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문제 정의
- NO− 생성량 측정, PGE2 측정을 통해 섬유아세포에서 피부면역에 미치는 효과를 알아보고 더 나아가 향장소재와 관련된 분야에 활용하기 위한 기초 자료로 이용하고자 연구를 수행하였다.
- 복분자 추출물에 대해 PGE2가 농도 의존적으로 감소하였으므로, 복분자 초고압 추출물이 피부 염증 물질 감소 효과를 가지는 것을 확인하였으나 추가적인 연구를 통해 추출물의 특이적 binding을 조사하고 메커니즘을 밝힘으로써 활성을 탐색하는 실험이 진행되어야 할 것으로 사료된다. 본 연구는 초고압 추출 공정을 통한 복분자의 피부세포 보호 효과를 관찰한 최초 연구로서 가치가 있다.
제안 방법
- 이 현탁액에 aspirin을 50 µM이 되도록 첨가하여 세포에 잔존하는 COX-2 효소의 활성을 비가역적으로 억제시켜 PGE2 양을 동일하게 조절하였다.
- 45 ㎛ 막 filter로 여과하여 200 ppm의 농도로 측정하였다. HPLC 기기는 Waters (High Performance Liquid Chromatograph, USA)를 사용하여 분석하였다. Column은 C18 5 µ, 용매는 정제된 water와 acetonitril을 8 : 2 비율로 조제하여 사용하였고, 유속은 0.
- Nitrite의 표준물질로는 sodium nitrite를 사용하였으며 농도는 0.25 µM에서부터 4 µM까지 DMEM 배지로 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다.
- 배양 후 세포를 well 바닥에 부착시키고, 부착된 세포를 PBS(phosphate buffered saline)으로 2회 세척한 후, 표면에 남아있는 세포를 실험에 사용하였다. PGE2 Express EIA Short kit를 이용하였으며, 항 PGE2 항체가 부착되어 있는 plate의각 well에 회수한 상층액과 함께 PGE2-acetylcholinesterase tracer를 넣어 상온에서 18시간 배양하고, 각 well에 남아있는 용액을 말끔히 털어낸 후, 0.05% tween 20-phosphate buffer solution으로 각 well을 5회 세척하고 Ellman 시약 200 ㎕를 각 well에 넣은 후 7시간 배양하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. PGE2를 표준품으로 검량선을 작성하여 각각의 시료를 처리한 배양액에서의 PGE2 생성량을 구하였다.
- 05% tween 20-phosphate buffer solution으로 각 well을 5회 세척하고 Ellman 시약 200 ㎕를 각 well에 넣은 후 7시간 배양하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. PGE2를 표준품으로 검량선을 작성하여 각각의 시료를 처리한 배양액에서의 PGE2 생성량을 구하였다.
- , 2008). 기존의 방법대로 추출한 추출물은 NE로, 초고압 추출물은 5분, 15분 각각 HPE5, HPE15로 표기하였다.
- 이 현탁액에 aspirin을 50 µM이 되도록 첨가하여 세포에 잔존하는 COX-2 효소의 활성을 비가역적으로 억제시켜 PGE2 양을 동일하게 조절하였다. 다음으로 세포 현탁액과 시료를 96 well 세포 배양관 각 well에 20 ㎕씩 첨가하고 37℃, 습도 5% CO2 배양기에서 UV filter (Coralife, 35W, UV) 를 이용하여 UVA (6.3 J/㎠)를 2시간 동안 조사하였다. 배양 후 세포를 well 바닥에 부착시키고, 부착된 세포를 PBS(phosphate buffered saline)으로 2회 세척한 후, 표면에 남아있는 세포를 실험에 사용하였다.
- 7 대식세포이며, 세포는 10% heat-inactivated bovine serum과 90% DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)을 이용하여 24well plate에 4~5×104 cells/well의 농도로 넣은 다음, 시료를 첨가하거나 첨가하지 않고 5% CO2 incubator안에서 37℃에서 48시간동안 배양하여 실험에 사용하였다. 대식세포에서 발생되는 nitric oxide의 양은 활성화된 대식세포 배양액에 축적되어 있는 nitrite의 양을 microplate assay를 이용하여 정량함으로서 측정하였다. 먼저 시료를 처리하고 48시간 동안 세포를 배양하고 상등액 50 ㎕를 취하여 동일부피의 Griess시약 (1% sulfanilamide/0.
- 대식세포의 NOS (nitric oxide synthase)는 항상 존재하는 것이 아니라 TNF-γ (tumor necrosis factor-γ), TNF-α (tumor necrosis factor-α)와 같은 여러 가지 cytokine과 LPS (E. coli derived lipopolysaccharide)와 같은 세균 내 독소의 영향을 받아 NOS 유전자의 발현이 유도되기 때문에 시료를 LPS와 같이 투여하여 NO−의 생성능을 확인하였다.
- 초고압 추출이 끝난 시료를 각각 수직 환류 냉각기에 부착된 추출 flask에 시료 중량에 대하여 각각 10배의 증류수를 추출용매로 사용하여 100℃에서 24시간 추출하였다. 대조군으로는 복분자 50 g을 초고압 추출과정은 제외하고 나머지는 같은 조건인 100℃에서 24시간 열수 추출하였다. 얻어진 추출물들을 감압여과장치 (Rotary Vacuum Evaporator N-N series, EYELA, Germany)로 여과하여 농축을 하였고, 동결건조를 한 후에 실험에 사용하였다 (Kim et al.
- 대식세포에서 발생되는 nitric oxide의 양은 활성화된 대식세포 배양액에 축적되어 있는 nitrite의 양을 microplate assay를 이용하여 정량함으로서 측정하였다. 먼저 시료를 처리하고 48시간 동안 세포를 배양하고 상등액 50 ㎕를 취하여 동일부피의 Griess시약 (1% sulfanilamide/0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride/2.5% H3PO4)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader (Molecular Devices, USA)를 이용하여 540㎚의 흡광도를 측정하였다. Nitrite의 표준물질로는 sodium nitrite를 사용하였으며 농도는 0.
- 0 ㎎/㎖로 100 ㎕씩 첨가하여 48시간 배양하였다. 배양이 완료 된 후에 상등액을 제거하고 차가운 10% (w/v) TCA (trichloroacetic acid)를 100 ㎕ 가하여 4℃에서 1시간동안 방치한 후 증류수로 4~5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온에서 plate를 건조한 뒤 각 well에 1% (v/v) acetic acid에 녹인 0.4% (w/v) SRB용액을 100 ㎕씩 첨가하고 상온에서 30분 동안 염색시켰다. 결합되지 않은 SRB 염색액은 1% acetic acid로 4~5회 정도 세척, 건조시킨 후에 10 mM Tris buffer 100 ㎕를 첨가하여 염색액을 녹여낸 후 540 ㎚에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다 (Dol and Peto, 1981).
- 복분자 초고압 병행 추출물을 HPLC 분석용 water에 녹여 0.45 ㎛ 막 filter로 여과하여 200 ppm의 농도로 측정하였다. HPLC 기기는 Waters (High Performance Liquid Chromatograph, USA)를 사용하여 분석하였다.
- 본 연구에서는 기존의 열수추출 방법을 통해 얻은 복분자 추출물과 초고압 추출물을 비교하였다. NO− 생성량 측정, PGE2 측정을 통해 섬유아세포에서 피부면역에 미치는 효과를 알아보고 더 나아가 향장소재와 관련된 분야에 활용하기 위한 기초 자료로 이용하고자 연구를 수행하였다.
- 실험에 사용된 복분자 시료 농도는 각각 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 그리고 1.0 ㎎/㎖로 조절하여 정상세포 및 섬유아세포에 대한 성장 효과를 검토하였다. Fig.
- NO− 생성량 측정, PGE2 측정을 통해 섬유아세포에서 피부면역에 미치는 효과를 알아보고 더 나아가 향장소재와 관련된 분야에 활용하기 위한 기초 자료로 이용하고자 연구를 수행하였다. 인간 정상 세포와 피부섬유아세포에서의 세포 독성을 비교함으로서 피부 면역 증진 소재로의 안전성을 확인하였다.
- 본 실험에 사용된 복분자 (Rubus coreanus)는 2008년 7월에 발교산 부근에서 채취한 것을 건시료로 구입하여 상온에서 보관하면서 사용하였다. 초고압 추출은 복분자 50 g을 비닐 팩에 증류수와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한후, 초고압 추출 장치 (Ilshin autoclave, Korea) 를 이용하여 500 ㎫의 압력을 5분, 15분으로 추출 조건을 설정하여 실행하였다. 초고압 추출이 끝난 시료를 각각 수직 환류 냉각기에 부착된 추출 flask에 시료 중량에 대하여 각각 10배의 증류수를 추출용매로 사용하여 100℃에서 24시간 추출하였다.
- 초고압 추출은 복분자 50 g을 비닐 팩에 증류수와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한후, 초고압 추출 장치 (Ilshin autoclave, Korea) 를 이용하여 500 ㎫의 압력을 5분, 15분으로 추출 조건을 설정하여 실행하였다. 초고압 추출이 끝난 시료를 각각 수직 환류 냉각기에 부착된 추출 flask에 시료 중량에 대하여 각각 10배의 증류수를 추출용매로 사용하여 100℃에서 24시간 추출하였다. 대조군으로는 복분자 50 g을 초고압 추출과정은 제외하고 나머지는 같은 조건인 100℃에서 24시간 열수 추출하였다.
대상 데이터
- Column은 C18 5 µ, 용매는 정제된 water와 acetonitril을 8 : 2 비율로 조제하여 사용하였고, 유속은 0.5 ㎕/min, detector의 흡광도는 350 ㎚로 하였다.
- NO− 생성능의 양성 대조구 물질로는 LPS를 사용하였다.
- 그밖에 배양에 필요한 시약으로 hepes buffer (SIGMA, USA) 와 FBS (fetal bovine serum) (GIBCO, USA), gentamycin sulfate (SIGMA, USA), trysin-EDTA (SIGMA, USA)를 사용하였다. 각 세포는 RPMI 1640 배지와 MEM 배지에서 10% heating-inactivated FBS로 적응시켜 배양하여 실험에 이용하였다.
- 5 ㎕/min, detector의 흡광도는 350 ㎚로 하였다. 복분자의 스탠다드 물질로는 catechin, caffeic acid, taxifolin, ferulic acid를 같은 조건으로 조제하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 복분자 (Rubus coreanus)는 2008년 7월에 발교산 부근에서 채취한 것을 건시료로 구입하여 상온에서 보관하면서 사용하였다. 초고압 추출은 복분자 50 g을 비닐 팩에 증류수와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한후, 초고압 추출 장치 (Ilshin autoclave, Korea) 를 이용하여 500 ㎫의 압력을 5분, 15분으로 추출 조건을 설정하여 실행하였다.
- 사용된 세포주는 마우스 유래 RAW 264.7 대식세포이며, 세포는 10% heat-inactivated bovine serum과 90% DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)을 이용하여 24well plate에 4~5×104 cells/well의 농도로 넣은 다음, 시료를 첨가하거나 첨가하지 않고 5% CO2 incubator안에서 37℃에서 48시간동안 배양하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 이용된 세포주는 인간 피부 섬유아세포인 CCD986sk (human, skin fibroblast, KCLB, KOREA)와 인간 폐 정상세포인 HEL299 (human, lung, KCLB, KOREA)로 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640을 사용하였고, 인간 신장 정상세포인 HEK293 (human, kidney, KCLB, KOREA)는 배지로 MEM (minimum essential medium)을 사용하였다. 그밖에 배양에 필요한 시약으로 hepes buffer (SIGMA, USA) 와 FBS (fetal bovine serum) (GIBCO, USA), gentamycin sulfate (SIGMA, USA), trysin-EDTA (SIGMA, USA)를 사용하였다.
- 인간 섬유아세포인 CCD-986sk 세포를 10% FBS와 DMEM 배지에 현탁하여 1×106 cells/㎖로 조정한 뒤 37℃, 습도 5%의 CO2 incubator에서 24시간 배양하여 사용하였다.
데이터처리
- SPSS program (ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)의 T-test로 검정하였으며 모든 data는 평균 ± 표준오차 (Mean ± standard error)로 나타내었다.
이론/모형
- 세포독성 측정을 위해서 SRB assay를 이용하여 측정하였다. Sulforhodamine B (SRB) assay는 세포 단백질을 염색하여 세포의 증식이나 독성을 측정하는 방법으로 실험 대상 세포인 HEK293 (in 10% FBS media)의 농도를 4~5×104 cells/㎖으로 96 well plate의 각 well에 100 ㎕씩 첨가하여 24시간 배양 (37℃, 5% 동안 CO2)한 후, 각각의 시료를 최종농도 0.
성능/효과
- 0 ㎎/㎖로 조절하여 정상세포 및 섬유아세포에 대한 성장 효과를 검토하였다. Fig. 1은 복분자의 HEK293 정상 세포에 대한 독성을 나타낸 것으로 최고 농도인 1.0 ㎎/㎖에서 초고압 15분 공정의 RHPE15가 16.5%로 낮은 세포 독성을 나타냈고, 일반 열수추출물인 RWE가 22.5%의 높은 세포독성을 나타냈다. 인간 폐 정상 세포 HEL299에 대한 세포 독성은 최고 농도인 1.
- Fig. 2에서 확인할수 있듯이 LPS와 Raw264.7 세포주에 복분자 시료를 처리하여 이틀간 배양한 후, 배양액 중에 NO−(nitric oxide)농도를 측정한 결과, 아무처리도 하지 않은 대조군 (control)과 비교하였을 때 모든 시료 첨가군에서 높은 활성을 나타내었으며, 특히 LPS와 혼합 처리하였을 때 NO−의 생성능이 큰 폭으로 증진되는 것을 확인할 수 있었다.
- 초고압 공정에 의한 복분자 추출물을 정성적인 분석법인 HPLC를 이용하여 측정하여 본 결과, 초고압 공정을 15분 병행한 추출물에서 peak가 다양하고 많이 검출되는 것을 관찰할 수 있었다. Fig. 4과 같이, 초고압 추출 공정을 한 추출물에서 생리활성이 있는 것으로 밝혀진 천연물에서 발견 되는 catechin, caffeic acid, taxifolin, ferulic acid 등의 스탠다드 물질이 과량 용출되어 나온 것을 확인하였다. 이 peak들의 면적이나 분포의 차이가 앞서 실험을 했던 피부 면역 증진 효과가 초고압 추출물에서 보통 추출물에 비해더 좋은 생리활성도를 보였다는 것들을 증명할 수 있는 결과로 사료된다.
- 2%로 높은 독성을 나타냈다. 세 가지 세포의 정상 세포 독성 실험 결과, 모두 초고압 추출물이 가장 낮은 세포독성을 보였으며 초고압 처리를 실시 할 경우 일반 추출물보다 세포독성이 낮아지는 효과를 확인할 수 있다. 이것은 약용작물들이 가지고 있는 독성 물질이 초고압으로 인해 변성되거나 파괴되어 독성이 낮아지는데 영향을 미친 것으로 보인다.
- 0%로 가장 낮은 세포독성을 보였다. 인간섬유아세포인 CCD-986sk의 세포독성 또한 모든 추출물 중 RHPE15가 1.0 ㎎/㎖의 농도에서 17.5%로 낮은 세포독성을 나타냈고, WE가 23.2%로 높은 독성을 나타냈다. 세 가지 세포의 정상 세포 독성 실험 결과, 모두 초고압 추출물이 가장 낮은 세포독성을 보였으며 초고압 처리를 실시 할 경우 일반 추출물보다 세포독성이 낮아지는 효과를 확인할 수 있다.
- 초고압 공정에 의한 복분자 추출물을 정성적인 분석법인 HPLC를 이용하여 측정하여 본 결과, 초고압 공정을 15분 병행한 추출물에서 peak가 다양하고 많이 검출되는 것을 관찰할 수 있었다. Fig.
후속연구
- 특히, UV가 지속적으로 피부에 영향을 주게 되면 멜라닌이 과형성되고, 피부 면역이 떨어지며, 체내에 흑색종 세포가 빠르게 자라 피부 종양이 형성되게 된다. 따라서, 복분자 추출물의 흑색종 세포 및 다른 암세포에 대한 독성 및 선택적으로 면역 활성을 나타내는 유효성문에 대한 검색이 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- (prostaglandin H2)로 전환되는 과정을 막았을 가능성을 나타낸다. 복분자 추출물에 대해 PGE2가 농도 의존적으로 감소하였으므로, 복분자 초고압 추출물이 피부 염증 물질 감소 효과를 가지는 것을 확인하였으나 추가적인 연구를 통해 추출물의 특이적 binding을 조사하고 메커니즘을 밝힘으로써 활성을 탐색하는 실험이 진행되어야 할 것으로 사료된다. 본 연구는 초고압 추출 공정을 통한 복분자의 피부세포 보호 효과를 관찰한 최초 연구로서 가치가 있다.
- 본 연구를 통해 복분자 초고압 추출물에는 Macrophage의 NO− 생산을 활성화시키는 특이 유용성분이 있을 것으로 사료된다.
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