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문제 정의
- 이에 저자는 조구등이 신경세포에 대한 산화적 손상이나 허혈성 손상에 보호작용이 있음에 주목하고 중추신경 손상 시 수반하는 gliosis에 미치는 영향을 조사하기 위하여 세포독성을 측정하고, gliosis에 관여하는 CD81과 GFAP, MAG의 발현 변화를 관찰한 바 약간의 지견을 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에 저자는 조구등의 신경세포에 대한 작용에 주목하고 중추신경 손상시 수반하는 교세포화도 미치는 영향을 조사하였다. 신생 흰쥐에서 얻은 성상세포를 배양하여 세포독성을 측정하고, 교세포화에 관여하는 CD81과 GFAP, MAG의 발현 변화에 대해 세포수준에서 정량적 관찰을 하고, 면역염색법으로 확인하였으며, RNA수준에서 변화도 측정을 하였다.
- 본 연구는 중추신경계 손상시 나타나는 CD81과 GFAP, MAG의 발현에 대하여 조구등이 어떠한 영향을 미치는지를 알아보기 위해 신경세포를 배양하여 시험관분석에 의한 조사와 흰쥐를 이용한 동물실험을 실시하였으며 다음과 같은 결과를 얻었다.
제안 방법
- 생후 8일된 Sprague-Dawley계 흰쥐를 얼음에 넣어서 마취시킨 후에 뇌를 꺼내서 1×HBSS을 넣고 수막을 제거하고 대뇌 피질을 잘게 부순 다음 75㎠ flask에 총량이 10㎖이 되도록 1×HBSS를 넣고 80rpm, 10분 동안 교반하였다.
- 이후 3-4일에 한번씩 cell culture media(10% FBS , 100unit streptomycin/penicillin, DMEM)를 바꾸어 주면서 세포의 상태를 관찰하여 flask에 세포가 90∼100% 자랐을 경우에 0.25% trypsin/EDTA(Hyclon)으로 계대 배양하였다.
- 조구등extract를 10% FBS의 media에 0.05%, 0.1%, 1%, 5%, 10% 농도별로 녹인 후에 0.45 filter를 이용해서 여과하였다. 96 well plate의 한 well당 1x104개의 astrocytes를 seeding한 후에 준비된 조구등 용액을 농도별로 처리하고 16시간 배양하였다.
- 조구등이 astrcytes에서 CD81, GFAP 그리고 MAG 발현에 미치는 영향을 알아 보기위해 cell-based ELISA를 실시하였다.
- astrocyte를 seeding 하였다. 세포가 plate에 붙으면 조구등을 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1% 농도별로 10%FBS의 media에 녹인 후에, 0.45 filter을 이용해서 filtration하여 세포에 처리한 다음 16시간 배양하였다. 16시간 후 media를 제거하고, PBS 로 한번 씻어준 다음에 100㎕ 3.
- 7% formaldehyde로 상온에서 10분 cell을 고정하였다. 다음 PBS+0.1% Triton X-100(PBST)으로 5분씩 3회 세척하고 PBST+1%BSA 로 상온에서 1시간 locking한 뒤에 1차 항체(1:100)를 PBST+1%BSA에 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 PBST로 5분씩 3회 세척한 후에 2차 항체를(1:1000)를 동일하게 PBST-1%BSA에 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 PBST로 2회 세척하고 PBS로 한번 세척하였다. TMB(sigma) 용액을 각 well 당 100㎕씩 넣고 5분정도 반응 시킨 후에 TMB stop solution(sigma) 100㎕로 반응을 정지시킨 다음 microplate reader로 450㎚ 에서 흡광도를 측정하였다.
- 180-200g된 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 ketamin/rompun 으로 복강마취 하여 두피를 절개 후에 두개골을 노출시켜서 대뇌 피질에 3mm 깊이의 상처를 만들고 다시 두피를 덮었다. 수술 후 7days, 14dyas, 30 days 동안 조구등 extract를 0.5g/kg 용량으로 꼬리 정맥주사로 투여하였다.
- 이렇게 해서 얻어진 RNA를 가지고 ImProm-IITM Reverse Transcription System (Promega)을 이용해서 RT-PCR을 수행 (70℃ 5분, 4℃ 10분, 25℃ 5분, 42℃ 1시간, 70℃ 15분) 하였다. 얻어진 cDNA와 아래와 같은 sequence primer를 사용하여 2X PCR Master mix(Solgent)로 PCR을 수행 (30 cycle, 94℃ 15초, 60℃ 1분, 72℃ 1분)하였다.
- 얻어진 PCR product들은 1xTBE buffer에서 0.1 μg/ml ethidium bromide이 포함된 1% agarose gel에 전기영동 시킨 다음 자외선 발광장치로 확인하였다.
- 조직상태에서 단백질의 발현의 관찰은 30-35㎛ 두께의 조직을 BBS로 2회 세척하고, pre-incubation Buffer (2% BSA, 0.05% triton X -100 in BBS)로 30분간 반응시켰다. 반응 후에 1차 antibody(1:100~200)을 0.
- 05% triton X -100 in BBS)로 30분간 반응시켰다. 반응 후에 1차 antibody(1:100~200)을 0.4% BSA를 포함한 BBS에 희석하여 조직을 RT에서 2시간 shaking 하면서 반응시키고 난 뒤에 BBS로 2회 세척하고 HRP가 결합되어 있는 2차 antibody(1:2000) 을 0.4% BSA 가 포함된 BBS에 희석하여 RT에서 2시간 반응시켰다. 다음 조직을 세척하고 DAB solution (1mg/㎖, pH7.
- 6 Tris-Cl)에 H2O2(3㎕/㎖)를 첨가하여 반응시킨 다음 PBS로 세척하여 반응을 정지시켰다. 염색된 조직을 slide에 mounting하고 cover glass로 덮은 다음 현미경으로, 단백질의 발현을 관찰하였다.
- 조구등의 세포독성 유무를 관찰하기 위하여 astrocytes 에 각각 0.05%, 0.1%, 1%, 5%, 10% 농도의 조구등 물추출물을 16시간 처리하여 MTT assay를 실시하였다. 0.
- 조구등이 신경 재생에 관여하는 CD81, GFAP 그리고 MAG의 발현에 대한 영향을 알아보기 위해 각 농도의 조구등 물추출물을 astrocyte에 16시간 전처리한 후 cellbased ELISA방법으로 정량적 분석을 하였다. 그 결과 아래와 같은 결과를 얻었다.
- 조구등 물추출물이 CD81과 GFAP의 발현에 미치는 영향을 단백질 수준에서 살펴보고자 astrocyte에 0.5%조구등 물추출물을 16시간 전처리한 후 western blotting 을 실시하였다. 그 결과 조구등 물추출물은 CD81와 GFAP 발현을 감소시키는 것으로 나타났다(Fig.
- 조구등 물추출물이 CD81과 GFAP의 발현 감소를 나타냄으로 이런 감소가 RNA의 감소에 기인한 것인지를 관찰하고자 대뇌에 손상을 입힌 흰쥐에 조구등 extract를 0.5g/kg 투여하고 14일 및 30일 후에 뇌조직을 적출하여 RT-PCR을 실시하였으며 결과는 다음과 같았다 (Fig. 6). 즉 CD81과 GFAP의 발현은 감소하였으며 14일에 비하여 30일에 더욱 감소가 두드러졌다.
- 손상된 흰쥐의 뇌조직에서 조구등 물추출물이 CD81, GFAP, 그리고 MAG의 발현에 대한 영향을 알아보고자 면역조직화학을 실시하였다.
- 흰쥐의 대뇌 피질에 3mm 깊이의 손상을 가한 후 조구등 물추출물을 투여하고 7일과 30일 후에 뇌조직을 적출하여 현미경으로 CD81, GFAP 그리고 MAG의 발현을 관찰하였다 (Fig. 7). 그 결과 CD81과 GFAP 및 MAG의 발현이 감소됨을 관찰하였으며 손상 후 7일째에 비하여 손상 후 30일째에서 더욱 감소가 두드러지는 것으로 나타났다.
- 이에 저자는 조구등의 신경세포에 대한 작용에 주목하고 중추신경 손상시 수반하는 교세포화도 미치는 영향을 조사하였다. 신생 흰쥐에서 얻은 성상세포를 배양하여 세포독성을 측정하고, 교세포화에 관여하는 CD81과 GFAP, MAG의 발현 변화에 대해 세포수준에서 정량적 관찰을 하고, 면역염색법으로 확인하였으며, RNA수준에서 변화도 측정을 하였다. 한편 흰쥐를 이용한 동물실험을 통하여 조직학적 관찰도 병행하였다.
- 신생 흰쥐에서 얻은 성상세포를 배양하여 세포독성을 측정하고, 교세포화에 관여하는 CD81과 GFAP, MAG의 발현 변화에 대해 세포수준에서 정량적 관찰을 하고, 면역염색법으로 확인하였으며, RNA수준에서 변화도 측정을 하였다. 한편 흰쥐를 이용한 동물실험을 통하여 조직학적 관찰도 병행하였다.
- 세포독성시험에서 농도 의존적으로 세포독성이 관찰되었으며 0.5%이하의 농도에서 비교적 낮은 세포 독성을 보이므로 적정실험 농도를 0.5%로 정하였다.
- Cell based ELISA는 Western blot에 비하여 짧은 시간에 많은 양의 실험을 할 수 있으며 정량적인 결과를 얻을 수 있는 실험방법이다. 따라서 본 실험에서는 조구등 물추출물을 다양한 농도로 처리하여 CD81, GFAP, MAG의 발현을 관찰하였다. CD81과 GFAP는 대부분 농도에서 유의하게 감소하는 경향이 있었고, MAG도 유의성은 없었으나 감소하였다.
- CD81과 GFAP는 대부분 농도에서 유의하게 감소하는 경향이 있었고, MAG도 유의성은 없었으나 감소하였다. 단백질의 발현은 RNA의 작용에 의한 것이므로 RNA 수준에서 변화를 측정하기 위해 RT PCR을 시행 하였다. PCR 결과 조구등 물추출물이 CD81과 GFAP의 발현을 RNA수준에서 감소시켰으며, 14일에 비하여 30일에 더욱 감소가 두드러졌다.
- 이와 같이 세포에서 관찰한 조구등의 효과를 동물에서 확인하기 위해 인위적으로 대뇌에 stab injury를 가하여 실험 모델을 만들고 조구등을 투여하여 대조군과 손상부위를 비교하였다. 대조군에 비해 CD81, GFAP, MAG이 비교적 적게 발현하였고 시간이 경과할수록 더욱 감소하는 경향이 있었다.
- 원심분리 후 상층액을 버리고 pellet의 양을 확인하고 10분간 말린 후 DEPC를 처리한 물을 적당량 넣어 55도에서 15분간 녹이고 -20℃에서 보관하였다. 이렇게 해서 얻어진 RNA를 가지고 ImProm-IITM Reverse Transcription System (Promega)을 이용해서 RT-PCR을 수행 (70℃ 5분, 4℃ 10분, 25℃ 5분, 42℃ 1시간, 70℃ 15분) 하였다. 얻어진 cDNA와 아래와 같은 sequence primer를 사용하여 2X PCR Master mix(Solgent)로 PCR을 수행 (30 cycle, 94℃ 15초, 60℃ 1분, 72℃ 1분)하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 조구등은 원광대학교 본초학교실에서 구입한 후 정선하여 실험에 사용하였다. 조구등 200g을 증류수 2,000ml에 넣고 3시간 동안 가열하여 추출한 다음 추출물을 Whatman 필터로 여과한 후 감압기로 농축하였다.
- 본 실험에 사용한 동물은 Sprague-Dawley계 7주된 숫컷 흰쥐(180-200g)를 다물 사이언스(대전)에서 구입하였으며 1주간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 180-200g된 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 ketamin/rompun 으로 복강마취 하여 두피를 절개 후에 두개골을 노출시켜서 대뇌 피질에 3mm 깊이의 상처를 만들고 다시 두피를 덮었다. 수술 후 7days, 14dyas, 30 days 동안 조구등 extract를 0.
데이터처리
- 모든 결과는 평균값±표준오차로 나타냈으며, 대조군과의 평균값 비교를 위해서 Student's paired T-test를 실시하였으며 통계적 유의성을 위한 유의수준은 p<0.05로 판정하였다.
이론/모형
- 조구등의 astrocytes에 대한 세포독성을 조사하기 위하여 MTT assay를 실시하였다.
성능/효과
- 1%, 1%, 5%, 10% 농도의 조구등 물추출물을 16시간 처리하여 MTT assay를 실시하였다. 0.05% 조구등 물추출물에서 98%, 0.1%에서 90%, 0.5%에서 72%의 세포 생존률을 보였고, 1%에서 26%, 5%에서 19%, 10%에서 10%의 비교적 낮은 세포 생존률을 보였다 (Fig. 1).
- 조구등 물추출물을 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1% 농도로 처리한 군의 경우 CD81 발현은 모든 농도에서 유의하게 감소하였고 특히 0.05%와 0.1%에서 감소가 더욱 현저하였다 (Fig. 2).
- 조구등 물추출물을 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1% 농도로 처리한 군의 경우 GFAP 발현은 0.05%를 제외한 모든 농도에서 유의성 있게 감소하였고 특히 0.5%와 0.1%에서 감소가 더욱 현저하였다 (Fig 3).
- 5%조구등 물추출물을 16시간 전처리한 후 western blotting 을 실시하였다. 그 결과 조구등 물추출물은 CD81와 GFAP 발현을 감소시키는 것으로 나타났다(Fig. 5).
- 7). 그 결과 CD81과 GFAP 및 MAG의 발현이 감소됨을 관찰하였으며 손상 후 7일째에 비하여 손상 후 30일째에서 더욱 감소가 두드러지는 것으로 나타났다.
- 특히 중추신경계 손상시 신경교 반흔(glial scar)의 생성으로 축삭 성장체(axonal growth cone)의 성장이 좌절되고 신경교 반흔 자체가 구조적 장벽을 형성하여 성장억제 요인으로 작용한다. 성상교세포는 다른 환경적 조건과 자극에 반응하여 성장 촉진 요인 또는 성장 억제 요인으로 작용하여 중추신경계 손상 시 주위 세포의 물질들과 치밀하게 결합하여 GFAP의 발현을 특징으로 하는 교세포화(gliosis)를 생성하고2,3) 결과적으로 신경재생을 억제함이 확인되었다1). 또한 치밀한 결합구조를 지닌 신경교 반흔의 조직 배양 실험을 통한 연구에서도 이들 구조에 의한 중추신경계 축삭 재생 억제 현상이 확인 되었다19,20).
- 따라서 이러한 일련의 연구를 바탕으로 gliosis와 관련되어 있는 GFAP와 CD81 및 신경재생 억제인자인 MAG의 발현 억제를 통하여 신경재생을 조절할 수 있으리라는 추론이 가능하다.
- 이상의 연구 결과를 살펴보면 조구등은 혈압강하 작용과 진경 항경련 진통 작용이 있음이 입증되었고, 최근 신경세포나 중추신경 조직에서 산화적 손상이나 허혈성 손상 등에 대해 보호 효과가 있음이 밝혀지고 있다.
- 따라서 본 실험에서는 조구등 물추출물을 다양한 농도로 처리하여 CD81, GFAP, MAG의 발현을 관찰하였다. CD81과 GFAP는 대부분 농도에서 유의하게 감소하는 경향이 있었고, MAG도 유의성은 없었으나 감소하였다. 단백질의 발현은 RNA의 작용에 의한 것이므로 RNA 수준에서 변화를 측정하기 위해 RT PCR을 시행 하였다.
- 단백질의 발현은 RNA의 작용에 의한 것이므로 RNA 수준에서 변화를 측정하기 위해 RT PCR을 시행 하였다. PCR 결과 조구등 물추출물이 CD81과 GFAP의 발현을 RNA수준에서 감소시켰으며, 14일에 비하여 30일에 더욱 감소가 두드러졌다. 따라서 Cell based ELISA나 Wester blot에서 관찰한 CD81, GFAP의 발현감소현상은 RNA의 감소에 기인한 것으로 생각된다.
- 이와 같이 세포에서 관찰한 조구등의 효과를 동물에서 확인하기 위해 인위적으로 대뇌에 stab injury를 가하여 실험 모델을 만들고 조구등을 투여하여 대조군과 손상부위를 비교하였다. 대조군에 비해 CD81, GFAP, MAG이 비교적 적게 발현하였고 시간이 경과할수록 더욱 감소하는 경향이 있었다.
- 이상의 결과를 보아 조구등은 중추신경계 손상 후 교세포화를 유도하는 CD81, GFAP, MAG를 RNA 단계에서 감소키는 기전에 의하여 중추신경계 손상 후 회복에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 아울러 향후 지속적인 연구를 통하여 조구등이 망막 손상이나 대뇌 및 척수 손상과 같은 중추신경계 손상의 회복 조절에 기여할 수 있으리라 사료된다.
- 1. 조구등 물추출물의 세포독성을 관찰한 결과 0.05% 조구등 물추출물에서 98%, 0.1%에서 90%, 0.5%에서 72%의 비교적 높은 세포 생존률을 보였다.
- 2. 조구등 물추출물은 Astrocytes에서 cell-ELISA로 분석한 결과 CD81과 GFAP의 발현을 유의하게 감소 시켰으며, MAG도 유의성은 없었으나 발현을 감소시켰다.
- 3. 성상세포에서 분리한 단백질을 western blot으로 분석한 결과 CD81과 GFAP의 양이 감소하였다.
- 4. PCR결과 조구등 물추출물이 CD81과 GFAP의 발현을 RNA수준에서 감소시켰으며, 14일에 비하여 30일에 더욱 감소가 두드러졌다.
- 5. 대뇌에 손상을 입은 흰쥐에서 조구등 물추출물 투여는 CD81, GFAP, MAG의 발현 감소를 보였다.
- The effect of the water extract of Uncariae ramulus et uncus (Uncariae)on the MTT assay. The administration of water extract of Uncariae showed about 98% of cell viability at 0.05%, 90% at 0.1% and 72% at 0.5%. Cell viability was decreased to 26% ,19% and 10% at 1%, 5% and 10% concentration respectively.
후속연구
- 이상의 결과를 보아 조구등은 중추신경계 손상 후 교세포화를 유도하는 CD81, GFAP, MAG를 RNA 단계에서 감소키는 기전에 의하여 중추신경계 손상 후 회복에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 아울러 향후 지속적인 연구를 통하여 조구등이 망막 손상이나 대뇌 및 척수 손상과 같은 중추신경계 손상의 회복 조절에 기여할 수 있으리라 사료된다.
- 이상의 결과로 미루어 보아 조구등은 중추신경 손상시 CD81과 GFAP, MAG의 발현을 감소시켜 gliosis를 억제하는 작용이 있는 것으로 생각되며 향후 중추신경손상의 회복에 활용될 수 있는 가능성을 시사 한다고 생각된다.
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