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문제 정의
- 예를 들어, 알카로이드 (alkaloids), 후라보노이드 (flavonoids), 피토알렉신 (phytoalexin), 항균펩타이드에 대한 연구보고와 유기산과 지방산 등의 항균성에 대한 보고가 있으며, 이들 물질의 항균작용은 산의 pH에 의한 효과 및 킬레이트 에 의한 효과가 주 항균 메커니즘일 것으로 추정했다(2, 3). 본 연구에서는 꿀풀과의 다년생 초본식물인 황금(黃苓)의 에탄올 추출물이 화장품 오염세균에 대해 갖는 항균효과를 연구하였다. 황금 (Scutellaria baicalensis George)은 그 뿌리가 노란색이며 오래 전부터 동양의학 문헌에 각종 염증에 대한 효과가 알려져 왔다.
- 황금은 그 약리작용인 항산화, 항암, 항염효과(4) 및 신경보호 (neuroprotective) 기능(5) 뿐만 아니라 아토피성 피부용 한방화장품 제형화 연구에서 황금추출물의 안정성과 기능성 강화에 기능에 대해 보고되었다(6). 본 연구에서는 황금 추출물이 기존의 파라벤류 방부제를 대체할 수 있는 천연방부제로 사용될 수 있는 가능성을 탐색하고 또한 항산화 효과를 검증하였다.
제안 방법
- S. aureus, P. aeruginosa 및 C. albians를 각각 50 mL 액체배지에 접종하고 35℃에서 24시간 배양한 후 각각 고체 배지에 균일하게 도말하였다. 그리고 멸균된 8 mm paper disk를 0, 1, 5, 10 wt%로 농도를 달리한 황금추출용액에 침지하여 포화시킨 후 고체배지 위에 일정한 간격으로 놓고 35 ℃ 에서 24시간 배양시킨 후 disk 주위의 clear zone의 직경을 측정하였다.
- S. aureus, P. aeruginosa 및 C. albicans가 접종된 두 종류의 화장품 (skin toner 와 skin lotion)을 고체 배지에 희석, 도말하여 균수를 측정하였다. 각 균주에 대하여 방부제가 첨가되지 않은 control과 paraben계열의 화학 방부제가 첨가된 positive control 그리고 0.
- wt%의 황금추출물 첨가하고 24시간 경과 후 각 균주의 형태적 변화를 전계방출형 주사전자현미경 (Field Emission-Scanning Electron Microscope)으로 관찰하였다. Sampling한 균주를 건조한 분말시료를 3분간 Pt-coating한 후 FE-SEM (LEO SUPRA 55, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 x50000 및 x 100000, x 150000 배율로 촬영하였다.
- 10 . wt%의 황금추출물 첨가하고 24시간 경과 후 각 균주의 형태적 변화를 전계방출형 주사전자현미경 (Field Emission-Scanning Electron Microscope)으로 관찰하였다. Sampling한 균주를 건조한 분말시료를 3분간 Pt-coating한 후 FE-SEM (LEO SUPRA 55, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 x50000 및 x 100000, x 150000 배율로 촬영하였다.
- albicans가 접종된 두 종류의 화장품 (skin toner 와 skin lotion)을 고체 배지에 희석, 도말하여 균수를 측정하였다. 각 균주에 대하여 방부제가 첨가되지 않은 control과 paraben계열의 화학 방부제가 첨가된 positive control 그리고 0.1, 0.5 및 1.0 wt% 농도의 황금추출물이 첨가된 세가지, 즉 총 다섯 가지 경우에 대해 시간에 따른 균수 (CFU/mL)의 변화를 측정하고 CTFA법을 기준한 방부력테스트 (즉 7일 이내 접종 균수의 99.9%가 사멸)를 통과하기 위해 필요한 황금 추출물의 농도를 결정하였다(Fig. 2-4).
- albians를 각각 50 mL 액체배지에 접종하고 35℃에서 24시간 배양한 후 각각 고체 배지에 균일하게 도말하였다. 그리고 멸균된 8 mm paper disk를 0, 1, 5, 10 wt%로 농도를 달리한 황금추출용액에 침지하여 포화시킨 후 고체배지 위에 일정한 간격으로 놓고 35 ℃ 에서 24시간 배양시킨 후 disk 주위의 clear zone의 직경을 측정하였다.
- 및 사용하였다. 멸균된 3차 증류수에 동결건조된 황금을 희석시켜 농도별 (1, 5, 및 10 wt%)로 황금추출액을 제조하였다.
- 방부제 유효성 측정실험에는 (주)아마란스 (Busan, Korea)에서 skin toner와 skin lotion의 base물질을 제공받아 사용하였으며, SOD유사활성 (Superoxide dismutase-like activity) 평가실험에는 pyrogallol (Sigma-Aldrich Co., USA)을 사용하였다 세포형태변화 Field Emission-Scanning Electron Microscope (LEO SUPRA 55, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였고, SOD유사활성 평가는 UV/vis spectrophotometer (UVmini-1240, SHIMADZU, Japan)를 이용하였다.
- 9%가 사멸되면 방부제로서의 유효성을 인정하는 방법이다. 본 실험에서는 세균 5 X 106 CFU/mL와 진균 5 * 105 CFU/mL 를 각각 skin toner 와 skin lotion화장품에 접종시켜 35℃, 100 rpm으로 조정된 shaking incubator에 두고 0, 3, 12 시간과 1~7일까지 샘플을 취하여 고체배지에서 균일하게 도말한 후 colony수를 측정하였다.
대상 데이터
- 대아약업사 (Daegu, Korea)에서 구입한 황금 (50 g)을 70% 에탄올과 1 : 5 (wt%)의 비율로 혼합하여 속시렛주줄기 (Soxhelet Device SEW 600, 창신과학, Korea)를 이용하여 추출하였으며, 그 추출물을 동결건조하여 보관 및 사용하였다. 멸균된 3차 증류수에 동결건조된 황금을 희석시켜 농도별 (1, 5, 및 10 wt%)로 황금추출액을 제조하였다.
- 황금추출액의 항균력 검색 실험에 사용된 균주는 그람양성균인 Staphylococcus aureus (ATCC 25923), 그람음성균인 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) 및 진균인 Candida albicans (ATCC 10231)이었으며 다림바이오텍(Seoul, Korea)에서 분양 받았다 계대배양을 위한 액체배지로는 S. aureuse- P. aeruginosa는 Nutrient broth (Difco, USA) 를 사용하였고, C. albicans는 YM broth (Difco, USA)를 이용하였다.
이론/모형
- SOD 유사활성은 Marklund의 방법에 따라 측정하였다 (9). 각 시료용액 0.
- 방부제의 유효성 측정에 사용되는 방법 중 미국 화장품협회의 방법, 즉 CTFA (The cosmetics, Toiletry, and Fragrance Association)법을 기준으로 테스트하였다(8). CTFA법은 100 g의 용기에 화장품 50 g을 넣고 세균은 106~107 CFU/mL, 진균은 105~106 CFU/mL을 접종하여 7일 이내에 처음 접종 균수의 99.
- 황금추출물의 항균력 시험은 disk method를 이용하였다(7). S.
성능/효과
- 5 wt% 황금추출물이 5일째에 접종된 균을 완전 사멸시켜 CTFA기준에 적합하였다. C. albicans 가 접종된 skin lotion에서는 positive control의 경우만 접종된 균이3일 만에 완전 사멸되었고 황금추출물을 첨가한 경우는 1.0 wt%의 농도에서도 CTFA기준에 적합하지 않았다(Fig. 4).
- C. albicans가 접종된 skin toner에서는 1.0 wt% 황금주줄물은 접종된 균을 3일 만에 완전 사-멸시켰고, positive control이 4일 째, 0.5 wt% 황금추출물이 5일째에 접종된 균을 완전 사멸시켜 CTFA기준에 적합하였다. C.
- 9% 감소율을 보여 positive control보다 방부력이 더 강하였다. P- aeruginosae 접종된 skin lotion에서도 positive control, 0.5 wt%, 1.0 wt% 황금추출물에서 CTFA 기준에 적합하였다(Fig. 3).
- P. aeruginosae)- 접종된 skin toner에서도 positive control과 0.5 wt%, 1.0 wt% 황금추출물을 첨가한 경우에 CTFA 기준에 적합하였다 특히 L0 wt% 황금추출물은 3일 후에 이미 99.9% 감소율을 보여 positive control보다 방부력이 더 강하였다. P- aeruginosae 접종된 skin lotion에서도 positive control, 0.
- 0 wt% 황금추출물은 화학 방부제가 첨가된 positive control군과 비슷하거나 더 빠른 감소율을 보였다. S. aurei/s가 접종된 skin lotion에 대해서는 positive control과 1.0 wt% 황금추출물에서만 CTFA 기준에 적합하였다(Fig. 2).
- S. aureuse)- 접종된 skin toner의 경우 positive control 과 0.5 wt% 및 1.0 wt% 황금추출물을 첨가하였을 때 접종된 균수가 7일 후 99.9%이상 감소되어 방부력 테스트의 기준에 적합하였다 특히 1.0 wt% 황금추출물은 화학 방부제가 첨가된 positive control군과 비슷하거나 더 빠른 감소율을 보였다. S.
- Skin toner와 skin loti on 5] 두 가지 화장품 formulation에 기존의 파라벤류 방부제 대신 황금 (黃苓) 추출물 (1.0 wt%)을 첨가하고 Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) 및 Candida albicans (ATCC 10231) 균주를 접종하였을 때 이 균주들은 7일 이내에 99.9% 이상의 사멸율을 보여 황금 추출물이 CTFA기준을 만족하는 항균력이 있음을 확인하였다. 다만 skin lotion 에 접종된 Candida al bicans 의 경우 사멸율은 CTFA기준에 약간 미달하는 99.
- aerwgzRosa 에 대하여 더 큰 방부력을 갖는 것은 이 균주의 세포막이 황금추출물에 의해 더 심하게 손상되기 때문으로 사료된다. 고농도의 황금추출물이 더 높은 항산화 효과를 나타냈으며 1,000 ppm에서 80%정도의 SOD- 유사활성을 나타내었다.
- 균주를 도말한 고체배지 위에 0, 1, 5, 10 wt%로 농도를 달리한 황금추출물에 침지된 disk paper를 놓고 배양시켜 S. aureus, P. aeruginosa 및 C. albicans'^ 대한 황금 추출물의 항균력을 측정한 결과 disk paper 주위의 clear zone의 크기가 황금추출물의 농도가 높을수록 커지는 것을 확인하였다(Fig. 1).
- 동일한 황금추출물의 농도에서 균주별 반응을 비교하면 skin toner의 경우 0.1 wt%의 황금추출물을 첨가하였을 때 제 7일 째 균주의 생존율은 S. aureus 0.42%, C. albicans 0.22%, P. aeruginosa 0.012%의 순서로 낮아졌다(Table 1). Skin lotion의 경우 0.
- 8%이었다. 또한 황금 추출물의 농도가 1.0 wt% 이하일 때 균주의 생존율은 그람 양성균인 S. wrez/s가 가장 높고 그람 음성균인 P- aeruginosa가 가장 낮았다. 전계방출형 주사전자현미경 (FE-SEM)을 이용한 세포형태변화 관찰 결과 황금 추출물이 P.
- 008%) 이었다 (Table 2). 이러한 결과를 종합할 때 황금 추출물의 방부력은 R aen/g汤osa에 대하여 가장 강한 반면 S. aureus에 대하여 가장 작았다. 이것eS.
- 이상의 결과로 1.0 wt% 황금추출물은 skin lotion에 C. albicans을 접종한 경우에 사멸율 (99.8%)이 CTFA 기준 (99.9%)에 약간 미달한 것을 제외하고는 모든 균에 대해 CTFA법의 기준에 만족하는 방부력이 있는 것으로 알 수 있었다
- 8). 황금 추출물의 이러한 결과는 문헌상에 보고된 다른 물질의 항산화 능력, 즉, 사과 착즙액의 14.6%, 케일 농축액의 26.7%, 키위 착즙액의 27.6%, 무 착즙액의 24.1%(10), 소엽 (Perilla fructescenes var. acuta) 주줄물 1,000 ppm에서의 25%(11), 한국산 약용식물의 20%미만(12)과 비교할 때 높은 수준이었다.
- 황금추출물 (1.0 wt%)로 처리 한 S. aureus, P. aeruginosa 및 C. albicans과 처리하지 않은 대조구 세포들을 전계 방출형 주사전자현미경 (FE-SEM)으로 비교 관찰한 결과 황금 추출물로 처리 된 균주들의 세포막이 파괴되었고 그람 양성균인 S. az/rez/s 보다 P. aeruginosa 와 C. al bicans 의 경우 세포의 팽창 정도가 더 심하였다(Fig. 5-7).
- 황금추출물의 항산화 능력은 그 농도에 따라 증가했고 1, 000 ppm에서 약 80%의 활성을 나타내었다(Fig. 8). 황금 추출물의 이러한 결과는 문헌상에 보고된 다른 물질의 항산화 능력, 즉, 사과 착즙액의 14.
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