정도로 나타났다.
- Fig. 4의 결과에서 알 수 있듯이 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포 모두에서 조사된 5가지의 대표적인 death receptor 관련 유전자들의 발현은 EAHF 처리에 의하여 아무런 변화가 나타나지않았으며, 이는 EAHF의 처리에 의한 apoptosis 유발에 있어서 death receptor pathway가 관여하지 않을 가능성을 보여주는 결과이다.
- Fig. 7의 결과에서 알 수 있듯이 caspase-8의 활성은두 유방암세포 모두에서 관찰되지 않았으며, caspase-9 및 caspase-3은 특히 MDA-MB-231 세포에서 매우 높게 나타나 Western blot analysis 결과와 유사한 경향성을 보여주었다. 이상의 결과는 EAHF 처리에 따른 apoptosis 유발이 extrinsic pathway 보다는 intrinsic pathway를 통하여 이루어지고 있음을 보여주는 것이다.
- 이러한 증식억제 및 형태변화는 MDA-MB-231에서는 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났지만 MCF-7 세포에서는 apoptosis 유발보다는 G1 기에서의 세포주기 억제와관련이 있는 것으로 나타났다. MDA-MB-231에서의 apoptosis 유발은 pro-apoptotic 유전자인 Bax의 발현 증가와 그에 따른 caspase-9의 활성화와 같은 intrinsic pathway를 거쳐 caspase-3의 활성화 및 기질 단백질들의 분해로 apoptosis가 유발되는 것으로 나타났다. 그러나 MCF-7 세포에서의 세포주기억제 유발은 추가 실험을 통하여 관련 유전자들 간의 발현 변화및 상호 연관성에 대해서 밝혀야 할 것으로 생각된다.
- 3C에 나타낸 바와 같다. 결과에서 나타낸 바와 같이 MDA-MB-231 세포에서는 apoptosis가 일어난 세포들에서 볼 수 있는 전형적인 DNA laddering 현상을 관찰할 수 있었지만 MCF-7 세포에서는 DNA laddering 이거의 관찰되 지 않았다. 이는 결국 MDA-MB-231 세포의 경우는 EAHF의 처리에 의하여 endonuclease가 활성화되어 chromosomal DNA가 단편화되었음을 의미하는 것이며, 동일 조건에서 MCF-7 세포의 경우 apoptosis 유발보다는 세포주기의 G1 arrest 유발 현상이 더 강하게 나타났음을 알 수 있었다.
- 따라서 EAHF 처리에 의한 apoptosis 유발에 death receptor에속하는 유전자들이 관여하는지를 확인하기 위하여 death receptor와 연관성이 매우 높은 몇 가지 유전자들의 발현 변화를 RT-PCR 및 Western blot analysis 방법으로 조사하였다. 그결과 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포 모두에서 death receptor에 속하는 여러 유전자의 발현에는 유의적인 변화가 나타나지 않았다. 이는 EAHF의 처리에 의한 apoptosis 유발에 있어서 최소한 Fas, FasL, TRAIL, DR4 및 DR5 등이 관여하지 않는다는 것을 의미하며, mitochondrial pathway의 관련 가능성이 높음을 보여주는 것이다.
- 다음은 mitochondrial pathway를 포함한 apoptosis 유발 조절에 있어서 가장 대표적인 조절인자로 알려진 Bcl-2 family에 속하는 유전자들이 EAHF의 처리에 의하여 어떠한 변화가 나타나는지를 조사한 결과, anti-apoptotic 인자인 Bcl-2 및 Bc1-Xl의 발현에는 EAHF 처리에 따라 큰 변화가 나타나지 않았지만 세포의 죽음에 관여하는 pro-apoptotic 인자인 Bax의 경우는 두 세포주 모두에서 EAHF 처리 농도가 높아질수록 전사 및 번역 수준에서 발현의 정도가 증가하는 것으로 나타났다. 특히 EAHF에 의하여 apoptosis가 강하게 나타났던 MDA-MB-231 세포에서 Bax의 발현 증가가 더욱 더 강하게나타났다(Fig.
- 그러나 MCF-7 세포에서는 염색질 응축의 정도가 MDA-MB-231 세포와 비교해서 매우 낮게 나타났다. 따라서 EAHF 의 처리에 따른 유방암세포의 증식억제 및 형태변화가 MDA-MB-231 세포에서는 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있을것으로 생각되지만 MCF-7 세포에서는 상대적으로 apoptosis 에 대한 감수성이 낮게 나타남을 알 수 있었다.
- 또 다른 caspase 인 caspase-9의 활성화는 mitochondria 에서 유리된 cytochrome c에 의해서 형성된 apoptosome에 의하여 유발되며 이렇게 활성화된 caspase-9은 caspase-3를 활성화시켜 apoptosis를 일으키는 것으로 알려져 있으며, 많은 선행연구에서 알 수 있듯이 caspases의 활성화가 apoptosis의 유발에 대한 증거가 될 수 있다. 따라서 extrinsic 및 intrinsic pathway 를 포함하는 apoptosis 유발에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 caspase-3, -8 및 -9의 발현 및 활성에 미치는 EAHF의 영향을 Western blot analysis로 조사한 결과 MCF-7 세포에서는 관찰된 모든 caspases의 발현에 EAHF이 아무런 영향을 미치지 못하였지만 MDA-MB-231 세포에서는 EAHF 의 처리에 의하여 intrinsic pathway에 관여하는 것으로 알려진 caspase-3 및 caspase-9의 활성형 단백질의 발현의 증가 또는 비활형성 단백질의 발현 감소가 관찰되었으며, PARP, Pcatenin 및 PLC-yl 등과 같은 단백질의 발현 감소 및 단편화 현상이 EAHF 처리 농도 의존적으로 증가되었다. 하지만 extrinsic pathway에 관여하는 것으로 알려진 caspase-8의 경우는 EAHF 처리에 따른 변화가 관찰되지 않았다.
- 본 연구에서도 EAHF에 의해 caspase-3이 활성화되었다면 특정 기질 단백질의 분해가 일어날 것이므로이를 확인하기 위하여 동일 조건에서 배양된 암세포를 대상으루 Western blot analysis를 통하여 분석한 결과, poly(ADP-ri-bose) polymerase (PARP) 및 P-catenin 단백질의 발현이 MDA-MB-231 세포에서 매우 감소되었으나, phospholipase (PLC)-yl 및 DNA fragmentation factor (DFF) 40/DFF45 의경우는 큰 변화가 없었다. 또한 caspase와의 직간접적인 결합을 통하여 그들의 활성을 억제하는 것으로 알려진 IAP family 에 속하는 주요 인자들의 발현에 미치는 EAHF의 영향을 조사한 결과, 두 유방암세포 모두에서 큰 변화를 관찰할 수 없었다(Fig. 8).
- 그리고 caspase-3은 caspase-9의 활성에 의하여 활성화되거나 자가 활성에 의하여 apoptosis의 최종적인 과정에서 관여한다. 먼저 Western blot analysis에 의한 3가지 종류의 caspase 단백질 발현의 정도를 비교한 결과는, Fig. 6에 나타낸 바와 같이 caspase-3이 결손된 MCF-7 세포의 경우 caspase-8 및 -9의 발현에 EAHF는 큰 영향을 미치지 못하였지만, MDA-MB-231 세포에서는 EAHF의 처리에 의하여 intrinsic pathwaye 개시 단계 에 관여하는 caspase-9의 비활성형 단백 질의 발현이 다소 감소되 었고, caspase-3의 경우 활성 형 의 증가가 뚜렷하게 관찰되었다.
- 활용이 된다. 본 연구에서도 EAHF에 의해 caspase-3이 활성화되었다면 특정 기질 단백질의 분해가 일어날 것이므로이를 확인하기 위하여 동일 조건에서 배양된 암세포를 대상으루 Western blot analysis를 통하여 분석한 결과, poly(ADP-ri-bose) polymerase (PARP) 및 P-catenin 단백질의 발현이 MDA-MB-231 세포에서 매우 감소되었으나, phospholipase (PLC)-yl 및 DNA fragmentation factor (DFF) 40/DFF45 의경우는 큰 변화가 없었다. 또한 caspase와의 직간접적인 결합을 통하여 그들의 활성을 억제하는 것으로 알려진 IAP family 에 속하는 주요 인자들의 발현에 미치는 EAHF의 영향을 조사한 결과, 두 유방암세포 모두에서 큰 변화를 관찰할 수 없었다(Fig.
- 이러한 anti-apoptotic 및 pro-apoptotic member들 사이의 비율에 의하여 생리적 및 병리적인 조건 하에서 세포의 생존및 죽음이 결정되는데, 이 member들 간의 균형이 깨어지게되 면 mitochondria로부터 cytosol로 cytochrome c가 방출되 어 cysteine-related proteases인 caspases, 종양억제 유전자인 p53, DNA의 단편화와 연관된 endonuclease 등의 활성을 조절하여 apoptosis가 유발되는 것으로 알려져 있다[2, 16]. 이 러한 Bcl-2 family에 속하는 유전자들이 EAHF에 의해 유발되는 apoptosis에 있어서 어떠한 영향을 미치는지를 확인한 결과, anti-apoptotic Bcl-2 및 Bc1-Xl의 발현에는 큰 변화가 나타나지않았지 만 대표적인 pro-apoptotic member인 Bax의 경우는 두세포주 모두에서 EAHF 처리에 의하여 유의적으로 증가하는것으로 나타났다. 특히 apoptosis 가 강하게 나타났던 MDA-MB-231 세포에서 Bax의 발현 증가가 더욱 높게 나타났으므로 EAHF 처리에 의한 apoptosis 유발에 있어서 proapoptotic Bax의 증가가 중요한 요인으로 작용하는 것으로 추정 된다.
- 결과에서 나타낸 바와 같이 MDA-MB-231 세포에서는 apoptosis가 일어난 세포들에서 볼 수 있는 전형적인 DNA laddering 현상을 관찰할 수 있었지만 MCF-7 세포에서는 DNA laddering 이거의 관찰되 지 않았다. 이는 결국 MDA-MB-231 세포의 경우는 EAHF의 처리에 의하여 endonuclease가 활성화되어 chromosomal DNA가 단편화되었음을 의미하는 것이며, 동일 조건에서 MCF-7 세포의 경우 apoptosis 유발보다는 세포주기의 G1 arrest 유발 현상이 더 강하게 나타났음을 알 수 있었다.
- 이는 결국 MCF-7 세포에서 보다 MDA-MB-231 세포에서 EAHF의 처리에 의한 chromosomal DNA가 단편화 현상이 높게 나타난 결과이므로 EAHF의 apoptosis 감수성의 차이와도 잘 일치되는 결과이다. 이러한 결과는 EAHF가 암세포의 종류에 따라 G1 arrest 및 apoptosis 에 대한 다양한 감수성 차이를 가질 수 있음을 보여주는 것이고, EAHF에 의한 유방암세포의 증식억제는 결국 G1 arrest와 연관된 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있음을 잘 알 수 있었다.
- 초래하였다. 이러한 증식억제 및 형태변화는 MDA-MB-231에서는 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났지만 MCF-7 세포에서는 apoptosis 유발보다는 G1 기에서의 세포주기 억제와관련이 있는 것으로 나타났다. MDA-MB-231에서의 apoptosis 유발은 pro-apoptotic 유전자인 Bax의 발현 증가와 그에 따른 caspase-9의 활성화와 같은 intrinsic pathway를 거쳐 caspase-3의 활성화 및 기질 단백질들의 분해로 apoptosis가 유발되는 것으로 나타났다.
- 이를 위하여 먼저 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포의 증식에 EAHF가 어떠한 영향을 미치는 지를 알아보기 위해 MTT assay에 의한 세포 증식억제의 정도를 조사한 결과, en 세포주 모두에서 EAHF를 처리하지 않은 군과 비교하여 EAHF의 처리 농도가 증가할수록 암세포의 증식이 현저하게 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 증식억제는 세포질의 응축 및 부착력 상실에 따른 부유되는 세포의 증가 현상과 더불어 분지를 형성하는 듯한 구조의 형성 등과 같은 형태적 변형을 동반하였다.
- 또한 염색질 응축과 함께 apoptosis 유발의 직접적인 증거에 해당[25]하는 DNA fragmentation 여부를 agarose gel 전기 영동으로 조사하였다. 이를 위하여 정상 및 EAHF가 함유된 배지에서 자란 암세포의 총 DNA를 대상으로 조사한 결과, MDA-MB-231 세포에서는 apoptosis가 일어난 세포들에서 볼 수 있는 전형적인 DNA laddering을 관찰할 수 있었지만 MCF-7 세포에서는 DNA laddering이 거의 관찰되지 않았다. 이는 결국 MCF-7 세포에서 보다 MDA-MB-231 세포에서 EAHF의 처리에 의한 chromosomal DNA가 단편화 현상이 높게 나타난 결과이므로 EAHF의 apoptosis 감수성의 차이와도 잘 일치되는 결과이다.
- 하지만 extrinsic pathway에 관여하는 것으로 알려진 caspase-8의 경우는 EAHF 처리에 따른 변화가 관찰되지 않았다. 이상의 Western blot analysis에 의한 결과를 재확인하기 위하여 caspases의 활성 정도를 직접 분석한 결과 MCF-7 세포에서는 EAHF 처리에 따른 caspase-3 및 caspase-9의 활성 증가가 약하게 나타났지 만 MDA-MB-231 세포에서는 EAHF 처리 농도증가에 따라 caspase-3 및 caspase-9의 활성이 매우 강하게 증가되었다. 즉 EAHF 처리에 따른 유방암세포의 apoptosis 유발은 intrinsic pathway를 통한 caspases의 활성화와 직접 관련이 있음을 의미하는 결과이다.
- 7의 결과에서 알 수 있듯이 caspase-8의 활성은두 유방암세포 모두에서 관찰되지 않았으며, caspase-9 및 caspase-3은 특히 MDA-MB-231 세포에서 매우 높게 나타나 Western blot analysis 결과와 유사한 경향성을 보여주었다. 이상의 결과는 EAHF 처리에 따른 apoptosis 유발이 extrinsic pathway 보다는 intrinsic pathway를 통하여 이루어지고 있음을 보여주는 것이다.
- 이상의 결과는 EAHF 처리에 의한 apoptosis 유발에는 pro-apoptotic Bax의 증가에 따른 상대적인 anti-apoptotic 인자들의 발현 저하가 중요한 역할을 하고 있음을의미하는 것이다.
- 이상의 결과에서 EAHF 처리에 의한 유방암세포의 증식억제 현상 및 형태 변화가 특히 MDA-MB-231 세포에서 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다. 따라서 EAHF 처리에 의한 apoptosis 유발의 정도를 정량적으로 비교평가하기 위하여 동일한 조건으로 배양된 세포들을 대상으로 PI 염색액을 이용하여 핵을 염색한 후 DNA flow cytometry를이용하여 세포주기의 sihGl기에 해당되는 세포들의 빈도를조사하였다.
- 이상의 결과에서 EAHF를 인체 유방암세포주인 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포에 처리하였을 경우 세포의 증식을 강하게억제하는 것으로 나타났고 세포의 형태적 변화도 초래하였다. 이러한 증식억제 및 형태변화는 MDA-MB-231에서는 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났지만 MCF-7 세포에서는 apoptosis 유발보다는 G1 기에서의 세포주기 억제와관련이 있는 것으로 나타났다.
- 이러한 증식억제 및 형태변형이 apoptosis 유발과 관계가 있는지를 확인하기 위하여 DAPI 염색을 이용한 염색질 응축 형성의 유무를 관찰하였다. 정상 배지에서 배양된 세포의 경우 핵의 전체가 완전한 형태로 염색되는 양상을 보였으나 MDA-MB-231 세포의 경우는 EAHF의 농도가 증가할수록 밀도의 감소와 함께 염색체 응축에 의한 apoptosis/} 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 apoptotic body 의 형성 정도가 증가되었다. 그러나 MCF-7 세포에서는 밀도의 감소는 관찰되 었지만 염 색질의 응축 정도가 MDA-MB-231 세포와 비교해서 매우 낮게 나타났다.
- 이상의 Western blot analysis에 의한 결과를 재확인하기 위하여 caspases의 활성 정도를 직접 분석한 결과 MCF-7 세포에서는 EAHF 처리에 따른 caspase-3 및 caspase-9의 활성 증가가 약하게 나타났지 만 MDA-MB-231 세포에서는 EAHF 처리 농도증가에 따라 caspase-3 및 caspase-9의 활성이 매우 강하게 증가되었다. 즉 EAHF 처리에 따른 유방암세포의 apoptosis 유발은 intrinsic pathway를 통한 caspases의 활성화와 직접 관련이 있음을 의미하는 결과이다.
- 그러나 MCF-7 세포에서는 밀도의 감소는 관찰되 었지만 염 색질의 응축 정도가 MDA-MB-231 세포와 비교해서 매우 낮게 나타났다. 즉 EAHF의 처리에 따른 유방암세포의 증식의 억제 및 형태변화가 MDA-MB-231 세포에서는 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있을 것으로 생각되지만 MCF-7 세포에서는 apoptosis에 대한 감수성 이 낮음을 알 수 있었다. 이러한 차이를 정량적으로 비교하기 위하여 flow cytometry를 이용한 apoptosis 유발 세포군에 해당하는 sub-G1 기에 속하는 세포들의 빈도를 측정하였다.
- " data-ocr-fix="">것으로 나타났다. 특히 EAHF에 의하여 apoptosis가 강하게 나타났던 MDA-MB-231 세포에서 Bax의 발현 증가가 더욱 더 강하게나타났다(Fig. 5).
후속연구
- MDA-MB-231에서의 apoptosis 유발은 pro-apoptotic 유전자인 Bax의 발현 증가와 그에 따른 caspase-9의 활성화와 같은 intrinsic pathway를 거쳐 caspase-3의 활성화 및 기질 단백질들의 분해로 apoptosis가 유발되는 것으로 나타났다. 그러나 MCF-7 세포에서의 세포주기억제 유발은 추가 실험을 통하여 관련 유전자들 간의 발현 변화및 상호 연관성에 대해서 밝혀야 할 것으로 생각된다. 이러한연구 결과는 톳 추출물의 생화학적 항암기전 해석을 이해하고향후 수행될 추가적인 연구를 위한 기초 자료로 중요하게 사용될 것으로 생각된다.
- 그러나 MCF-7 세포에서의 세포주기억제 유발은 추가 실험을 통하여 관련 유전자들 간의 발현 변화및 상호 연관성에 대해서 밝혀야 할 것으로 생각된다. 이러한연구 결과는 톳 추출물의 생화학적 항암기전 해석을 이해하고향후 수행될 추가적인 연구를 위한 기초 자료로 중요하게 사용될 것으로 생각된다.
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