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문제 정의
- 해조류 다당 성분의 효소 또는 화학적 분해 처리에 의해 기능성 해조 올리고당이 생성되는 것으로 알려져 있다[26]. 본 연구에서는 톳 시료의 전처리 및 유용성분의 유기산 추출을 위하여 유[26]의 방법을 따라 citrate 혹은 lactate를 첨가한 다음 가압과 가온을 동시에 수행하였다. 또한 톳에 포함된 다당을 포함한 유용성분들의 이용성을 높이기 위하여 탄소원으로 포도당을 첨가하여 두 종류의 유산균으로 발효를 수행하였다[26].
제안 방법
- Angiotensin-I converting enzyme 저해활성 측정은 Cushman과 Ondetti [21]의 방법을 변형하여 수행하였다. 즉, 반응구는 0.
- 5 ml를 첨가하였다. Ethyl acetate층만을 취한 다음 용매를 증류시킨 잔사에 2 ml의 증류수를 첨가하여 효소에 의해 기질로부터 분리되어 추출된 hippuric acid를 분광광도계를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정한 후에, 가수분해물 첨가 여부를 다음 식에 따라 백분율로 ACE 저해활성을 나타내었다.
- casei와 Weissella sp. SH-1 균주는 유산균 선택배지인 MRS 액체배지(Difco, USA)에 배양하였고, 멸균된 80% glycerol (Duchefa Biochemie, Netherlands)에 배양액을 1:1로 현탁하여 -80℃ deep freezer (NF-140SF, HFC, Japan)에서 장기보관하였다.
- The cells were pretreated with hot water extracts from fermented Hizikia fusiformis and following by treating with LPS (1 μg/ml) for 48 hr. The nitrite content of culture media was analyzed. Mean±SEM for three tests are shown as nitrite content (%) compared with no sample treatment as 100%.
- 균주를 MRS 액체배지에 접종하여 30℃에서 48시간 배양 후 원심 분리하여 균체를 회수하였다. Wizard Genomic\DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 회수한 균체에서 총세포 DNA를 분리하였다. 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해서 universal primer인 27F (5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)와 1492R (5’-TAG GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)을 사용하여, Lee 등[17]의 방법대로 PCR반응을 수행하였다.
- 발효가 완료된 톳 발효액을 rotary vacuum evaporator(R-200, Buchi, Switzerland)를 이용하여 농축시킨 후, 동결건조장치(FD8518, Ilshin BioBase, Korea)를 이용하여 동결건조하여 발효 톳 건조시료를 얻었다. 건조시료에 각각 10배량(w/v)의 3차 증류수를 첨가한 후, 100℃에서 4시간씩 2회 추출을 수행하였으며, 추출액을 지름 150 mm의 여과지(Advantec, Japan)를 이용하여 2회 여과한 후, rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축시킨 후, 동결건조하여 추출물을 얻었다. 동결 건조한 추출물 10 mg을 3차 증류수 1 ml에 용해한 후, 필터(pore size 0.
- )을 만든 후 MRS 한천배지에 도말하였다. 도말한 배지는 30℃ 배양기에서 2일간 배양하였으며 형태적인 차이를 보이는 집락을 대상으로 균주를 선별하고 분리하였다.
- 본 연구에서는 톳 시료의 전처리 및 유용성분의 유기산 추출을 위하여 유[26]의 방법을 따라 citrate 혹은 lactate를 첨가한 다음 가압과 가온을 동시에 수행하였다. 또한 톳에 포함된 다당을 포함한 유용성분들의 이용성을 높이기 위하여 탄소원으로 포도당을 첨가하여 두 종류의 유산균으로 발효를 수행하였다[26]. 이를 이용하여 톳 발효 추출물을 제조한 결과, glucose+citrate를 첨가한 군에서는 유산균 접종군이 무접종군에 비해 전반적으로 높은 수율을 나타내었다.
- 발효가 완료된 톳 발효액을 rotary vacuum evaporator(R-200, Buchi, Switzerland)를 이용하여 농축시킨 후, 동결건조장치(FD8518, Ilshin BioBase, Korea)를 이용하여 동결건조하여 발효 톳 건조시료를 얻었다. 건조시료에 각각 10배량(w/v)의 3차 증류수를 첨가한 후, 100℃에서 4시간씩 2회 추출을 수행하였으며, 추출액을 지름 150 mm의 여과지(Advantec, Japan)를 이용하여 2회 여과한 후, rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축시킨 후, 동결건조하여 추출물을 얻었다.
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분리된 균주의 DNA 추출 및 16S rRNA 유전자 분석
분리된 균주를 동정하기 위해서 16S rRNA 유전자를 분석하였다. 균주를 MRS 액체배지에 접종하여 30℃에서 48시간 배양 후 원심 분리하여 균체를 회수하였다.
- 새로운 배지로 교체한 다음 시료를 최종농도50, 100, 500, 1,000 μg/ml로 첨가하여1시간 동안 전처리한 후에 NO 생성을 유도하기 위하여 lipopolysaccharide (LPS, final concentration: 1 μg/ml)를 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 48시간 동안 배양하였다. 상등액을 Griess reagent (Sigma, USA)와 1:1로 혼합하여 15분 동안 실온에 방치한 후, ELISA Reader (Multiskan GO, Thermo Scientific, Finland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한 후에 생성된 NO의 양을 계산하였다.
- 새로운 배지로 교체한 다음 시료를 최종농도50, 100, 500, 1,000 μg/ml로 첨가하여1시간 동안 전처리한 후에 NO 생성을 유도하기 위하여 lipopolysaccharide (LPS, final concentration: 1 μg/ml)를 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 48시간 동안 배양하였다.
- 5%의 농도로 첨가한 후, 121℃의 가압 조건에서 30분간 멸균하였다. 여기에 2종의 발효균을 각각 0.05%의 농도로 접종한 후 30℃ 배양기에서 30일간 배양하여 톳 발효액을 제조하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 PCR/Gel Combo Kit (NucleoGen, Siheung, Korea)를 사용하여 정제하였다. 염기서열 분석은 코스모진텍사(Cosmo Gene Tech, Korea)에 의뢰하였으며, National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA)의 BLAST를 사용하여 16S rRNA 유전자 단편의 염기서열의 상동성을 근거로 분리된 균주들을 동정하였다.
- 15 mM DPPH 용액(70% ethanol에 용해) 100 μl 혹은 70% ethanol 100 μl를 첨가하여 총액의 부피가 200 μl가 되도록 하였다. 이 반응액을 37℃에서 30분 방치한 후 분광광도계(UV/VIS spectrometer, Jasco, Japan)를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정한 후에, 대조군에 비하여 감소된 흡광도로부터 라디칼 소거율을 계산하였다. 양성대조군으로 3,5-di-tert-4-butylhydroxytoluene(BHT, Sigma, USA)를 사용하였다.
- 한국 재래식 물김치에서 유산균 선택배지인 MRS 배지를 이용하여 약 10,000개의 세균 군락을 분리하였다. 이 중 9개의 세균을 순수분리하고 총세포 DNA를 분리하여 16S rRNA 서열을 분석하였다. 분석된 염기서열로 기존에 보고되어 있는 염기서열들과의 상동성을 분석한 결과, 9개의 세균 모두 Weissella 속의 한 종으로 밝혀졌으며, 이중 하나를 Weissella sp.
- 이에 본 연구에서는 우리나라에 자생하는 대표 갈조류인 톳을 대상으로 2종의 발효균주를 이용하여 여러 조건에서 발효를 수행하였으며, 톳 발효물의 열수 추출물에 대한 항산화 활성(DPPH 소거능, SOD), ACE 저해활성 및 NO 생성억제 활성 등의 생리활성을 측정하고 비교하였다.
- 재래식 물김치에 존재하는 유산균을 분리하기 위해서 물김치의 상등액을 멸균수로 희석하여 희석현탁액(10-1~10-3)을 만든 후 MRS 한천배지에 도말하였다. 도말한 배지는 30℃ 배양기에서 2일간 배양하였으며 형태적인 차이를 보이는 집락을 대상으로 균주를 선별하고 분리하였다.
- 즉, 추출물 100 μl에 0.15 mM DPPH 용액(70% ethanol에 용해) 100 μl 혹은 70% ethanol 100 μl를 첨가하여 총액의 부피가 200 μl가 되도록 하였다.
- 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해서 universal primer인 27F (5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)와 1492R (5’-TAG GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)을 사용하여, Lee 등[17]의 방법대로 PCR반응을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 PCR/Gel Combo Kit (NucleoGen, Siheung, Korea)를 사용하여 정제하였다. 염기서열 분석은 코스모진텍사(Cosmo Gene Tech, Korea)에 의뢰하였으며, National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA)의 BLAST를 사용하여 16S rRNA 유전자 단편의 염기서열의 상동성을 근거로 분리된 균주들을 동정하였다.
- Superoxide dismutase 유사활성은 Marklund [20]의 방법에 따라 측정하였다. 톳 발효추출물 0.2 ml에 0.05 M Tris-HCl buffer 2.6 ml과 pyrogallol 0.2 ml을 넣고 37℃에서 10분간 반응을 시킨 다음 1 N HCl 0.1 ml를 넣어 반응을 정지시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 저해율(%)은 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 나타내었다.
- 한국 재래식 물김치에서 유산균 선택배지인 MRS 배지를 이용하여 약 10,000개의 세균 군락을 분리하였다. 이 중 9개의 세균을 순수분리하고 총세포 DNA를 분리하여 16S rRNA 서열을 분석하였다.
- 항산화활성의 대표적인 지표인 radical 소거활성(radical scavenging activity)은 Blois [4]의 방법을 변형하여 톳 발효추출물에 대한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)의 전자공여능으로 측정하였다. 즉, 추출물 100 μl에 0.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 톳(Hizikia fusiformis)은 파라제주(Jeju, Korea)에서 판매하는 것을 구입하여 사용하였으며, 탈염된 톳 건조물을 초미세 기류식 분쇄기(KMS-200, Korea)로 분쇄한 다음 밀봉하여 4℃에 보관하면서 사용하였다.
- 이 반응액을 37℃에서 30분 방치한 후 분광광도계(UV/VIS spectrometer, Jasco, Japan)를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정한 후에, 대조군에 비하여 감소된 흡광도로부터 라디칼 소거율을 계산하였다. 양성대조군으로 3,5-di-tert-4-butylhydroxytoluene(BHT, Sigma, USA)를 사용하였다.
데이터처리
- 분산분석(ANOVA) 후에 Fisher's PLSD의 다중범위 유의성 검증을 실시하였고, p<0.05 이상의 수준에서 유의성을 검증하였다.
- 연구결과로 얻어진 자료는 Macintosh용 통계프로그램인 Aabel 2.0 (Gigawiz Ltd Co., USA)을 이용하여 하위그룹 각각의 기술 통계치(Mean ± SEM)를 산출하였다.
이론/모형
- 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해서 universal primer인 27F (5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)와 1492R (5’-TAG GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)을 사용하여, Lee 등[17]의 방법대로 PCR반응을 수행하였다.
- Superoxide dismutase 유사활성은 Marklund [20]의 방법에 따라 측정하였다. 톳 발효추출물 0.
성능/효과
- SH-1 접종군에서 100~1,000 μg/ml 농도의 추출물이 15.43~46.53%의 억제능을 나타내었고, 무접종군과 비교한 결과 통계적으로 유의한 억제능 증가를 보였다(p<0.05).
- SH-1 접종군에서 500~1,000 μg/ml 농도의 추출물이 26.04~43.44%의 억제능을 나타내었고, 무접종군과 비교한 결과 통계적으로 유의한 억제능 증가를 보였다(p<0.05).
- SH-1 접종군은 각각 53.96% 및 59.25%로 높은 SOD 유사활성을 보여(p<0.05), 분리 균주가 톳의 SOD 유사활성을 증진시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.
- casei 혹은 Weissella sp. SH-1 접종군의 추출물이각각 25.27% 및 24.17%로 가장 높은 수율을 보였고, glucose+lactate를 첨가한 L. casei 접종군의 추출물이 13.26%로 가장 낮은 수율을 나타내었다(Table 1).
- SH-1 접종군이 glucose, glucose+lactate, glucose+citrate 등의 모든 첨가군에서 전반적으로 가장 좋은 활성을 보였으며 500, 1,000 μg/ml에서는 무접종군에 비해 높은 통계적 유의성을(p<0.001) 보였다.
- SH-1 접종군이 무접종군에 비해 추출물 100 μg/ml 이상의 농도에서 통계적으로 좋은 활성을 보였으며 500, 1,000 μg/ml에서는 무접종군에 비해 높은 통계적 유의성을 보였다(p<0.05).
- SH-1 접종군이 발효 추출물 1,000 μg/ml 농도에서 82.25%의 ACE 저해활성을 보였으며 무접종군에 비해 약 1.4배 높은 활성을 보였다.
- 넷째 L. casei 접종군은 무접종군과 비교했을 때, 전반적으로 통계적으로 유의한 NO 생성 억제능의 향상을 나타내지 않았으나, glucose 첨가군의 경우에는 1,000 μg/ml의 추출물 농도에서는 통계적으로 유의한 가장 높은 값인 65.20%의 NO 생성 억제능을 보였다(p<0.05).
- 넷째 L. casei 접종군을 무접종군과 비교했을 때, glucose 첨가군에서는 모든 추출물 농도에서 유의적인 효과가 없었고 glucose+lactate 첨가군에서는 추출물 1,000 μg/ml의 농도에서만 유의적인(p<0.001) ACE 저해활성이 관찰되었다.
- 본 연구에서는 500 및 1,000 μg/ml의 농도에서 30.49~72.84%의 항산화 활성을 보였고, 특히 glucose+lactate를 첨가한 L. casei 접종군은 각각 50.76% 및 72.84%로 높은 항산화 활성을 보였다(p<0.001).
- 본 연구에서는 glucose를 첨가한 L. casei 접종군에서는 50, 100, 1,000 μg/ml에서 무접종군에 비해 NO 생성 억제 효과가 통계적으로 확인되었다(p<0.001).
- 셋째 L. casei 접종군은 무접종군과 비교했을 때, 전반적으로 통계적으로 유의한 SOD 유사활성의 개선을 나타내지 않았으나, glucose+ citrate 첨가군의 경우에는 100 μg/ml까지의 낮은 추출물 농도에서는 통계적으로 유의한 SOD 유사활성의 개선을 보였다(p<0.05).
- 셋째 L. casei 접종군은 무접종군에 비해 추출물 500 μg/ml 이상의 농도에서 전반적으로 통계적으로 유의한 활성차이를 나타냈으며 500, 1,000 μg/ml에서는 무접종군에 비해 통계적 유의한 높은 활성 차이를 보였다(p<0.05).
- 또한 톳에 포함된 다당을 포함한 유용성분들의 이용성을 높이기 위하여 탄소원으로 포도당을 첨가하여 두 종류의 유산균으로 발효를 수행하였다[26]. 이를 이용하여 톳 발효 추출물을 제조한 결과, glucose+citrate를 첨가한 군에서는 유산균 접종군이 무접종군에 비해 전반적으로 높은 수율을 나타내었다. 특히, glucose+citrate를 첨가한 L.
- 첫째 전반적으로 추출물의 농도가 증가할수록 ACE 저해활성이 증가하였으며 추출물의 농도가 50, 100, 500 μg/ml에서는 양성대조군인 captopril과 유사하거나 높은 활성을 보였다.
- 톳의 발효 여부에 따른 NO 생성 억제능을 동일한 첨가물 종류와 농도에서 비교한 결과는 다음과 같았다. 첫째 전반적으로 추출물의 농도가 증가할수록 NO 생성 억제능이 증가하였다. 둘째 glucose+lactate를 첨가한 Weissella sp.
- 톳의 발효 여부에 따른 SOD 유사활성을 동일한 첨가물의 종류와 농도에서 비교한 결과는 다음과 같았다. 첫째 전반적으로 추출물의 농도가 증가할수록 SOD 유사활성이 증가하였으며, 10.8~59.2%의 활성을 보였다. 둘째 Weissella sp.
- 톳의 발효 여부에 따른 DPPH 전자공여능을 동일한 첨가물 종류와 농도에서 비교한 결과는 다음과 같았다. 첫째 전반적으로 추출물의 농도가 증가할수록 항산화 활성이 증가하였으며, 11.98~72.84%의 활성을 보였다. 둘째 glucose를 첨가한 Weissella sp.
- 001). 특히 1,000 μg/ml의 농도에서 glucose를 첨가한 L. casei 접종군에 65.20%로 높은 NO 생성 억제 효과를 보였다.
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