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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 라베프라졸의 액상추출법(liquid liquid extraction)으로 LC-MS/MS 분석법을 개발·검증하고, 이 방법을 사용하여 36명의 건강한 한국인 성인 남성을 대상으로 기존 시판 제제인 (주)한국얀센 “파리에트정®”(라베프라졸 나트륨 10 mg) 1정을 경구 투여하여 생체이용률에 따른 약물속도론적 파라미터 등을 구하여 보고자 하였다.
제안 방법
- “파리에트정®” 1정씩을 지원자 36명에게 경구 투여한 후 일정 시간마다 채혈하여 얻은 전체 피험자에 대한 혈장 중 평균 농도를 구하였다.
- 피크 검출은 triple-quadrupole mass spectrometry를 이용하여 MRM (multiple reaction monitoring) 방법으로 검출하였고, ionization은 Z-spray를 이용한 electrospray ionization (ESI) mode를 사용하였다. Cone voltage는 각각 22 V (Rabeprazole), 22 V (omeprazole), Source 온도는 100℃, Desolvation 온도는 350℃로 설정하였다. 또한 MRM mode를 이용한 rabeprazole과 omeprazole의 검출은 500 ms dwell time으로 분석하였으며, 각각의 protonated molecular ion의 m/z는 360.
- LC-MS/MS 조건 - 혈장 중 라베프라졸 정량은 이미 보고된 분석법7) 을 참조하여 전처리된 혈장시료를 다음의 LC-MS/MS 조건에서 정량하였다. 이동상으로 100% methanol : 10 mM ammonium acetate (pH 9.
- 각각의 표준혈장 200 µL에 내부표준물질(500 ng/mL) 20 µL를 가하고 여기에 유기용매(ethyl acetate) 1.5 mL를 첨가하여 추출하였다.
- 감도(정량 한계)는 크로마토그램상에서 신호대 잡음비(signal to noise ratio)를 10 이상으로 하고 정밀성이 20% 이하, 정확성이 80~120%로 나타나야 한다는 조건을 만족하는 농도로 결정 하였다.
- 건강한 성인의 대조혈장과 대조혈장에 내부표준물질과 라베프라졸을 함께 가한 것 및 라베프라졸 정제 투여 후 3시간째의 혈장을 본 시험 방법에 따라 LC-MS/MS로 분석하였다. 라베프라졸의 피크 유지시간은 약 1.
- 검량선 작성 - 라베프라졸 표준품을 50% 메탄올에 녹여 라베프라졸로서 1,000 µg/mL로 만든 후 냉장 보관시키고, 이 용액을 50% 메탄올 용액과 냉동 보관하였던 공혈장으로 희석하여 라베프라졸의 혈장 중 농도가 각각 1, 5, 10, 50, 100, 500 ng/mL 농도가 되도록 혈장 시료를 만들었다.
- Cone voltage는 각각 22 V (Rabeprazole), 22 V (omeprazole), Source 온도는 100℃, Desolvation 온도는 350℃로 설정하였다. 또한 MRM mode를 이용한 rabeprazole과 omeprazole의 검출은 500 ms dwell time으로 분석하였으며, 각각의 protonated molecular ion의 m/z는 360.10 과 346.09이며, collision energy를 14와 13(임의단위)로 하여 생성된 product ion의 m/z는 242.21과 198.09으로 monitoring 하였다(Figure 2).
- 라베프라졸의 LC/MS/MS 분석법의 유효성을 검토하여 생체이용률 측정을 위한 표준 지침을 마련하고자 식품의약품안정청이 고시한 제 2007-65호(2007. 09. 20), 생물학적동등성시험기준6)에 근거하여 36명의 건강한 한국인 성인 남성을 대상으로 (주)한국얀센 “파리에트정®”(라베프라졸 나트륨 10 mg) 1정씩을 36명의 지원자에게 경구 투여하여 얻은 각 피험자의 약물속도론적 파라미터인 AUCt, Cmax, Tmax 및 T1/2 을 K-BE Test 2007 (version 1.1.0)을 이용해 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 모든 지원자는 정해진 투약일 10일 전부터 항생제 및 진통제 등을 포함하는 일체의 약물 복용을 금지시켰고, 시험 전날 오후 8시부터 시험 당일 투약 후 4시간까지는 금식시켰으며, 시험 기간 중에는 연구자의 지시에 따라 모두 같은 식단의 식사 및 경미한 활동을 하게 하였다.
- 생체이용률 측정을 위하여 36명의 지원자에 대하여 각각 동일 투약 일에 투여하고, 투약량은 “파리에트정®”(라베프라졸 나트륨으로서 10 mg) 1정을 경구투약하였다.
- 약물분석 기기로는 Waters 2795 HPLC system (Waters Ltd., Watford, 영국), Waters Quattro Micro API mass spectrometer (Waters Ltd., Watford, 영국)와 Shiseido UG120 C18 (50×2.0 mm I.D., S-3 µm, Tokyo, 일본)컬럼, multipurpose centrifuge (Kubota 5100, Osaka, 일본), vortex mixer (Vision KMC-1300V, 경기도, 한국), pH 측 정기(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, 미국), deep freezer (일신, 경기도, 한국) 등을 사용하였다.
- 최종적으로 150 µL의 이동상으로 녹여 그 중 10 µL를 LC-MS/MS에 주입하였다. 여기에서 얻은 내부표준물질의 피크 면적비에 대한 라베프라졸의 피크 면적비를 가지고 검량선을 작성하였으며, 하루에 실험을 5번 시행하여 일내 재현성을 구하고 연속하여 5일간 실험을 시행하여 일간 재현성을 구하였다.
- 5세이었다. 이들로부터 모두 참가동의서를 받은 후 생체이용률 시험을 실시하였다.
- 정밀성은 라베프라졸과 내부표준물질의 피크 면적비의 표준편차를 라베프라졸과 내부표준물질의 피크 면적비의 평균 값으로 나눈비의 백분율(%)로서 구하였다. 하루에 5번 시행하여 일내 정밀성(% C.
- 로 표시)을 구하였다. 정확성은 검량선에 의하여 정량한 농도의 평균값을 기지의 농도로 나눈 비의 백분율(%)로서 구하였다. 감도(정량 한계)는 크로마토그램상에서 신호대 잡음비(signal to noise ratio)를 10 이상으로 하고 정밀성이 20% 이하, 정확성이 80~120%로 나타나야 한다는 조건을 만족하는 농도로 결정 하였다.
- 5, 5, 6, 8, 10 및 12시간의 총 13시점에서 실시하였다. 채혈 방법은 I.V. catheter 중에 남아 있는 헤파린 처리 생리식염수를 완전히 제거하기 위해 매번 약 1 mL의 혈액을 빼내어 버리고 약 7 mL의 혈액을 채취하였다. 채혈 후마다 I.
- 채혈은 약물의 혈중 소실 반감기를 토대로 반감기의 3배 이상인 12시간 동안 실시하였다. 채혈 횟수는 약물 투약 직전과 투약 후 1, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 8, 10 및 12시간의 총 13시점에서 실시하였다. 채혈 방법은 I.
- catheter 중에 남아 있는 헤파린 처리 생리식염수를 완전히 제거하기 위해 매번 약 1 mL의 혈액을 빼내어 버리고 약 7 mL의 혈액을 채취하였다. 채혈 후마다 I.V. catheter 안에 잔류하는 혈액의 응고를 방지하기 위하여 주사용 헤파린을 넣은 주사용 생리식염수를 주입하였다. 채혈된 혈액은 3,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 혈장을 분리하였다.
- 피험자들 모두에게 heparin-locked catheter (BD Angiocath Plus™, 22G, Boin Medica, Kyungbuk, 한국)를 팔 또는 손등의 정맥부위에 부착하고, 피험자간 복약 시간의 차이는 채혈시간을 고려하여 약 1분 간격으로 실시하였다.
- 혈장만을 플라스틱 튜브에 옮기고 이 튜브를 영하 70℃의 초저온 냉동기에 넣어 분석시까지 보관하였다. 피험자들의 혈액 채취는 일반인들의 출입이 통제된 격리된 방에서 실시하였으며, 사용하는 기구는 완전 멸균된 1회용으로 하였다. 피험자의 입원, 채혈 및 휴식 등의 모든 일은 경희의료원 임상의학연구소에서 타인과 격리된 상태에서 이루어졌다.
- 정밀성은 라베프라졸과 내부표준물질의 피크 면적비의 표준편차를 라베프라졸과 내부표준물질의 피크 면적비의 평균 값으로 나눈비의 백분율(%)로서 구하였다. 하루에 5번 시행하여 일내 정밀성(% C.V.로 표시)을 구하였고, 5일간 실험을 반복 시행하여 일간 정밀성(% C.V.로 표시)을 구하였다. 정확성은 검량선에 의하여 정량한 농도의 평균값을 기지의 농도로 나눈 비의 백분율(%)로서 구하였다.
- 혈장 중 농도 계산 - 얻어진 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크 면적에 대한 라베프라졸의 피크 면적비를 구하여 미리 작성한 검량선으로부터 혈장 중 라베프라졸의 농도(ng/mL)를 산출하였다.
- 혈장시료의 처리 - 피험자로부터 채취하여 얻은 동결 혈장을 실온에 방치하여 녹인 후 200 µL을 취하여 내부표준물질 20 µL를 넣은 후 검량선 작성시와 동일한 처리과정을 거친 시료 10 µL를 LC-MS/MS에 주입하였다.
대상 데이터
- Louis, Mo, 미국)로부터 구입하였다. HPLC용 메탄올 (J.T.Baker Chemical Philipsburg, NJ, 미국), 생리식 염수 및 헤파린(이상 (주)중외제약, 서울, 한국)은 시판품을, 증류수는 Milli Q (Millipore Co., Milford, MA, 미국)에서 18 MΩ-cm로 통과시킨 것을 사용하였다.
- 18)으로 라베프라졸 나트륨 10 mg을 함유하는 정제이다. 라베프라졸 나트륨 표준품은 유영제약 주식회사(충북 진천, 한국)로부터 제공받았고, 내부표준물질로 사용한 오메프라졸 표준품은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo, 미국)로부터 구입하였다. HPLC용 메탄올 (J.
- 20) 생물학적동등성시험기준6)에 따라 지원자 모집공고를 통하여 만 19~55세의 건강한 성인으로서 과거에 소화기계, 간장, 신장, 심혈관계, 중추신경계, 내분비계 및 혈액질환의 병력이 없고 현재 타 약물을 복용하고 있지 않은 지원자를 모집 공고하고 지원신청서를 받아 지원자 49명을 모집하였다. 서울시 동대문구 회기동 1번지 소재 경희의료원에서 지원자 49명에 대한 건강진단을 실시하여, 생물학적동등성시험기준6)의 선정기준에 모두 합당하고 제외기준에 해당하지 않는 자로서 생물학적동등성시험에 적합한 건강한 사람으로 판정된 36명을 피험자로 선정하였다. 피험자로 선정된 36인의 평균 체중은 67.
- 시험에 사용된 시험약은 (주)한국얀센 “파리에트정®”(제조번호:11117, 유효기한:2009. 4. 18)으로 라베프라졸 나트륨 10 mg을 함유하는 정제이다.
- 이동상으로 100% methanol : 10 mM ammonium acetate (pH 9.42)(25:75, v/v)를 사용하였고, 컬럼은 Shiseido UG120 C18 (50×2.0 mm I.D., S-3 µm)을 사용하였으며, 유속은 0.2 mL/min이었다.
- 피험자는 식품의약품안전청이 고시한 제2007-65호(2007. 09. 20) 생물학적동등성시험기준6)에 따라 지원자 모집공고를 통하여 만 19~55세의 건강한 성인으로서 과거에 소화기계, 간장, 신장, 심혈관계, 중추신경계, 내분비계 및 혈액질환의 병력이 없고 현재 타 약물을 복용하고 있지 않은 지원자를 모집 공고하고 지원신청서를 받아 지원자 49명을 모집하였다. 서울시 동대문구 회기동 1번지 소재 경희의료원에서 지원자 49명에 대한 건강진단을 실시하여, 생물학적동등성시험기준6)의 선정기준에 모두 합당하고 제외기준에 해당하지 않는 자로서 생물학적동등성시험에 적합한 건강한 사람으로 판정된 36명을 피험자로 선정하였다.
데이터처리
- 모든 측정치와 계산치는 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- “파리에트정®”을 각각 1정씩 36명의 지원자에게 경구 투여하여 얻은 각 피험자의 약물속도론적 파라미터인 AUCt, Cmax, Tmax 및 T1/2는 K-BE Test 2007 (version 1.1.0)를 이용하여 구하였다.
- 2 mL/min이었다. 피크 검출은 triple-quadrupole mass spectrometry를 이용하여 MRM (multiple reaction monitoring) 방법으로 검출하였고, ionization은 Z-spray를 이용한 electrospray ionization (ESI) mode를 사용하였다. Cone voltage는 각각 22 V (Rabeprazole), 22 V (omeprazole), Source 온도는 100℃, Desolvation 온도는 350℃로 설정하였다.
성능/효과
- 이때 본 분석방법의 정밀성은 일내, 일간 모두 15% 이하, 정량한계농도에서의 정밀성은 20% 이하였고, 정확성 은 일내, 일간 모두 85~115% 이내, 정량한계농도에서의 정 확성은 80~120% 이내였으며, 정량한계는 1 ng/mL이었다. (Table I) 이로부터 혈중 라베프라졸에 대한 상기 LC-MS/ MS 분석법은 인체에 대한 생체이용률시험에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
- 02시간인 것으로 보고되어있다.1) 위산의 분비억제는 투여 1시간 이내에 시작되며, 약의 94.8~97.5%가 혈장 단백질과 결합한다. 주로 간의 CYP450에 의해 대사되고, 투여용량의 90%가 뇨로 배설된다.
- 1. 혈장을 LLE로 전처리하여 LC/MS/MS 크로마토그램으로 분석한 결과 혈장성분 등 내부 간섭물질의 방해 없이 라베프라졸 및 내부표준물질인 오메프라졸을 분리하였다.
- 2. 혈장시료로부터 구한 라베프라졸의 검량선은 R2≥0.99 로 1~ 500 ng/mL 범위에서 양호한 직선성을 나타내었고 정량 한계는 1 ng/mL이었다.
- 3. 36명의 건강한 한국인 지원자를 대상으로 “파리에트정®” 1정을 경구투여한 결과 AUCt는 691.36±321.88 nghr/mL, Cmax는 353.21±131.52 ng/mL, Tmax는 3.4±1.1 hr 및 T1/2는 1.37±0.75 hr이었다.
- 건강한 성인의 대조혈장과 대조혈장에 내부표준물질과 라베프라졸을 함께 가한 것 및 라베프라졸 정제 투여 후 3시간째의 혈장을 본 시험 방법에 따라 LC-MS/MS로 분석하였다. 라베프라졸의 피크 유지시간은 약 1.13분, 내부표준물질의 피크 유지시간은 약 1.14분이었으며, 본 실험의 분석 조건에서 라베프라졸 및 내부표준물질은 기타 혈장 성분들과 잘 분리되었다(Figure 3). 혈장 시료로부터 구한 라베프라졸의 계산식은 Y=0.
- 99 로 1~ 500 ng/mL 범위에서 양호한 직선성을 나타내었고 정량 한계는 1 ng/mL이었다. 분석법을 검증한 결과 일내 재현성과 일간 재현성의 평균 정밀성과 정확성이 모두 기준 값 이내에 들어 이 분석법은 충분한 감도와 정확성 및 정밀성이 있었다.
- 감도(정량 한계)는 크로마토그램상에서 신호대 잡음비(signal to noise ratio)를 10 이상으로 하고 정밀성이 20% 이하, 정확성이 80~120%로 나타나야 한다는 조건을 만족하는 농도로 결정 하였다. 이때 본 분석방법의 정밀성은 일내, 일간 모두 15% 이하, 정량한계농도에서의 정밀성은 20% 이하였고, 정확성 은 일내, 일간 모두 85~115% 이내, 정량한계농도에서의 정 확성은 80~120% 이내였으며, 정량한계는 1 ng/mL이었다. (Table I) 이로부터 혈중 라베프라졸에 대한 상기 LC-MS/ MS 분석법은 인체에 대한 생체이용률시험에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
후속연구
- 이상의 실험 결과를 종합해보면 라베프라졸의 LC/MS/ MS 분석법 및 생체이용률 시험을 수행하여 얻은 실험결과를 향후 약물치료에 유용한 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료되었다.
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