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문제 정의
- 4 이에 본 연구에서는 두릅순 70% 에탄올 추출물을 전처리한 HaCaT과 피부섬유아세포 (HDF)에 UVB를 조사한 후 염증성 매개인자 및 피부세포의 주요 구성 단백질인 collagen에 영향을 주는 생화학적 지표들의 변화를 측정함으로써 두릅순 추출물이 피부광노화에 대한 방어 효과를 나타내는지 알아보고자 하였다.
- 피부는 장시간에 걸쳐 UV에 노출되면 홍반이나 열감 등의 임상적 증상을 느낄 수 있으나 세포 수준에서는 UV에 의한 피부세포의 즉각적인 반응을 확인할 수 없다. 따라서, 본 연구에서는 HaCaT과 HDF에서 두릅순 70% 에탄올 추출물의 전처리가 UVB 조사에 의한 피부 광노화 관련 인자에 어떤 영향을 미치는지 분석하였다. 본 실험에 앞서 적정한 UVB 강도를 결정하기 위하여 0~100 mJ/cm2 범위로 세포에 UVB를 조사하고 48시간 배양한 후에 세포 생장률을 측정한 결과 75 mJ/cm2까지는 세포의 생장률에 영향을 주지 않았기 때문에 보다 안전한 수준인 55 mJ/cm2로 모든 실험을 시행하였다.
- 본 연구에서는 피부의 표피와 진피에 분포하는 HaCaT 세포와 HDF 세포를 이용하여 항산화효과가 우수한 두릅순 추출물의 처리가 UVB에 의한 피부광노화를 억제할 수 있는지 알아보기 위하여 피부 염증반응과 관련한 사이토카인과 피부의 주요 구성 단백질인 collagen에 영향을 미칠 수 있는 MMP-1, type-I procollagen, TRPV-1 등의 단백질 발현에 미치는 영향을 분석하였다. HaCaT에 두릅순 추출물을 24시간 전처리한 경우 UVB (55 mJ/cm2) 노출로 인해 증가한 염증매개인자인 IL-6, IL-8, PGE2를 유의하게 감소시켰다.
제안 방법
- HaCaT 세포에 두릅순 추출물과 UVB를 처리 후 48시간 배양한 다음 배양액을 수거하여 4℃, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액만을 모아서 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kit (RnD system, Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 prostaglandin (PG) E2, interleukin (IL)-6, IL-8의 농도를 측정하였다.
- RIPA buffer (iNtRON, Korea)를 넣고 세포를 용해시켜 4℃, 13,000 rpm에서 15분간 원심분리 한 다음 상층액을 모은 후 BCA 방법으로 kit (Thermo SCIENTIFIC, IL, USA)을 이용하여 단백질 농도를 측정한 다음 sample buffer를 첨가하여 동일 농도의 단백질을 함유하는 시료를 준비하였다. Mini-PROTEIN system (BIO-Rad, USA)를 이용하여 8% SDS polyacrylamide gel의 각 well에 단백질 양이 동일하도록 시료를 넣고 전기영동 후 Amersham Hybond P 0.45 PVDF membranes (GE Healthcare Life Sci., Germany)에 blotting 하여, 5% non-fat milk에서 1시간 동안 blocking 하였다. Type I procllagen과 MMP-1 1차 항체 및 anti-TRPV1 (NOVUS Biological, USA), anti-β-actin (Sigma-Aldrich)을 4℃에서 18시간 반응시킨 다음 2차 항체 (Santa Cruz Biotech, TX, USA)를 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후 ECL solution (Pierce, USA)을 뿌려 LAS-4000 Luminescent Image Analyzer (Fujifilm, Japan)을 이용하여 단백질 band를 확인하였다.
- Type I procllagen과 MMP-1 1차 항체 및 anti-TRPV1 (NOVUS Biological, USA), anti-β-actin (Sigma-Aldrich)을 4℃에서 18시간 반응시킨 다음 2차 항체 (Santa Cruz Biotech, TX, USA)를 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후 ECL solution (Pierce, USA)을 뿌려 LAS-4000 Luminescent Image Analyzer (Fujifilm, Japan)을 이용하여 단백질 band를 확인하였다.
- UVB 조사를 위해 자체 제작한 UV 조사장치에 UV lamp (TL20W/12RS UV-B, Philips, Netherlands)와 UVC 제거 필터인 TA 401/407 Kodacel filter (Kodak, USA)를 장치한 후 UVX Radiometer (Ultra-Violet Products Ltd., US)로 UVB의 강도를 측정하였다. UVB 조사 강도는 사전 연구결과를 바탕으로 세포 생장률에 영향을 주지 않는 안전한 수준인 55 mJ/cm2로 설정하였다.
- 동결건조 분말 형태의 두릅순 70% 에탄올 추출물을 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich, MO, USA)에 먼저 녹인 후 세포 배양 배지에 희석하여 농도별로 처리하였다. 시료의 세포 독성 평가는 Hwang 등12의 연구를 참조하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)를 이용한 방법으로 측정하였다.
- 동결건조 한 두릅을 분쇄기로 갈아 분말화 하였고, 분말 시료 50 g에 10배 부피의 70% 에탄올 (Duksan, Korea)을 넣고 24시간씩 2회 교반하여 추출한 다음 추출액을 모아 whatman paper no.2 (GE Healthcare, UK)로 여과하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 HaCaT과 HDF에서 두릅순 70% 에탄올 추출물의 전처리가 UVB 조사에 의한 피부 광노화 관련 인자에 어떤 영향을 미치는지 분석하였다. 본 실험에 앞서 적정한 UVB 강도를 결정하기 위하여 0~100 mJ/cm2 범위로 세포에 UVB를 조사하고 48시간 배양한 후에 세포 생장률을 측정한 결과 75 mJ/cm2까지는 세포의 생장률에 영향을 주지 않았기 때문에 보다 안전한 수준인 55 mJ/cm2로 모든 실험을 시행하였다. 또한, 두릅순 추출물의 처리농도도 세포독성이 나타나지 않는 100 μg/mL 이하에서 수행하였다.
- 세포를 5×105 cells/well의 밀도로 6 well plate에 분주하여 안정화시킨 후 각 well에 AE 추출물을 무혈청 배양액에 녹여 농도별로 처리하여 24시간 배양시킨 후 배지를 제거하고 세포를 살짝 덮을 정도로 PBS를 첨가한 다음 UVB를 조사하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 세포는 HaCaT과 HDF로 서울대학교 의과대학 피부과에서 제공받았다. 세포배양은 Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM, Welgene, Korea)에10% (V/V) fetal bovine serum (FBS, Hyclone, USA)와 1% penicillin-streptomycin solution을 첨가한 후 37℃, 5% CO2의 배양기 (HERA Cell incubator, Thermo Scientific, USA)에서 배양하였고 2~3일 간격으로 계대배양 하여 유지하였다.
- 와 같은 방법으로 준비하였다. 전라북도 순창군에서 4월에 채취한 두릅순을 씻어 물기를 제거한 후 3일 동안 동결건조(Samwon, Korea) 하였다. 동결건조 한 두릅을 분쇄기로 갈아 분말화 하였고, 분말 시료 50 g에 10배 부피의 70% 에탄올 (Duksan, Korea)을 넣고 24시간씩 2회 교반하여 추출한 다음 추출액을 모아 whatman paper no.
데이터처리
- Means sharing the same alphabet on the bar are not significantly different at p < 0.05 by ANOVA and Duncan’s multiple range test.
- 각 군 간의 평균값의 비교는 one-way ANOVA로 분석 후 p < 0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test 또는 t-test로 대조군에 비하여 각 실험군이 통계적으로 유의한가를 평가하였다.
- 모든 실험결과는 IBM SPSS Statistics 22 (IBM, NY, USA) 통계프로그램을 이용하여 분석하였고, 모든 실험은 3회 이상 반복하여 그 결과를 평균과 표준편차 (mean ± SD)로 나타내었다.
이론/모형
- 동결건조 분말 형태의 두릅순 70% 에탄올 추출물을 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich, MO, USA)에 먼저 녹인 후 세포 배양 배지에 희석하여 농도별로 처리하였다. 시료의 세포 독성 평가는 Hwang 등12의 연구를 참조하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)를 이용한 방법으로 측정하였다. 96 well plate에 1×104 cell/mL의 농도로 HaCaT 세포 또는 HDF 세 포를 분주하여 세포배양기 (37℃, 5% CO2)에서 안정화 시킨 후 농도별로 두릅순 에탄올 추출물을 처리하여 48시간 배양하였다.
- Type I procllagen과 MMP-1 1차 항체 및 anti-TRPV1 (NOVUS Biological, USA), anti-β-actin (Sigma-Aldrich)을 4℃에서 18시간 반응시킨 다음 2차 항체 (Santa Cruz Biotech, TX, USA)를 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후 ECL solution (Pierce, USA)을 뿌려 LAS-4000 Luminescent Image Analyzer (Fujifilm, Japan)을 이용하여 단백질 band를 확인하였다. 해당 band의 intensity는 Multi Gauge Ver. 3.0 (Fujiflim, Japan) image densitometer을 이용하여 정량하였다.
성능/효과
- HaCaT 세포에서 UVB 조사로 인하여 염증성 매개인자인 IL-6, IL-8, PGE2의 생성이 크게 증가하였다 (p < 0.05).
- 8 본 연구에서도 UVB를 조사한 세포에서 TRPV-1 단백질의 증 가가 IL-6, IL-8, PGE2 및 MMP-1 증가와 함께 나타났기 때문에 TRPV-1의 증가가 UVB에 의한 염증반응 및 collagen 감소와 관계가 있을 것으로 보인다. HaCaT 세포에서 UVB에 의해 민감하게 증가하는 것으로 알려진 TRPV-19이 두릅순 추출물 처리에 의하여 감소함으로써 UVB에 의한 염증반응 감소 및 피부 collagen의 손상으로부터 보호하는 효과를 유도할 것으로 사료된다. 덧붙여, 두릅순 추출물은 UVB를 조사한 HDF에서 type-I procollagen의 감소를 억제할 뿐 아니라 UVB를 조사하지 않은 정상세포에서도 type-I procollagen 단백질 발현을 증가시켰는데 이는 두릅순 추출물 자체가 피부세포에서 collagen 생성을 촉진한다는 것을 의미한다.
- HaCaT과 HDF에 두릅순 70% 에탄올 추출물을 각각 48시간 처리하였을 때 100 μg/mL까지는 세포생장에 영향을 주지 않는 것으로 나타났고 (Fig. 1), 200 μg/mL 이상에서는 세포 생장이 떨어지는 것으로 나타나 이들 세포에 대한 두릅순 70% 에탄올 추출물의 안전범위는 100 μg/mL 이하로 추정되었다.
- HaCaT에서는 UVB 조사로 인해 세포내 칼슘의 유입을 증가시키는 TRPV-1 단백질이 67.2% 증가하였으며 피부 collagen을 분해하는 효소인 MMP-1의 단백질 발현량도 62.3% 증가하였다 (p < 0.05).
- 자연적 피부 노화는 나이가 들어가면서 시간 경과에 의해 일어나는 불가피한 현상인 반면, UV에 의한 피부 광노화는 어느 정도 예방이 가능하기 때문에 피부 광노화의 예방 및 개선을 위한 기능성 화장품과 다양한 식이 소재의 개발에 대한 관심과 연구가 증가하고 있다. UV 조사와 병행된 녹차 식이 공급이 무모 생쥐에서 자외선 조사로 증가된 피부 pH를 정상화시켰고,11 단삼 추출물은 UVB에 의한 섬유아세포의 광노화를 보호하는 효과를 보였다.5 또한, Hwang 등은 무모 생쥐에서 UVB에 의한 피부 광노화를 억제하는 gallic acid의 효과12를 보고하는 등 UV에 의한 피부노화 개선과 관련한 식품소재들이 탐색되고 있지만 아직은 그 연구가 부족한 실정이다.
- UVB를 조사하지 않은 정상 HDF에 두릅순 추출물을 50 μg/mL과 100 μg/mL 농도로 처리하였을 때에도 type-I procollagen 단백질 발현량이 유의하게 증가하였다 (p < 0.05).
- 그러나, 두릅순 추출물을 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 전처리한 경우 50 μg/mL과 100 μg/mL 처리농도에서 UVB에 의해 증가한 IL-6, IL-8, PGE2 생성을 모두 유의하게 감소시켰으며, IL-6와 PGE2는 시료농도가 증가할수록 더 감소하였다 (p < 0.05) (Fig. 3).
- 두릅순 추출물을 100 μg/mL로 처리 시 IL-6는 UVB 대조군에 비하여 25.6% 감소하였고, IL-8은 5.3%, PGE2는 70.2% 감소함으로써 (p < 0.05) 특히 PGE2의 농도는 정상대조군과 비슷한 수준으로 크게 감소됨을 관찰하였다 (Fig. 3).
- 특히 두릅 70% 에탄올 추출물이 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능과 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium sulfate (ABTS) 라디칼 소거능, Fe+++에서 Fe++로의 환원력을 측정하는 ferric reducing antioxidant power (FRAP) 등이 우수하였고, HaCaT에서 두릅순 에탄올 추출물이 UVB에 의한 ROS 생성을 감소시키는 효과를 확인된 바 있다. 따라서 본 연구에서 두릅순 추출물이 HaCaT과 HDF 세포에서 UVB에 의한 광노화 관련 인자의 증가를 억제시키는 효과는 그 안에 함유되어 있는 항산화효과를 갖는 폴리페놀의 작용에 의한 것이 크다고 생각된다.
- 05). 따라서, 두릅순 추출물은 UVB에 노출된 피부세포에서 UVB에 의한 collagen 손상을 억제하는 동시에 정상 피부세포에서도 collagen의 생성을 촉진하는 효과가 있었다.
- HaCaT에 두릅순 추출물을 24시간 전처리한 경우 UVB (55 mJ/cm2) 노출로 인해 증가한 염증매개인자인 IL-6, IL-8, PGE2를 유의하게 감소시켰다. 또한, 피부 collagen의 정상적인 구조 및 양에 영향을 미치는 단백질들의 발현을 측정한 결과 HaCaT에서는 UVB 조사로 인해 증가한 TRPV-1과 MMP-1 단백질의 발현이 두릅순 에탄올 추출물의 전처리로 모두 감소하였고, HDF에서는 UVB를 조사한 대조군에 비하여 두릅순 추출물 처리가 MMP-1 단백질 발현을 감소시키는 동시에 collagen의 전구체인 type-I procollagen의 발현을 증가시키는 효과를 보였다. 이들 결과들로부터 항산화효과가 우수한 두릅순 70% 에탄올 추출물은 피부세포에서 UVB에 의한 염증반응을 억제시키는 동시에 피부 collagen의 감소를 억제시킴으로써 피부 광노화를 예방할 수 있는 천연 소재로 이용될 수 있다고 본다.
- 특히 두릅 70% 에탄올 추출물이 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능과 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium sulfate (ABTS) 라디칼 소거능, Fe+++에서 Fe++로의 환원력을 측정하는 ferric reducing antioxidant power (FRAP) 등이 우수하였고, HaCaT에서 두릅순 에탄올 추출물이 UVB에 의한 ROS 생성을 감소시키는 효과를 확인된 바 있다.
- 한편, UVB를 조사하기 전 추출시료를 농도별로 각 세포에 24시간 동안 전처리하고 55 mJ/cm2의 UVB를 조사한 후 48시간 동안 배양한 뒤 측정한 세포 생장률도 100 μg/mL 이하에서 독성이 없는 것으로 나타났 다 (Fig. 2).
후속연구
- 본 연구 결과들에 의하면 두릅순 에탄올 추출물은 UVB에 의해 초래되는 피부 광노화로부터 보호하는 효과가 있는 것으로 기대되며 앞으로 심도 있는 작용기전에 대한 후속 연구와 유효물질을 확인하는 연구가 필요하다고 본다.
- 또한, 피부 collagen의 정상적인 구조 및 양에 영향을 미치는 단백질들의 발현을 측정한 결과 HaCaT에서는 UVB 조사로 인해 증가한 TRPV-1과 MMP-1 단백질의 발현이 두릅순 에탄올 추출물의 전처리로 모두 감소하였고, HDF에서는 UVB를 조사한 대조군에 비하여 두릅순 추출물 처리가 MMP-1 단백질 발현을 감소시키는 동시에 collagen의 전구체인 type-I procollagen의 발현을 증가시키는 효과를 보였다. 이들 결과들로부터 항산화효과가 우수한 두릅순 70% 에탄올 추출물은 피부세포에서 UVB에 의한 염증반응을 억제시키는 동시에 피부 collagen의 감소를 억제시킴으로써 피부 광노화를 예방할 수 있는 천연 소재로 이용될 수 있다고 본다.
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