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문제 정의
- 따라서 국내 유제품 내에 존재하는 산양유와 우유를 동시에 신속하게 동정하는 duplex PCR의 이용가능성을 연구하였다.
제안 방법
- PCR은 Accupower preMix(Bioneer, Korea)에 100 ng DNA template를 넣고, 소의 경우는 10 pmol의 primer, 산양의 경우는 15 pmol의 primer 첨가한 후 증류수를 넣어 최종 부피를 20 µL로 만든 다음 PCR 증폭기(DNA Engine Pelter Thermal cycler, Bio-Rad)로 반응시켰다.
- PCR은 Accupower preMix(Bioneer, Korea)에 소와 산양의 primer을 각각 10 pmol과 15 p mol을 넣고 시료의 종류에 따라 DNA template의 농도를 100-250 ng로 조정하여 첨가한 후 증류수로 최종 volume을 20 µL로 한 다음 PCR 증폭기(DNA Engine Pelter Thermal cycler, Bio-Rad)로 반응시켰다.
- 본 연구에서는 우유와 산양유를 검출하기 위해 소와 산양의 미토콘드리아 12S rRNA 유전자를 증폭하는 primer 를 사용한 duplex PCR 방법을 유제품에 적용하였다. 소의 미토콘드리아 12S rRNA 유전자를 증폭하는 primer을 사용하여 simplex PCR을 실시한 결과, 소 primer의 경우 우유에서는 223 bp의 특이성 밴드가 나타났으나 산양유에서는 증폭된 밴드가 나타나지 않았다(Fig.
- 따라서 산양의 primer 는 산양유를 동정하는데 특이적이 마커로 사용할 수 있다. 소와 산양 primer을 이용하여 우유와 산양유에 대해 실시한 simplex PCR 결과가 매우 양호하므로 소와 산양 primer 을 모두 이용하여 duplex PCR을 시도할 수 있는 기초자료를 얻었다.
- 소의 PCR 조건은 93℃에서 2분(1 cycle), 93℃에서 30초, 63℃에서 30초, 72℃에서 45초(40 cycle), 72℃에서 5분간 반응시켰으며, 산양의 PCR 조건은 94℃에서 5분(1 cycle), 94℃에서 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분(34 cycle), 72℃에서 5분간 반응시켰다. PCR 산물은 2% agarose gel을 사용하여 100 V에서 60분간 전기영동을 하였다.
- 시료를 실온에서 냉각한 후 chloroform 500 µL을 넣고 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액 500 µL을 Wizard genomic DNA purification kit(Promega)를 사용하여 DNA를 정제했다.
- 양유나 산양유 속에 있는 우유을 검출하기 위해 특정 primer을 사용하여 simplex PCR을 실시하였다(Löpez-Calleja et al., 2004).
- 유제품에 들어 있는 우유와 산양유를 동정하기 위해 미토콘드리아의 12S rRNA 유전자를 목표로 하는 primer을 이용하는 duplex PCR 분석을 적용하였다. 소와 산양의 특이성 primer을 이용한 duplex PCR 분석은 우유와 산양유 DNA에 대해 각각 233 bp와 326 bp의 특이성 단편을 나타냈다.
- 정제된 DNA를 100 µL 멸균증류수로 희석한 후 260 nm(Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech)에서 DNA 농도를 측정하였다.
대상 데이터
- 소와 산양의 특이성 primer을 이용한 duplex PCR 분석은 우유와 산양유 DNA에 대해 각각 233 bp와 326 bp의 특이성 단편을 나타냈다. Duplex PCR 분석이 라벨에 표시된 성분을 확인하기위하여 시중마트에서 구입한 15개 유제품에 적용하였다. Duplex PCR 분석 결과 4개 시유, 3개 요구르트, 1개 전지분유는 표시된 성분과 완전히 일치하였다.
- 소의 특이성 마커로는 Löpez-Calleja 등(2004)이 제시한 소의 12S rRNA에 위치한 223 bp DNA 단편을 PCR로 증폭하기 위하여 12SM-FW(5'-CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3'), 12SBT-RV(5'-TGGTTTCATAATAACTTTCGCGCT-3')를 primer로 사용하였고, 산양유 특이성 마커로는 Bottero 등(2003)이 제시한 양의 12S rRNA 유전자에 위치한 326 bp DNA 단편을 PCR로 증폭하기 위해 Sense 144(5'-CGCCCTCCAAATCAATAAG-3'), Antisense 469(5'-AGTGTATCAGCTGCAGTAGGGTT-3')을 primer로 사용하였다.
- 우유와 산양유는 각각 상지대학교 실습목장과 홍천 소재 유산양 목장에서 기증받아 시료를 사용하였고, 산양시유, 산양유 요구르트, 산양조제분유, 전지분유, 조제분유, 시유 및 우유 요구르트는 시중 마트에서 구입해서 시료로 사용하였다.
이론/모형
- , 2004). 모짜렐라치즈에 사용된 우유와 버펄로유를 동정하는데 duplex PCR 방법을 사용하였으며(Rea et al., 2001), 양젖으로 만든 치즈 속에 혼입된 우유를 검출하는데 duplex PCR이 사용되었다(Mafra et al., 2004). Bottero 등(2003)은 소, 양 및 산양 primer을 가지고 multiplex PCR을 이용하여 유통하는 치즈에 사용된 젖의 종류를 동정하는데 사용하였다.
- 시료로부터 DNA의 추출은 Löpez-Calleja 등(2004)이 제시한 방법에 따라라 다음과 같이 실시하였다.
성능/효과
- Duplex PCR 분석이 라벨에 표시된 성분을 확인하기위하여 시중마트에서 구입한 15개 유제품에 적용하였다. Duplex PCR 분석 결과 4개 시유, 3개 요구르트, 1개 전지분유는 표시된 성분과 완전히 일치하였다. 그러나 7개의 조제분유 중 5개만 표시성분과 일치하고 2개 조제분유제품은 산양유와 우유가 각각 오염되어 있는 것으로 나타났다.
- 1%까지 혼합된 것이 탐지되는 것을 볼 수 있었다. Duplex PCR을 이용하여 시중에 유통 중인 15개 제품에 표시된 우유제품과 산양 유제품에 적용한 결과 시유 4개 제품, 전지분유 1개 제품, 요구르트는 3개 제품은 표시된 성분과 일치하였으나 조제분유 7개 제품 중 조제우유 분유 1개 제품에서 우유/산양유로 나타났으며 조제산양분유 1개 제품에서는 산양유/우유로 나타났다고 나머지 5개 제품은 표시성분과 일치하였다(Fig. 5, 6, Table 1).
- Duplex PCR 분석 결과 4개 시유, 3개 요구르트, 1개 전지분유는 표시된 성분과 완전히 일치하였다. 그러나 7개의 조제분유 중 5개만 표시성분과 일치하고 2개 조제분유제품은 산양유와 우유가 각각 오염되어 있는 것으로 나타났다. 제안된 duplex PCR 분석은 산양유에 들어있는 우유를 0.
- 본 실험에 사용된 소의 미토콘드리아 12S rRNA 유전자를 증폭시키기 위한 primer로 12S-FW와 12S-REV를 이용하여 산양유와 우유에 대해 simplex PCR을 실시한 결과 산양유에서는 단편이 나타나지 않고 우유에서만 223 bp의 단편을 관찰할 수 있었다(Fig. 1). 이런 결과는 본 실험에서 사용된 소의 primer가 산양유하고는 교차반응을 하지 않고 우유에서만 특이적으로 반응하여 증폭시키는 특이성을 가진 것으로 볼 수 있어 소의 primer는 산양유내에 있는 우유를 분석하는데 사용될 수 있다.
- 또한 우유조제분유제품 1개의 경우 뚜렷하게 산양 특이성 326 bp의 밴드가 보여 산양유가 오염된 것으로 보이며 이런 결과는 Bottero 등 (2003)이 보고한 multiplex PCR의 경우 산양 primer가 소 primer비해 더 민감하게 반응한다는 견해에 비추어 볼 때 오염된 미량의 산양유가 강한 밴드로 나타난 것으로 생각된다. 본 연구에서 실시한 duplex PCR 방법이 산양유에 오염된 우유를 측정하거나 우유에 들어 있는 산양유를 동정하는데 우유와 산양유를 one-step으로 동시에 측정되며 민감도가 높은 방법이라고 생각된다. 국내 상업적인 산양조제분유제품에 미량의 우유분유가 오염된 것과 특히, 우유조제분유제품에 산양유가 오염된 것은 매우 흥미로운 것으로 사료된다.
- Bottero 등(2003)의 경우 multiplex PCR을 이용하여 19종류의 상업용 치즈를 분석한 결과 4종류가 제품에 표시된 것과 일치하지 않는 것으로 나타났다. 본 연구에서 제시된 duplex PCR 방법도 산양분유제품 1개에서 희미한 223 bp의 우유 특이성 밴드가 확인되는 것으로 보아 유제품의 측정한계치 정도로 우유가 오염된 것으로 생각된다. 또한 우유조제분유제품 1개의 경우 뚜렷하게 산양 특이성 326 bp의 밴드가 보여 산양유가 오염된 것으로 보이며 이런 결과는 Bottero 등 (2003)이 보고한 multiplex PCR의 경우 산양 primer가 소 primer비해 더 민감하게 반응한다는 견해에 비추어 볼 때 오염된 미량의 산양유가 강한 밴드로 나타난 것으로 생각된다.
- 산양 primer와 소의 primer을 모두 이용하여 우유, 산양유 및 혼합유에 대하여 duplex PCR을 실시한 Fig. 3에서 보면 우유시료에서는 소 primer만 반응하여 233 bp의 우유 특이성 밴드가 관찰되고, 산양유에서는 산양 primer만 반응하여 326 bp의 산양 특이성 밴드만 나타났으며 혼합 유에서는 산양 primer와 소 primer 모두가 반응하여 233 bp의 소의 특이성 밴드와 326 bp의 산양 특이성 밴드가 동시에 나타난 것을 볼 수 있었다. 이런 결과는 본 실험에서 사용된 duplex PCR 방법(Fig.
- 본 연구에서는 우유와 산양유를 검출하기 위해 소와 산양의 미토콘드리아 12S rRNA 유전자를 증폭하는 primer 를 사용한 duplex PCR 방법을 유제품에 적용하였다. 소의 미토콘드리아 12S rRNA 유전자를 증폭하는 primer을 사용하여 simplex PCR을 실시한 결과, 소 primer의 경우 우유에서는 223 bp의 특이성 밴드가 나타났으나 산양유에서는 증폭된 밴드가 나타나지 않았다(Fig. 1). Löpez-Calleja 등(2004)은 12SM-FW/12SBT-RV primer을 이용하여 우유, 산양유 및 양유에 대하여 PCR을 실시한 결과, 우유에서만 223 bp의 밴드를 얻고 산양유와 양유에서는 증폭된 밴드가 없었다.
- 시중에 유통 중인 15개 제품에 표시된 우유제품과 산양유제품에 duplex PCR을 적용한 결과에서 보면 조사된 시유 4개 제품, 요구르트 3개 제품, 전지분유 1개 제품 그리고 조제분유 7개 제품 중 5개 제품은 표시성분과 일치하였으나 조제우유분유 1개 제품과 조제산양분유 1개 제품이 표시성분과 일치하지 않고 산양유와 우유가 오염된 것으로 나타났다(Fig. 5, 6, Table 1). Bottero 등(2003)의 경우 multiplex PCR을 이용하여 19종류의 상업용 치즈를 분석한 결과 4종류가 제품에 표시된 것과 일치하지 않는 것으로 나타났다.
- 외국의 경우는 우유, 산양유, 양유, 버펄로우유 등 많은 종류의 젖이 유통되므로 유제품을 제조시 혼입되는 경우가 있어 multiplex PCR을 이용하여 혼입되는 젖을 검출하는 방법을 개발하고 있는 실정이지만 국내에서는 주로 유통되는 젖은 우유와 산양유이므로 duplex PCR을 이용하여 국내우유 및 산양유제품을 측정하는데 duplex PCR이용 가능성을 제시하게 되었으며, 본 연구에서 제시된 duplex PCR 방법은 유제품의 품질 관리 시 산양유와 우유를 동정하는 고전적인 방법을 대체 할 수 있는 빠르고 효과적인 방법이라고 생각된다.
- 3은 산양 primer와 소의 primer을 모두 이용하여 우유, 산양유 및 혼합유에 대하여 duplex PCR을 실시한 것이다. 우유에서는 소 primer만 반응하여 233 bp의 우유 특이성 밴드가 관찰되고, 산양유에서는 산양 primer만 반응하여 326 bp의 산양 특이성 밴드만 나타났으며 혼합유에서는 산양 primer와 소 primer 모두가 반응하여 233 bp의 소의 특이성 밴드와 326 bp의 산양 특이성 밴드가 동시에 나타난 것을 볼 수 있었다. Fig 4는 산양 primer와 소의 primer을 모두 이용하여 산양유에 우유를 50%부터 0.
- 3에서 보면 우유시료에서는 소 primer만 반응하여 233 bp의 우유 특이성 밴드가 관찰되고, 산양유에서는 산양 primer만 반응하여 326 bp의 산양 특이성 밴드만 나타났으며 혼합 유에서는 산양 primer와 소 primer 모두가 반응하여 233 bp의 소의 특이성 밴드와 326 bp의 산양 특이성 밴드가 동시에 나타난 것을 볼 수 있었다. 이런 결과는 본 실험에서 사용된 duplex PCR 방법(Fig. 3)이 simplex PCR방법(Fig. 1, 2)과 비교해도 동등한 수준의 특이성을 갖고 우유와 산양유를 동시에 측정하며, one-step으로 신속히 측정하는 것을 알 수 있다. Kotowiez 등(2007)에 의하면 소 primer와 산양 primer을 이용하여 duplex PCR을 실시한 결과 300 bp의 소의 특이성 밴드와 444 bp의 산양 특이성 밴드를 나타내었다.
- 2는 산양의 미토콘드리아 12S rRNA 유전자를 증폭하는 primer인 sense 144와 antisense 469을 이용하여 산양유와 우유에 대해 simplex PCR을 실시한 결과로 산양유에서만 326 bp 의 밴드가 관찰되었다. 이런 결과는 본 실험에서 사용된 산양의 primer가 우유하고는 교차반응을 하지 않고 산양유에서만 특이적으로 반응하여 증폭시키는 특이성을 가진 것을 알 수 있었다.
- 그러나 7개의 조제분유 중 5개만 표시성분과 일치하고 2개 조제분유제품은 산양유와 우유가 각각 오염되어 있는 것으로 나타났다. 제안된 duplex PCR 분석은 산양유에 들어있는 우유를 0.1%까지 측정할 수 있는 민감하고 신속한 방법이다. Duplex PCR 분석은 유제품 속에 들어있는 우유와 산양유를 one-step 방법으로 동시에 탐지할 수 있다.
후속연구
- 1). 이런 결과는 본 실험에서 사용된 소의 primer가 산양유하고는 교차반응을 하지 않고 우유에서만 특이적으로 반응하여 증폭시키는 특이성을 가진 것으로 볼 수 있어 소의 primer는 산양유내에 있는 우유를 분석하는데 사용될 수 있다. Fig.
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