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문제 정의
- 따라서 까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물에 의한 세포 증식억제 효과가 탁월한 HL-60 세포에 대하여 까마귀쪽나무의 80%에탄올 추출물에 의한 암세포의 세포 증식 억제 효과 및 apoptosis 유도기전을 조사하였다.
- PARP는 핵 내에 존재하는 효소 중에 하나로서, 그 촉매부위는 apoptosis를 거치는여러 세포에서 효과적으로 caspase-3를 포함하는 여러 caspase에 의해 DNA 결합 부위로부터 절단되어 분리된다. 따라서 까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물에 의해서 HL-60 세포의 apoptosis 신호전달과정에서 caspase의 활성을 통한 PARP 분절로 apoptosis를 일으키는지를 조사하였다. PARP 분절의 상부 경로에 있는 caspase-9과 caspase-3는 apoptosis가 일어날 때 활성화되며, caspase-3가 apoptosis의 집행자로서 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
- 본 연구에서는 까마귀쪽나무의 추출물을 사용하여 HL-60 (human promyelocytic leukemia) 세포를 비롯한 여러 암세포를 대상으로 이 세포에 대한 세포증식억제 효과를 조사하였다. 까마귀쪽나무 추출물의 HL-60 세포에 대한 세포증식억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위하여, 핵의 형태학적변화, DNA 절편화 및 DNA content 변화를 알아보았으며, apoptosis 유도 신호전달 기전에 중요한 Bcl-2와 Bax의 증가와 이에따른 caspase-9, caspase-3 protease 활성화의 발현 양상을 조사하였다.
- 본 연구에서는 까마귀쪽나무의 추출물이 HL-60 백혈병 세포에서 Bcl-2의 발현 감소 및 caspase를 활성화함으로서 apoptosis를 유도하여 증식을 저해함을 밝혔다. 이와 같은 연구결과는 까마귀쪽나무 추출물이 항암제로 이용될 수 있는 근거를 시사하며, 항암 치료제 또는 예방제의 유효 성분 및 그 작용기전 연구에 중요한 기초자료가 될 것이라고 사료된다.
- 까마귀쪽나무 추출물의 HL-60 세포에 대한 세포증식억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위하여, 핵의 형태학적변화, DNA 절편화 및 DNA content 변화를 알아보았으며, apoptosis 유도 신호전달 기전에 중요한 Bcl-2와 Bax의 증가와 이에따른 caspase-9, caspase-3 protease 활성화의 발현 양상을 조사하였다. 이와 같은 연구로 HL-60 세포에 대한 까마귀쪽나무 추출물의 항암효과를 밝혀 효과적인 항암물질 개발의 재료로 사용가능한 근거를 제시하고자 하였다.
제안 방법
- HL-60(human promyelocytic leukemia) 세포는 한국 세포주은행(Korea Cell Line Bank)로부터 분양 받아서 사용하였다. 100 units/ml의 penicillin-streptomycin(GIBCO Inc, Grand Island, NY, USA)과 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS; GIBCO Inc, Grand Island, NY, USA)이 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2, humidified incubator에서 배양하였으며, 계대배양은 약 70~80%의 confluence가 되는 3~4일마다 한번씩 시행하였다.
- 10) Bax는 Bcl-2와 heterodimer를 형성함으로써 Bcl-2의 antiapoptosis effects를 방해한다.11) 따라서 본 실험에서 까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물을 처리하여 HL-60 세포에서 Bcl-2 및 Bax 발현양상을 조사하였다. 그 결과, Fig.
- Bcl-2의 발현량을 검토하기 위한 항체로는 mouse monoclonal anti-human Bcl-2 Ab (1 : 1000)(Santa Cruz Biotech, MA, USA), Bax의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human Bax Ab (1 : 1000)(Santa Cruz Biotech, MA, USA), PARP의 발현량을 검토하기 위한 항체로 rabbit polyclonal anti-human PARP Ab (1 : 1000)(Santa Cruz Biotech, MA, USA), caspase-3 발현량을 검토하기 위한 항체로 rabbit polyclonal anti-human caspase-3 Ab(1 : 1000)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)와 caspase-9의 Ab(1 : 1000)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)을 TTBS 용액에서 희석하여 사용하였으며, 반응은 상온에서 2시간 동안 진행하였다. 2차 항체로는 HPR(Horse Radish Peroxidase)이 결합된 anti-rabbit IgG(Amersham Prarmacia Biotech, NY, USA)와 anti-mouse IgG(Amersham Prarmacia Biotech, NY, USA)를 희석(1 : 5000)하여 이용하였으며, 반응은 상온에서 30분 동안 진행하였다. 그 후 membrane을 TTBS로 3회 세척하여 ECL 기질 Amersham Prarmacia Biotech, NY, USA)과 1~3분간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.
- 5) 살아있는 암세포 mitochondria의 탈수소 효소작용에 의하여 수용성의 노란색 MTT가 환원되어 형성되는 자주색을 띠는 비수용성의 formazan을 microplate(ELISA) reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여, 대사적으로 왕성하게 생존하는 세포의 수를 조사하였다. HL-60(2.
- Apoptosis의 분자적 기전을 밝히기 위해 anti-apoptosis protein으로 알려진 Bcl-2와 pro-apoptosis protein인 Bax의 발현을 관찰하였다. Apoptosis를 조절하는데 관여하는 여러 가지 유전자산물 중에서 제일 먼저 알려진 암유발 유전자 산물의 하나인 Bcl-2는 분자량 26 KDa의 단백질로서 다른 암 유전자 단백질과는 달리 세포증식에는 관여하지 않고 chemoresistance에 중요한 역할을 담당하여 여러 종류의 자극에 대해 apoptosis를 억제하는 특이적 기능을 가지고 있다고 알려져 있다.
- 1% Tween20) 용액에서 overnight 실시하였다. Bcl-2의 발현량을 검토하기 위한 항체로는 mouse monoclonal anti-human Bcl-2 Ab (1 : 1000)(Santa Cruz Biotech, MA, USA), Bax의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human Bax Ab (1 : 1000)(Santa Cruz Biotech, MA, USA), PARP의 발현량을 검토하기 위한 항체로 rabbit polyclonal anti-human PARP Ab (1 : 1000)(Santa Cruz Biotech, MA, USA), caspase-3 발현량을 검토하기 위한 항체로 rabbit polyclonal anti-human caspase-3 Ab(1 : 1000)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)와 caspase-9의 Ab(1 : 1000)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)을 TTBS 용액에서 희석하여 사용하였으며, 반응은 상온에서 2시간 동안 진행하였다. 2차 항체로는 HPR(Horse Radish Peroxidase)이 결합된 anti-rabbit IgG(Amersham Prarmacia Biotech, NY, USA)와 anti-mouse IgG(Amersham Prarmacia Biotech, NY, USA)를 희석(1 : 5000)하여 이용하였으며, 반응은 상온에서 30분 동안 진행하였다.
- Cell cycle analysis −까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물에 의하여 HL-60 세포의 apoptosis가 유도되는지를 알아보기 위하여 세포주기를 조사하였다.
- DNA fragmentation 확인 −까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물에 의한 HL-60 세포 증식 억제 작용이 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위하여, apoptosis 유도에 의하여 나타나는 DNA 절편화현상을 전기영동으로 관찰하였다.
- DNA에 특이적으로 결합하는 형광색소인 Hoechst 33342(H33342: Sigma chemical Co., St. Louis, USA) 용액(1 μg/ml)을 가하여 37℃에서 10분간 염색한후 형광현미경(IX-71, Olympus, Japan) 하에서 관찰하였다.
- HL-60 세포에 까마귀쪽나무의 80%에탄올 추출물을 25, 50 및 100 μg/ml의 농도로 48시간 동안 처리한 다음, DNA helix에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI를 처리하여, 세포주기에서 apoptotic 세포, 즉 sub-G1 hypodiploid 세포의 증가를 유세포 분석기로 분석하였다.
- HL-60(2.5×105 cells/ml) 세포에 25, 50 및 100 μg/ml의 농도로 까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물을 처리한 다음 3, 6, 9, 12, 24 및 48시간 동안 배양하였다.
- HL-60(2.5×105 cells/ml) 세포에 까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물을 25, 50 및 100 μg/ml의 농도로 처리한 다음, 48시간 동안 배양한 후, 세포를 수확하여 PBS로 세척하였다.
- HL-60(2.5×105 cells/ml) 세포에 까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물을 100 μg/ml의 농도로 처리한 다음 3, 6 및 9시간 동안 배양한 후, 세포를 수확하여 PBS로 2~3회 세척하였다.
- HL-60(2.5×105 cells/ml)을 96 well plate에 넣고 까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물을 25, 50, 75 및 100 μg/ml의 농도로 처리하였다.
- HL-60(3.5×105 cells/ml) 세포에 까마귀쪽나무의 80% 에탄올추출물을 100 μg/ml의 농도로 처리한 다음, 3, 6 및 9시간 동안 배양하였다.
- Louis, USA) 150 μl를 가하여 침전물을 용해 시킨 후, microplate reader(Amersham Pharmacia Biotech, NY, USA) 를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포 증식 억제 정도를 조사하였다.
- 그 후 -20℃에서 70% ethanol로 30분 동안 고정시키고 PBS 세척 후 RNase A(1 mg/ml)를 처리한 다음에 propidium iodide(PI: Sigma chemical Co., St. Louis, USA)로 염색하고, COULTER® EPICS® XLTM Flow Cytometer(Coulter, Miami, FL, USA)로 세포주기를 분석하였다.
- 본 연구에서는 까마귀쪽나무의 추출물을 사용하여 HL-60 (human promyelocytic leukemia) 세포를 비롯한 여러 암세포를 대상으로 이 세포에 대한 세포증식억제 효과를 조사하였다. 까마귀쪽나무 추출물의 HL-60 세포에 대한 세포증식억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위하여, 핵의 형태학적변화, DNA 절편화 및 DNA content 변화를 알아보았으며, apoptosis 유도 신호전달 기전에 중요한 Bcl-2와 Bax의 증가와 이에따른 caspase-9, caspase-3 protease 활성화의 발현 양상을 조사하였다. 이와 같은 연구로 HL-60 세포에 대한 까마귀쪽나무 추출물의 항암효과를 밝혀 효과적인 항암물질 개발의 재료로 사용가능한 근거를 제시하고자 하였다.
- 세포를 수확한 후 Promega Wizard® Genomic DNA Purification Kit(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA를 1.2% agarose gel에서 40분(100 V) 동안 전기영동을 실행한 다음, ethidium bromide로 염색하고 UV transilluminator(Spectronics Corporation Westbury, NY, USA) 하에서 DNA fragmentation 현상을 관찰하였다.6)
- 세포를 수확한 후 Promega Wizard® Genomic DNA Purification Kit(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 DNA를 분리하였다.
- 여러 세포주에 까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물을 25, 50, 75 및 100 μg/ml의 농도로 처리하여 실험하였다(Fig. 1).
- 핵의 형태학적 변화 − Apoptosis의 형태학적 특징중의 하나인 핵의 변화를 관찰하기 위하여 DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염색액인 Hoechst 33342를 사용하여 DNA를 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다.
대상 데이터
- HL-60 (human promyelocytic leukemia), HL-60/ADR(adriamycin resistant human promyelocytic leukemia), HL- 60/MX2 (mitoxantrone resistant human promyelocytic leukemia), HCT-15 (human colon cancer), SK-OV-3(human ovary cancer), A549 (human lung cancer), HEL-299 (human embryonic lung). All experiments were performed in triplicate. Data were presented as a mean ±SD of three separate experiments.
- HL-60(human promyelocytic leukemia) 세포는 한국 세포주은행(Korea Cell Line Bank)로부터 분양 받아서 사용하였다. 100 units/ml의 penicillin-streptomycin(GIBCO Inc, Grand Island, NY, USA)과 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS; GIBCO Inc, Grand Island, NY, USA)이 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2, humidified incubator에서 배양하였으며, 계대배양은 약 70~80%의 confluence가 되는 3~4일마다 한번씩 시행하였다.
- 본 논문은 2단계 두뇌 한국 21(Brain Korea 21; BK 21)의 지원에 의해서 연구되었다.
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까마귀쪽나무 추출물 제조
제주도 해안가에 자생하고 있는 까마귀쪽나무(Litsea japonica)의 잎을 2005년 11월경에 채집하여 시료 185 g을 음지에서 건조시킨 다음, 마쇄기로 분쇄하여 각각의 미세말 시료를 80% 에탄올에 침적하고 초음파를 이용하여 1시간씩 3회 추출하였으며, 그후 상층액을 회수하고 감압 농축하여 얻은(43 g) 에탄올 추출물을 2007년 제주생물종 다양성 연구소로부터 분양 받았다. 본 실험에서 이 추출물을 PBS(phosphate-buffered saline)/에탄올(1 : 1)에 용해시킨 후 원하는 농도에 따라 실험용 배지로 희석하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험군 사이의 통계적 유의성 검증은 Student's t-test를 사용하여 평가하였다.
- 표시된 결과는 3번 이상의 독립적인 실험 결과이며, 데이터를 mean±standard error 값으로 나타내었다.
이론/모형
- HL-60 세포의 성장증식에 대한 까마귀쪽나무의 80% 에탄올추출물 효과를 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay를 이용하여 검색하였다.5) 살아있는 암세포 mitochondria의 탈수소 효소작용에 의하여 수용성의 노란색 MTT가 환원되어 형성되는 자주색을 띠는 비수용성의 formazan을 microplate(ELISA) reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여, 대사적으로 왕성하게 생존하는 세포의 수를 조사하였다.
- 까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물에 의한 HL-60 세포의 증식억제효과를 측정하기 위하여 MTT assay를 이용하였다. 여러 세포주에 까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물을 25, 50, 75 및 100 μg/ml의 농도로 처리하여 실험하였다(Fig.
성능/효과
- 이 식물의 화학적 구성에 대한 기존의 연구에서, 여러 종류의 essential oils, fatty acids, lactones, alkaloids 및 terpenoids가 발견되었다고 보고된 바가 있다.1,2) Lactones의 종류로 알려진 hamabiwalactone A, hamabiwalatone B, akolactone B, litsealactone A 및 litsealactone B가 분리되었다.3) 또한, 잎으로부터 분리된 flavonoids 성분인 epicatechin, afzelin, quercitrin 및 tiliroside의 anti-complement activity를 조사한 결과, tiliroside가 complement system에 대해 가장 강력한 억제작용을 나타냄이 보고되었다.
- HL-60 세포에 까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물을 100 μg/ml의 농도로 3, 6 및 9시간 동안 처리하여 DNA ladder를 확인한 결과, Fig. 2에서처럼 6시간 및 9시간 처리 시 DNA 절편화 현상을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).
- 그 결과, Fig. 6에서 보는 바와 같이, 까마귀쪽나무의 80% 에탄올추출물을 HL-60 세포에 3, 6 및 9 시간 동안 100 μg/ml의 농도로 처리하였을 때 Bcl-2의 발현은 6시간 이후부터 점차 시간 의존적으로 감소하였으나, Bax의 경우는 그 발현이 증가함을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
- 그 결과, 까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물을 25, 50 및 100 μg/ml의 농도로48시간 처리하였을 때, 까마귀쪽나무 추출물에 의해 sub-G1 hypodiploid 세포가 47, 61 및 84% 로, 농도 의존적으로 apoptosis 세포가 증가되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
- 까마귀쪽나무80% 에탄올 추출물을 100 μg/ml의 농도로 처리하였을 때 HL-60를 비롯한 5종의 암세포에서의 세포 증식억제 효과를 보면 HL-60(human promyelocytic leukemia)에서는 83%, HL-60/ADR (adriamycin resistant human promyelocytic leukemia cell line)에서 64.5%, HL-60/MX2(mitoxantrone resistant human promyelocytic leukemia cell line)에서 76%, HCT-15(human colon cancer)에서 7.9%, SK-OV-3(human ovary cancer)에서16.9%, A-549(human lung cancer)에서 3.4%의 효과를 보였다.
- 또한 까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물을 25, 50 및 100 μg/ml의 농도로 48시간 처리하였을 때도 농도 의존적으로 HL-60 세포의 부분적인 핵의 응집현상을 관찰할 수 있었다(Fig. 4B)
- 정상 대조군에 비하여 까마귀쪽나무의80% 에탄올 추출물을 100 μg/ml의 농도로 3, 6, 9, 12 및 24시간 처리하였을 때 시간 의존적으로 HL-60 세포의 크기가 축소되었으며, 핵의 모양이 불규칙하고 부분적인 핵의 응집현상을 관찰할 수 있었다(Fig. 4A).
- 정상 세포 HEL-299에 같은 방법으로 까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물을 처리하여 정상세포에 대한 세포 증식 억제 효과를 확인한 결과, 100 μg/ml의 농도에서 다른 세포주에 비하여 현저히 낮은 2.3%의 세포 증식억제 효과를 확인하였다.
후속연구
- 3) 또한, 잎으로부터 분리된 flavonoids 성분인 epicatechin, afzelin, quercitrin 및 tiliroside의 anti-complement activity를 조사한 결과, tiliroside가 complement system에 대해 가장 강력한 억제작용을 나타냄이 보고되었다.4) 한국에서 까마귀쪽나무는 식용으로 사용하였다는 보고가 있으나, 어떤 용도로 사용하였는지에 대한 연구 보고는 미미한 실정이므로 이 식물에 대한 항암효능을 비롯한 생리활성을 탐색하는 연구가 필요하다.
- 본 연구에서는 까마귀쪽나무의 추출물이 HL-60 백혈병 세포에서 Bcl-2의 발현 감소 및 caspase를 활성화함으로서 apoptosis를 유도하여 증식을 저해함을 밝혔다. 이와 같은 연구결과는 까마귀쪽나무 추출물이 항암제로 이용될 수 있는 근거를 시사하며, 항암 치료제 또는 예방제의 유효 성분 및 그 작용기전 연구에 중요한 기초자료가 될 것이라고 사료된다.
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