상지가 콜라겐 유발 관절염 랫트에 미치는 영향 - 배액림프절의 면역세포 발현 - Effects of Mori Ramulus on Collagen-induced Arthritis Rat - Expression of Immunocells in Draining Lymph Node -원문보기
Mori Ramulus has multiple applications in Korean traditional medicine prescription because it has antioxidant and anti-inflammatory effects by reducing macrophage activities. Yet, no studies on the anti-arthritic activity of EMR (extract of Mori Ramulus) have been reported in vitro and in vivo. Rheu...
Mori Ramulus has multiple applications in Korean traditional medicine prescription because it has antioxidant and anti-inflammatory effects by reducing macrophage activities. Yet, no studies on the anti-arthritic activity of EMR (extract of Mori Ramulus) have been reported in vitro and in vivo. Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic autoimmune disease with chronic inflammation characterized by hyperplasia of synovial cells in affected joints, which ultimately leads to the destruction of cartilage and bone. Because collagen-induced arthritis (CIA) is similar to RA in pathological symptoms and immune reactions, there have been several reports concerning RA using CIA mouse model. Here, we investigated the effects of Mori Ramulus on RA using CIA mice. The importance of CD4+ Th1 cells in RA progress was previously indicated and studies further showed that Th17 cells play a prime role in severity of disease. Accordingly, the present study was focused on CIA associated with CD4+ Th1 cells and Th1 7 cells. DBA/1OlaHsd mice were immunized with bovine type II collagen (CII). After a second collagen immunization, mice were treated with EMR once a day for 4 weeks. The severity of arthritis within the paw joints was evaluated by histological assessment of cartilage destruction and pannus formation. Immune cells in peripheral blood mononuclear cells (PBMC), draining lymph node (DLN) and paw joints, cytokine production and gene expression were assessed from CIA mouse using ELISA, FACS and real-time PCR analysis. Administration of EMR significantly suppressed the progression of CIA and inhibited the production of TNF-$\alpha$, IL-6 and IL-17 in the serum. The erosion of cartilage was dramatically reduced in mouse knees after treatment with EMR. In conclusion, our results demonstrate that EMR significantly suppressed the progression of CIA and that this action was mediated by the decreased production of TNF-$\alpha$, IL-6, IL-17 and collagen II-specific antibody in the serum. EMR suppressed Th17 cells and reduced level of IL-6 via B cell suppression, and thus, the levels of autoantibodies produced from B cells were decreased. Furthermore, EMR suppressed NKT cells which directly stimulate B cells and develop imbalance of Th1/Th2 cell. Oral administration of EMR (100 mg/kg or 200 mg/kg) significantly suppressed the progression of CIA, which is comparable to that of methotrexate (MTX, 0.3 mg/kg) used as a positive control. We are currently studying the mechanism underlying the therapeutic role for EMR in CIA mice.
Mori Ramulus has multiple applications in Korean traditional medicine prescription because it has antioxidant and anti-inflammatory effects by reducing macrophage activities. Yet, no studies on the anti-arthritic activity of EMR (extract of Mori Ramulus) have been reported in vitro and in vivo. Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic autoimmune disease with chronic inflammation characterized by hyperplasia of synovial cells in affected joints, which ultimately leads to the destruction of cartilage and bone. Because collagen-induced arthritis (CIA) is similar to RA in pathological symptoms and immune reactions, there have been several reports concerning RA using CIA mouse model. Here, we investigated the effects of Mori Ramulus on RA using CIA mice. The importance of CD4+ Th1 cells in RA progress was previously indicated and studies further showed that Th17 cells play a prime role in severity of disease. Accordingly, the present study was focused on CIA associated with CD4+ Th1 cells and Th1 7 cells. DBA/1OlaHsd mice were immunized with bovine type II collagen (CII). After a second collagen immunization, mice were treated with EMR once a day for 4 weeks. The severity of arthritis within the paw joints was evaluated by histological assessment of cartilage destruction and pannus formation. Immune cells in peripheral blood mononuclear cells (PBMC), draining lymph node (DLN) and paw joints, cytokine production and gene expression were assessed from CIA mouse using ELISA, FACS and real-time PCR analysis. Administration of EMR significantly suppressed the progression of CIA and inhibited the production of TNF-$\alpha$, IL-6 and IL-17 in the serum. The erosion of cartilage was dramatically reduced in mouse knees after treatment with EMR. In conclusion, our results demonstrate that EMR significantly suppressed the progression of CIA and that this action was mediated by the decreased production of TNF-$\alpha$, IL-6, IL-17 and collagen II-specific antibody in the serum. EMR suppressed Th17 cells and reduced level of IL-6 via B cell suppression, and thus, the levels of autoantibodies produced from B cells were decreased. Furthermore, EMR suppressed NKT cells which directly stimulate B cells and develop imbalance of Th1/Th2 cell. Oral administration of EMR (100 mg/kg or 200 mg/kg) significantly suppressed the progression of CIA, which is comparable to that of methotrexate (MTX, 0.3 mg/kg) used as a positive control. We are currently studying the mechanism underlying the therapeutic role for EMR in CIA mice.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
RA 동물 모델로 널리 이용되고 있다. 따라서 CIA 생쥐모델을 이용하여 EMR의 치료 효과를 알아보기 위해 in vivo 실험을 수행하였다.
이에 저자는 桑枝가 RA에 미치는 영향을 실험적으로 규명하고자, in vivo 실험을 통하여 桑枝의 항류마티스 관절염 효과를 분석하고자, DBA/lOlaHsd 생쥐에 type n collagen (CH) 으로 RA를 유발시킨 후, 桑枝 추출물을 투여한 결과 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
DBA/1OlaHsd mice were boosted with C Ⅱ after 3 weeks. After a second collagen immunization, mice were treated with methotrexate (MTX) three times a week and extract of Mori Ramulus (EMR) was treated once a day for 4 weeks. Orai administration of EMR (100 or 200 ㎎/㎏) and injection of MTX significantly decreased the total cells number of draining lymph nodes and paw joints comparable to that of a control group, NR : Normal DBA/1OlaHsd mouse group.
Arthritis index were scored according to Mann-Whitney U test at every seven days. After second boosterization of collagen type 11 (C 11), mice were divided into four grouos and each group was treated with DW (CT), extract of Mori Ramulus (EMR) or methotrexate (MTX). NR : Normal DBA/1OiaHsd mouse group.
Effects on alanine aminotransferase and aspartic acid transaminase levels in the DBA/1OlaHsd mouse serum treated with extracts of Mori Ramulus. After second boosterization of collagen type Ⅱ (C Ⅱ), mice were divided into four groups and each group was treated with distilied water (DW, CT), extract of Mori Ramulus (EMR) or methotrexate (MTX). Normal mice without injection of collagen and Complete Freund's adjuvant were treated with H2O.
Suppressive effects on arthritis index of paw joint in collagen-induced arthritis mice treated with extracts of Mori Ramulus. Arthritis index were scored according to Mann-Whitney U test at every seven days. After second boosterization of collagen type 11 (C 11), mice were divided into four grouos and each group was treated with DW (CT), extract of Mori Ramulus (EMR) or methotrexate (MTX).
C1A 생쥐에 4주간 약물을 처리하여 실험을 종료하고, 실험동물을 ethyl ethei로 마취시킨 후 생쥐에서 배액 림프절 (draining lymph node:DLN)z paw joint (PJ)를 각각 적출하여 100 mesh로 세포를 분리하여 D-PBS로 5분간 원심분리 (1, 700 rpm)하여 2회 세척한 후 cell strainere] 통과시켜 세포 이외의 분해되지 않은 조직이나 불순물을 제거하였다. 이것을 flow cytometer의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 백분율 (%)로 분석한 후 총세포수를 적용하여 각 조직에서의 절대 세포수 (absolute number)를 산출하였다.
CIA 생쥐에 4주간 약물을 처리하여 실험을 종료하고, 실험동물을 ethyl ether로 마취시킨 후 관절조직에 후 RNAzolB 500 ml를 넣고 용해될 때까지 분쇄하였다. 이 혼합 부유액에 chloroform (CHCI3) 50 ml를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였고 이를 얼음에 15분간 방치하였다.
CIA 생쥐에서 DLN을 각각 적출하여 100 mesh로 세포를 분리하여 D-PBS로 5분간 원심분리 (1700 rpm)하여 2회 세척한 후 cell strainer에 통과시켜 세포 이외의 분해되지 않은 조직이나 불순물을 제거하였다 여기에 각각 PE-anti-CD3ez FITC-anti-CD19z FITC-anti-CD4z FITC-anti-CD8z PE-anti-CD25z FITC-anti-CD697 PE-anti-Gr-1 FITC-anti-CDllbz FITC-anti-CD49bz FITC-anti-B220z PE-anti-CD45> 넣고 30 분간 얼음에서 반응시켰다' 반응 후 3회 이상 인산완충 생리식염수로 수세한 후 flow cytometer의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 백분율 (%)로 분석한 후 총세포수를 적용하여 DLN의 절대 세포수 (absolute number)를 산출한다. 측정한 DLN 세포를 5xl05/세포수로 조정한 후 4℃에서 면역 형광염색 (immuno fluorescence staining) 을 실시하여 flow cytomete}:의 Ce11 Quest 프로그램을 이용하여 백분율 (%)로 분석하였다.
CU로 boosting 후 DBA/lOlaHsd 생쥐의 각 4개의 발에서 관절염 지수 (arthritis index:AI)를 측정하였는데, DBA/lOlaHsd 생쥐의 각 4개의 발 (paw joints)에서 관절염 징후를 0 = no arthritis, 1 = small degTee of arthritis, 2 - light swelling, 3 = medium swelling, 4 = severe swelling, 5 = severe swelling and non-weight-bearing 등으로 구분한 뒤, 각 4개의 발에 각 등급에 따라0~5점까지 점수를 부여하고, CIA 유발 정도를 1주일 간격으로 기록하였다.
DBA/lOlaHsd 생쥐 6 마리씩을 한 군으로 하여 정상군 (normal:NR)z 치료제를 처리하지 않은 대조군 (Control:CT)z methotrexate (MTX:0.3 ㎎/㎏) 처리군, EMR 처리군 (200 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏)으로 나누어 booster한 후 약물 투여를 시작하였다. 정상군과 대조군은 생리식염수를 매일 1회 각각 매일 경구 투여하였고, 양대조군은 MTX (0.
In vivo 실험으로, 생체 내 간독성 여부를 알아보기 위해 혈청 내의 ALT, AST 검사를 시행하였으며, 검사 결과 桑枝에 대한 약물 독성은 나타나지 않았다(Fig. 1).
Real time quantitative PCRe Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다.
Thl7 세포관련 유전자 발현은 Taqman probe PCR Master mix (ABI)를 사용하였고, internal standard는 GAPDH를 사용하였고, primer의 최종농도가 200 nM이 되게 반응시켰다. Real time quantitative PCR의 조건은 : pre-denaturation-B 2 min at 50℃z 10 min 94℃, 그리고 40 cycles을 0.
桑枝 (Mori Ramulus; MR) 100 g에 증류수 1,000 를 가하여 열탕 추출기에서 3시간 추출하여 얻은 액을 횹입 여과하고, 이를 감압 추출장치로 농축하였다' 위 과정을 3회 반복하였고, 3 회 농축한 것을 모아서 다시 동결 건조기를 이용하여 완전 건조시켜 桑枝 추출물 (15.7 & extract of Mori Ramulus; EMR; DLH-07003)을 제조하였다. 이를 냉동 (-84℃) 보관하면서 적당한 농도로 증류수에 희석하여 실험시에 사용하였다.
류마티스 관절염 동물 모델을 이용하여 桑枝의 효능을 실험적으로 검색하고자, DBA/lOlaHsd 생쥐에서의 콜라겐으로 관절염을 유발하여 간독성 검사, 관절염 지수, 관절 조직 변화, PBMQ DLN, PJ의 면역 세포 변화, 혈청 내 싸이토카인 생성량, 혈청 내 rheumatoid factor 농도 등을 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
분리된 혈청은 생화학기기를 이용하여 alanine aminotransferase (ALT) 와 aspartic acid transaminase (AST) 를측정하였다.
01 mol/L의 acetic acid와 complete Freund's adjuvant# 혼합한 후 200 을 DBA/lOlaHsd 생쥐에 피하 주사하고, 21일 후 동량을 boosting 하여 CIA 모델을 유발하였다. 실험군은 크게 DBA/lOlaHsd 생쥐 6마리를 한 군으로 CIA를 유발시키지 않은 정상군과 CIA 생쥐 대조군, CIA 생쥐에 methotrexate (0.3 ㎎/㎏) 처리한 양성대조군과 CIA 생쥐에 EMR 100 ㎎/㎏, EMR 200 ㎎/㎏ 농도로 투여한 실험군으로 나누었다.
않은 조직이나 불순물을 제거하였다. 이것을 flow cytometer의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 백분율 (%)로 분석한 후 총세포수를 적용하여 각 조직에서의 절대 세포수 (absolute number)를 산출하였다.
3 ㎎/㎏) 처리군, EMR 처리군 (200 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏)으로 나누어 booster한 후 약물 투여를 시작하였다. 정상군과 대조군은 생리식염수를 매일 1회 각각 매일 경구 투여하였고, 양대조군은 MTX (0.3 ㎎/㎏)를 1주일에 3회 각각 0.1 m£ 씩 복강에 주사하였으며, EMR (200, 100 ㎎/㎏) 처리군은 4주 동안 매일 오전 11시에 경구투여 하였다.
산출한다. 측정한 DLN 세포를 5xl05/세포수로 조정한 후 4℃에서 면역 형광염색 (immuno fluorescence staining) 을 실시하여 flow cytomete}:의 Ce11 Quest 프로그램을 이용하여 백분율 (%)로 분석하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 桑枝 (Morus alba Linne; Mori Ramulus; MR)는 충남 공주 잠사시험장에서 2007년 4월 14일, 채취한 것을 대전대학교 한의과대학 본초학교실에서 陰乾시키고, 약전에 합격한 것만을 정선하여 사용하였다.
실험 동물은 FOLAS INTERNATIONAL (서울, Korea) 에서분양받은 6주령의 DBA/lOlaHsd 생쥐를 2주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 22±2℃, 1일 중 12시간은 200~300 Lux 로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다.
데이터처리
(N = 6). Comparisons between controi and test groups were analyzed using Student's t-test.
다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean±standard error로 기록하였고, 유의성 검증은 Student's t-test 분석방법을 이용하여 결정하였다.
성능/효과
Thl7 T 세포는 IL-1, IL-17az IL-17F, Ⅱ.-6, IL-22, TNF-a, IL-8, GM-CSF 등을 생산하며 조직의 염증과 세포 외 박테리아와 투쟁하는 중성구의 활성화 모두에서 필수적인 역할을 수행한다고 밝혀졌다.
AI를 분석한 결과, 대조군의 AI는 실험종료까지 증가되었으나, MTX 투여군과 EMR (200 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏) 투여군은 약물투여 1주째부터 AI가 감소되었으며, 2주부터는 AI의 감소가 보이지 않고 일정한 관절염 지수를 보였다(Fig. 2). 이는 약물 처리로 인해 관절염의 악화가 진행되지 않았음을 시사한다.
M, (N = 6). Comparisons between control and test groups were analyzed using Student's t-rest and differences were considered significant when the degree of confidence in segnmcance was 99% or higher (**p<0.01).
(N=6). Comparisons between control and test groups were analyzed using Student's t-test, and differences were considered significant when the degree of confidence in significance was 95% and 99% or higher (*p<0.05, **p(0, 01).
(N = 6). Comparisons between control and test groups were analyzed using Student's t-test, and differences were considered significant when the degree of confidence in significance was 95% and 99% or higher (*p<0.05, **p<0.01).
(N = 6). Comparisons between control and test groups were analyzed using Student's t-test, and differences were considered significant when the degree of confidence in significance was 95% and 99% or higher Cp<0.05, **p<0, 01).
(N=6). Comparisons between control and test groups were analyzed using Student's t-test, and differences were considered significant when the degree of confidence in significance was 99% or higher (***p<0.01).
(N=6). Comparisons between control and test groups were analyzed using Student's t-test, and differences were considered significant when the degree of coeidence in significance was 95% and 99% or higher (*p<0.05, **p<0.01).
DLN 내의 총세포수를 분석한 결과, 정상군에 비해 대조군의 세포수가 현저하게 감소되어 있었고, MTX 투여군과 EMR (200 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏) 투여군의 총세포수는 대조군보다 유의성 있게 증가되었다(Fig. 3). 이는 대조군의 RA 조직 염증 병리 상황에서, 여러 APC들이 림프절에 존재하는 염증성 면역세포를 자극시켜 病巢로 이주시키기 때문이며, 반대로 EMR을 투여한 실험군의 경우 염증이 완화되어 병소로 이주되는 경향이 감소되기때문이다(Fig.
DLN의 세포수를 분석한 결과, CH 주사후 10주 이상된 CIA 생쥐는 대체적으로 DLN이 정상군에 비해 현저하게 작아져 있다. 이는 관절염 염증조직으로 염증 T 세포를 DLN으로부터계속 공급받아야 되는 염증질환 메카니즘의 일환으로, DLN의 naive T 세포 등이 염증조직에서의 수지상세포 (dentritic cell : DC)나 APC에 의한 cross-presentation에 의하여 활성화된다찌.
EMRO] CIA 생쥐 모델에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험 결과, EMRe Thl7 T 세포의 억제를 통해 관절염의 증상이 완화되었다고 볼 수 있는데, 최근에 anti-IL-17 항체를 통한 치료가 CIA의 중증도를 현저하게 감소시킬 수 있다는 연구 보고로 볼 때, EMR이 anti-IL-17 항체와 같은 역할을 수행할 수 있다고 사료된다. 또한 IL-17은 활액막 fibroblast 세포들이 IL-6, Ⅱ.
EMR이 총 면역 세포에 미치는 영향을 분석한 결과, EMRe DLN의 총 세포수는 증가시켰다. EMR을 투여한 실험군의 DLN 세포수를 분석한 결과, CD19+, CD3+, CD4+, CD8+, CD4+/CD25+, B220+/CD45+ 세포수는 유의성 있게 증가시켰다. EMR을 투여한 실험군의 관절 조직 IL-17a, IL-22 mRNA 유전자 분석 결과, 대조군에 비해 유의성 있게 감소되었다.
EMR을 투여한 실험군의 DLN 세포수를 분석한 결과, CD19+, CD3+, CD4+, CD8+, CD4+/CD25+, B220+/CD45+ 세포수는 유의성 있게 증가시켰다. EMR을 투여한 실험군의 관절 조직 IL-17a, IL-22 mRNA 유전자 분석 결과, 대조군에 비해 유의성 있게 감소되었다.
용량에서 간독성을 보이지 않았다. EMR의 관절염 유발 정도를 분석한 결과, EMR을 투여한 실험군은 관절염 유발율을 유의성 약하게 감소시켰다. EMR이 총 면역 세포에 미치는 영향을 분석한 결과, EMRe DLN의 총 세포수는 증가시켰다.
EMR이 생체 독성을 가지고 있는지 알아보기 위해, 혈청 내 AST, ALT 검사를 분석한 결과, EMRe 100 ㎎/㎏ 및 200 ㎎/㎏ 의 용량에서 간독성을 보이지 않았다. EMR의 관절염 유발 정도를 분석한 결과, EMR을 투여한 실험군은 관절염 유발율을 유의성 약하게 감소시켰다.
EMR의 관절염 유발 정도를 분석한 결과, EMR을 투여한 실험군은 관절염 유발율을 유의성 약하게 감소시켰다. EMR이 총 면역 세포에 미치는 영향을 분석한 결과, EMRe DLN의 총 세포수는 증가시켰다. EMR을 투여한 실험군의 DLN 세포수를 분석한 결과, CD19+, CD3+, CD4+, CD8+, CD4+/CD25+, B220+/CD45+ 세포수는 유의성 있게 증가시켰다.
3 ㎎/㎏ three times a week for 4 weeks; EMR 200 : mouse group boosted with coilagen type Ⅱ (1 μg/ml) and treated with EMR 200 ㎎/㎏ once a day for 4 weeks; EMR 100 : DBA/lOlaHsd mouse group boosted with collagen type Ⅱ (1 μg/ml) and treated with EMR 100 ㎎/㎏ once a day for 4 weeks. The results are expressed mean+S.E.M. (N=6) Comparisons between control and test groups were analyzed using Student's t-test, and deferences were considered signilicant when the degree of confidence in significance was 95%, 99% and 99.9% or higher (*p(0.05 **p<0.01 ***p<0.001).
결론적으로 본 연구를 통해서 RA에 유용할 수 있는 桑枝의새로운 효능을 확인하였다. CIA 모델 생쥐에서 EMR 효능은 Thl7 세포를 강력하게 억제하여, IL-6의 생성량을 감소시키고, 추가적으로 B세포의 증식을 억제한다.
관절염 유발율을 매주 한번씩 4주 동안 검사한 결과, 1주 동안 약물을 처리한 MTX 투여군 (0.3 ㎎/㎏)과 EMR 투여군 (200 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏)의 관절염 지수가 대조군과 다른 양상으로 감소되었으나, 대조군의 관절염 지수는 실험 종료 시까지 계속 증가되었다. MTX 투여군 (0.
-8, VEGF (vascular endothelial growth factor)를 합성하도록 활성화시켜 싸이토카인을 분비시킨다. 따라서 EMR이 IL-17의 생성에 영향을 미쳐 활액막 fibroblast 세포들이 NF-kB와 PI3-K/Akt 에 의한 경로를 통해 -6를 합성하는 것을 강력하게 억제시켰으며, IL-6 합성이 감소됨으로서 B 세포에 대한 자극이 감소되어 자가항체의 생성량을 유의성 있게 감소시켰으며, 관절 조직의 뼈와 연골의 파괴를 감소시켰고 feedback 작용을 통해 Th 17 T 세포로 분화되는 것을 억제시켰다고 사료된다. 다만 추가적으로 TGF-P, IL-23pl9에 대한 mRNA 유전자 발현 분석 및 혈청 내 생성량 분석과 Foxp3 유전자 분석을 통한 CD4+/CD25+ T 세포에 대해 향후에 연구함으로서 좀 더 정확한 기전 연구가 필요하다고 생각된다.
반응을 억제시키는 역할을 수행하며, RA 환자의 CD4+/CD25+ T 세포는 TNF-a와 IFN-y를 생성하는 활성화 Thl 세포를 효과적으로 억제시키고, 직접적으로 Cn-specific T 세포와 B 세포의 면역 반응을 억제시키지 않아도 관절염의 병세를경감시킨다. 따라서 대조군의 CD4+/CD25+ T 세포는 감소된 반면, EMR (200 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏) 투여군의 세포수는 유의성 있게 증가된 것으로 보아(Fig. 6) EMRO] CD4+/CD25+ T 세포를활성화시켜 RA를 호전시킬 수 있다고 생각된다.
유의성 있게 증가되었다. 또한 DLN의 대조군에서 CD3+ T세포와 관련된 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+/CD25+ T 세포와 CD19+ 세포가 정상군에 비하여 현저하게 감소되어 있었고, EMR의 투여로 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+/CD25+ T 세포와 CD19+ 세포가 세포 등이 모두 유의성 있게 증가를 나타내었다. 이는 病巢의 염증성 싸이토카인 분비감소와 DC나 APC에 의한 cross-presentation에 의하여 활성화가 억제되어 병소로의 이주가 감소되었음을 의미한다.
실험 결과, 정상군에 비해 대조군의 DLN의 총세포수가 현저히 감소하였고, EMR의 투여로 대조군에 비하여 DLN의 총 세포 수가 유의성 있게 증가되었다. 또한 DLN의 대조군에서 CD3+ T세포와 관련된 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+/CD25+ T 세포와 CD19+ 세포가 정상군에 비하여 현저하게 감소되어 있었고, EMR의 투여로 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+/CD25+ T 세포와 CD19+ 세포가 세포 등이 모두 유의성 있게 증가를 나타내었다.
없는 실정이다. 이에 저자는 祛風濕藥에 속하는 桑枝 가 祛風濕, 通利關節, 通經絡, 淸熱除濕 등의 효능으로, 四肢經絡 을 善達시켜 關節濕痺諸痛을 치료하고, 약리적으로 대식세포로유발시킨 염증에 효과가 뛰어나므로 RA에 유효할 것으로 사료되었다.
정상군의 ALT 생성량은 35.8±3.8 U/L이고, 대조군의 ALT 생성량은 31±0.5 U/L이며, MTX를 0.3 ㎎/㎏로 주사한 실험군의 ALT 생성량은 30.9±0.7 U/L, EMR을 200 ㎎/㎏ 농도로 처리한 실험군의 ALT 생성량은 33.1±4.1 U/L, EMR을 100 ㎎/㎏ 농도로 처리한 실험군의 ALT 생성량은 31.4±5.6 U/L로 대조군에 비해 유의성은 없었다(Fig. 1). 정상군의 AST 생성량은 108.
3 mg/kg)과 EMR 투여군 (200 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏)의 관절염 지수는 투약 2주 이후에는 일정한 상태를보여주었다. 투약 1주후부터 MTX 투여군과 EMR 투여군의 관절염 지수가 대조군에 비하여 유의성 (*p<0.05z **p<0.01)있게 감소되었다(Fig. 2).
후속연구
또한 억제 T세포의 발현을 촉진시킴으로서 관절염지수 감소 및 조직병변이 감소되었다고 생각된다. 다만 CD4+/CD25+ T 세포의 증가로 인해 Thl7 세포와 염증성 면역세포가 억제된 것인지는 추후 정확한 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.
따라서 EMR이 IL-17의 생성에 영향을 미쳐 활액막 fibroblast 세포들이 NF-kB와 PI3-K/Akt 에 의한 경로를 통해 -6를 합성하는 것을 강력하게 억제시켰으며, IL-6 합성이 감소됨으로서 B 세포에 대한 자극이 감소되어 자가항체의 생성량을 유의성 있게 감소시켰으며, 관절 조직의 뼈와 연골의 파괴를 감소시켰고 feedback 작용을 통해 Th 17 T 세포로 분화되는 것을 억제시켰다고 사료된다. 다만 추가적으로 TGF-P, IL-23pl9에 대한 mRNA 유전자 발현 분석 및 혈청 내 생성량 분석과 Foxp3 유전자 분석을 통한 CD4+/CD25+ T 세포에 대해 향후에 연구함으로서 좀 더 정확한 기전 연구가 필요하다고 생각된다.
이는 regulatory T 세포가 되기 위한 CD62L이나, CD152, 그리고 Foxp3 유전자가 증가가 있었는지를 관찰해야한다%). 즉, EMR이 regulatory T 세포를 up-regulation하여 관절염이 치료된다고 한다면 위와 같이 좀 더 추가적인 연구가 진행되어야 될 것으로 보인다.
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