The present study investigated the antiproliferative effect of Litsea japonica in HL-60/ADR, adriamycin resistant human promyelocytic leukemia cells. The 80% ethanol extract of L. japonica markedly inhibited the growth of HL-60/ADR cells. When HL-60/ADR cells were treated with the extract, several a...
The present study investigated the antiproliferative effect of Litsea japonica in HL-60/ADR, adriamycin resistant human promyelocytic leukemia cells. The 80% ethanol extract of L. japonica markedly inhibited the growth of HL-60/ADR cells. When HL-60/ADR cells were treated with the extract, several apoptosis events like as DNA fragmentation, chromatin condensation and the increase of the population of sub-G1 hypodiploid cells were observed. In the mechanism of apoptosis induction by L. japonica, we examined the changes of Bcl-2 and Bax protein expression levels, and activation of caspases. After the HL-60/ADR cells were treated with the extract, the Bcl-2 expression was decreased, whereas the expression of Bax was increased in a time-dependent manner compared to the control. In addition, the active forms of caspase-9 and -3 were increased and the cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase, a vital substrate of effector caspase, was observed. The results suggest that the inhibitory effect of L. japonica on the growth of the HL-60/ADR appears to arise from the induction of apoptosis via the down-regulation of Bcl-2 and the activation of caspases.
The present study investigated the antiproliferative effect of Litsea japonica in HL-60/ADR, adriamycin resistant human promyelocytic leukemia cells. The 80% ethanol extract of L. japonica markedly inhibited the growth of HL-60/ADR cells. When HL-60/ADR cells were treated with the extract, several apoptosis events like as DNA fragmentation, chromatin condensation and the increase of the population of sub-G1 hypodiploid cells were observed. In the mechanism of apoptosis induction by L. japonica, we examined the changes of Bcl-2 and Bax protein expression levels, and activation of caspases. After the HL-60/ADR cells were treated with the extract, the Bcl-2 expression was decreased, whereas the expression of Bax was increased in a time-dependent manner compared to the control. In addition, the active forms of caspase-9 and -3 were increased and the cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase, a vital substrate of effector caspase, was observed. The results suggest that the inhibitory effect of L. japonica on the growth of the HL-60/ADR appears to arise from the induction of apoptosis via the down-regulation of Bcl-2 and the activation of caspases.
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문제 정의
HL-60/ADR 세포에서 까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물이 apoptosis를 유도하는지를 알아보기 위하여 세포주기를 조사하였다. HL-60/ADR 세포에 까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물을 25, 50 및 100 µg/ml의 농도로 48시간 처리한 후, apoptosis를 측정하기 위하여 DNA helix에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI 를 처리하여, 세포주기에서 apoptotic 세포인 sub-G1 hypodiploid 세포의 증가를 유세포 분석기로 분석하였다.
본 연구에서는 까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물을 사용하여 항암제인 adriamycin에 내성을 가지고 있는 HL-60/ ADR (adriamycin resistant human promyelocytic leukemia) 세포의 증식억제 효과를 조사하였다. 또한 까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물의 HL-60/ADR 세포에 대한 세포증식억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위하여, 핵의 형태학적 변화, DNA 절편화 및 DNA content 변화를 알아보았으며, apoptosis 유도 신호전달 기전에 중요한 Bcl-2와 Bax의 증가와 이에 따른 caspase-9, caspase-3 protease활성화를 조사하였다.
본 연구에서는 까마귀쪽나무의 추출물이 adriamycin에 내성을 가지고 있는 HL-60/ADR 세포에서 Bcl-2의 발현 감소 및 caspase를 활성화 함으로서 apoptosis를 유도하여 증식을 저해함을 밝혔다. 이와 같은 연구결과는 까마귀쪽나무 추출물이 항암제에 내성을 가지고 있는 내성암세포주에 대한 항암제로 이용될 수 있는 근거를 시사하며, 항암 치료제 또는 예방제의 유효 성분 및 그 작용기전 연구에 중요한 기초자료가 될 것이라고 사료된다.
또한 까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물의 HL-60/ADR 세포에 대한 세포증식억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위하여, 핵의 형태학적 변화, DNA 절편화 및 DNA content 변화를 알아보았으며, apoptosis 유도 신호전달 기전에 중요한 Bcl-2와 Bax의 증가와 이에 따른 caspase-9, caspase-3 protease활성화를 조사하였다. 이와 같은 연구로 HL-60/ADR 세포와 같이 항암제에 대해 내성을 가지고 있는 내성암세포주에 대한 까마귀쪽나무 추출물의 항암효과를 밝혀, 효과적인 항암물질 개발의 재료로 사용 가능한 근거를 제시하고자 하였다.
제안 방법
10) 살아있는 암세포 mitochondria의 탈수소 효소 작용에 의하여 수용성의 노란색 MTT가 환원되어 형성되는 자주색을 띠는 비수용성의 formazan을 microplate (ELISA) reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여, 대사적으로 왕성하게 생존하는 세포를 조사하였다. HL-60/ADR (2.
HL-60/ADR (adriamycin resistant human promyelocytic leukemia) 세포는 내성세포연구센터(Research Center for Resistant Cell)로부터 분양 받아서 사용하였다. 100 units/ml의 penicillin-streptomycin (GIBCO Inc, Grand Island, NY, USA)과 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS; GIBCO Inc, Grand Island, NY, USA)이 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37oC, 5% CO2, humidified incubator에서 배양하였으며, 계대배양은 약 70~80%의 confluence가 되는 3~4일마다 한번씩 시행하였다.
각각의 항체들은 모두 TTBS 용액에 희석하여 사용하였으며, 상온에서 2시간 동안 반응을 진행하였다. 2차 항체로는 HPR (Horse Radish Peroxidase)이 결합된 anti-rabbit IgG (American Prarmacia Biotech, NY, USA)와 anti-mouse IgG (American Pharmacia Biotech, NY, USA)를 TTBS 용액에 희석(1:5000)하여 사용하였으며, 상온에서 30분 동안 반응을 진행하였다. 그 후 TTBS로 membrane을 3회 세척한 후, ECL 기질 (American Pharmacia Biotech, NY, USA)과 1~3분간 반응 시킨 다음 X-ray 필름에 감광하였다.
Adriamycin에 내성을 갖는 HL-60/ADR의 성장 저해 효과가 탁월한 까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물의 작용이 HL-60/ADR의 apoptosis 유도에 의한 것인지를 조사하였다.
1% Tween 20) 용액에서 membrane의 blocking을 overnight 실시하였다. Bcl-2의 발현량을 검토하기 위하여 mouse monoclonal antihuman Bcl-2 Ab (1:1000) (Santa Cruz Biotech, MA, USA) 항체를, Bax의 발현량을 검토하기 위하여 rabbit polyclonal anti-human Bax Ab (1:1000) (Santa Cruz Biotech, MA, USA) 항체를, PARP의 발현량을 검토하기 위하여 rabbit polyclonal anti-human PARP Ab (1:1000) (Santa Cruz Biotech, MA, USA) 항체를 사용하였다. 또한 caspase-3의 발현량을 검토하기 위하여 rabbit polyclonal antihuman caspase-3 Ab (1:1000) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) 항체를, caspase-9의 발현량을 검토하기 위하여 rabbit polyclonal anti-human caspase-9 Ab (1:1000) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) 항체를 사용하였다.
DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염색액인 Hoechst 33342를 사용하여 apoptosis의 형태학적 특징 중의 하나인 핵의 변화를 관찰하였다. Hoechst 33342로 DNA를 염색하고 형광현미경으로 관찰한 결과, 까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물을 25, 50 및 100 µg/ml의 농도로 48시간 동안 처리하였을 때, 정상 대조군에 비하여 농도 의존적으로 HL-60/ADR 세포의 크기가 축소되었으며, 핵의 모양이 불규칙하고 부분적인 핵의 응집현상을 관찰할 수 있었다 (Fig.
HL-60/ADR 세포에 까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물을 25, 50 및 100 µg/ml의 농도로 48시간 처리한 후, apoptosis를 측정하기 위하여 DNA helix에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI 를 처리하여, 세포주기에서 apoptotic 세포인 sub-G1 hypodiploid 세포의 증가를 유세포 분석기로 분석하였다.
항암제인 adriamycin에 내성을 가지고 있는 암세포인 HL60/ADR 세포의 증식에 대한 여러 식물 추출물의 효과를 측정하기 위하여 MTT assay를 이용하였다. HL-60/ADR 세포주에 까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물 외 3종의 추출물을 처리하여 세포증식저해 효과를 조사 하였다 (Fig. 1). 각각의 추출물을 100 ㎍/㎖ 의 농도로 처리하였을 때, HL-60/ ADR의 세포증식저해 효과는 까마귀쪽나무 (L.
Louis, USA) 150 µl를 가하여 침전물을 용해시킨 다음, microplate reader (Amersham Pharmacia Biotech, NY, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균흡광도 값을 구하여, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포증식 억제 정도를 조사하였다.
그 후 70% 에탄올로 -20℃에서 30분 동안 고정시키고, PBS로 세척한 다음 RNase A (1 mg/ml)를 처리한 후 propidium iodide(PI: Sigma chemical Co., St. Louis, USA)로 염색하고, COULTER® EPICS® XLTM Flow Cytometer(Coulter, Miami, FL, USA)를 사용하여 세포주기를 분석하였다.
그 후 DNA에 특이적으로 결합하는 형광색소인 Hoechst 33342 (H33342: Sigma chemical Co., St. Louis, USA) 용액 (1 µg/ml)을 가하여 37℃에서 10분간 염색한 후 형광현미경(IX-71, Olympus, Japan) 하에서 관찰하였다.
까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물에 의한 HL-60/ADR의 apoptosis 유도의 분자적 기전을 밝히기 위하여 Bcl-2와 Bax 의 발현을 조사하였다. Apoptosis를 조절하는 유전자 산물중 제일 먼저 알려진 암유발 유전자 산물의 하나인 antiapoptosis protein Bcl-2는 분자량 26 KDa의 단백질로서 세포증식에는 관여하지 않고 chemoresistance에 중요한 역할을 담당하여 여러 종류의 자극에 대해 apoptosis를 억제하는 특이적 기능을 가지고 있다고 알려져 있다.
까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물을 HL-60/ADR (2.5×105 cells/ml) 세포에 농도별 (25, 50 및 100 µg/ml)로 처리한 다음, 48시간 동안 배양하였다.
까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물을 HL-60/ADR (2.5×105 cells/ml) 세포에 농도별 (25, 50 및 100 µg/ml)로 처리한 다음, 48시간 동안 배양한 후, 세포를 수확하여 PBS로 세척하였다.
Bcl-2의 발현량을 검토하기 위하여 mouse monoclonal antihuman Bcl-2 Ab (1:1000) (Santa Cruz Biotech, MA, USA) 항체를, Bax의 발현량을 검토하기 위하여 rabbit polyclonal anti-human Bax Ab (1:1000) (Santa Cruz Biotech, MA, USA) 항체를, PARP의 발현량을 검토하기 위하여 rabbit polyclonal anti-human PARP Ab (1:1000) (Santa Cruz Biotech, MA, USA) 항체를 사용하였다. 또한 caspase-3의 발현량을 검토하기 위하여 rabbit polyclonal antihuman caspase-3 Ab (1:1000) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) 항체를, caspase-9의 발현량을 검토하기 위하여 rabbit polyclonal anti-human caspase-9 Ab (1:1000) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) 항체를 사용하였다. 각각의 항체들은 모두 TTBS 용액에 희석하여 사용하였으며, 상온에서 2시간 동안 반응을 진행하였다.
본 연구에서는 까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물을 사용하여 항암제인 adriamycin에 내성을 가지고 있는 HL-60/ ADR (adriamycin resistant human promyelocytic leukemia) 세포의 증식억제 효과를 조사하였다. 또한 까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물의 HL-60/ADR 세포에 대한 세포증식억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위하여, 핵의 형태학적 변화, DNA 절편화 및 DNA content 변화를 알아보았으며, apoptosis 유도 신호전달 기전에 중요한 Bcl-2와 Bax의 증가와 이에 따른 caspase-9, caspase-3 protease활성화를 조사하였다. 이와 같은 연구로 HL-60/ADR 세포와 같이 항암제에 대해 내성을 가지고 있는 내성암세포주에 대한 까마귀쪽나무 추출물의 항암효과를 밝혀, 효과적인 항암물질 개발의 재료로 사용 가능한 근거를 제시하고자 하였다.
대상 데이터
HL-60/ADR (adriamycin resistant human promyelocytic leukemia) 세포는 내성세포연구센터(Research Center for Resistant Cell)로부터 분양 받아서 사용하였다. 100 units/ml의 penicillin-streptomycin (GIBCO Inc, Grand Island, NY, USA)과 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS; GIBCO Inc, Grand Island, NY, USA)이 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37oC, 5% CO2, humidified incubator에서 배양하였으며, 계대배양은 약 70~80%의 confluence가 되는 3~4일마다 한번씩 시행하였다.
그리고 환삼덩굴 (Humulus japonicas Siebold & Zucc.) 80% 메탄올 추출물, 호랑가시나무 (Ilex cornuta Lundi. & Paxton) 80% 메탄올 추출물 및 유칼립투스 (Eucalyptus globulus Labill.) 100% 메탄올 추출물 또한 제주생물종 다양성 연구소로부터 분양 받아 사용하였으며, 분양 받은 각각의 추출물들을 PBS (phosphate-buffered saline)/메탄올 (1:1)에 용해시킨 후 원하는 농도에 따라 실험용 배지로 희석하여 사용하였다.
본 논문은 2단계 두뇌 한국 21(Brain Korea 21; BK21)의 지원에 의해서 연구되었다.
까마귀쪽나무, 환삼덩굴, 호랑가시나무 및 유칼립투스의 추출물 제조 −
제주도의 해안가에 자생하는 까마귀쪽나무(L. japonica)의 잎을 2005년 11월경에 채집하여 시료 185g을 음지에서 건조시킨 후, 마쇄기로 분쇄하여 각각의 미세말 시료를 80% 에탄올에 침적하고 초음파를 이용하여 1시간씩 3회 추출하였으며, 그 후 상층액을 회수하여 감압 농축하여 얻은 (43 g) 에탄올 추출물을 2007년 제주생물종 다양성 연구소로부터 분양 받았다. 본 실험에서는 이 추출물을 PBS (phosphate-buffered saline)/에탄올 (1:1)에 용해시킨 후 원하는 농도에 따라 실험용 배지로 희석하여 사용하였다.
데이터처리
Student’s t-test를 사용하여 실험군 사이의 통계적 유의성 검증을 평가하였다.
표시된 결과들은 3번 이상의 독립적인 실험 결과들이며, 각각의 데이터를 mean±standard error 값으로 나타내었다.
이론/모형
여러 식물 추출물에 의한 HL-60/ADR 세포의 성장증식에 대한 효과를 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay를 이용하여 검색하였다.10) 살아있는 암세포 mitochondria의 탈수소 효소 작용에 의하여 수용성의 노란색 MTT가 환원되어 형성되는 자주색을 띠는 비수용성의 formazan을 microplate (ELISA) reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여, 대사적으로 왕성하게 생존하는 세포를 조사하였다.
항암제인 adriamycin에 내성을 가지고 있는 암세포인 HL60/ADR 세포의 증식에 대한 여러 식물 추출물의 효과를 측정하기 위하여 MTT assay를 이용하였다. HL-60/ADR 세포주에 까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물 외 3종의 추출물을 처리하여 세포증식저해 효과를 조사 하였다 (Fig.
성능/효과
14) Fig. 4에서 보는 바와 같이, HL-60/ADR 세포에 까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물을 3, 6, 9 및 12 시간 동안 100 µg/ml 의 농도로 처리하였을 때 Bcl-2의 발현은 9시간 이후부터 시간 의존적으로 감소한 반면 Bax의 경우는 그 발현이 큰 차이가 없었다 (Fig. 4).
Hoechst 33342로 DNA를 염색하고 형광현미경으로 관찰한 결과, 까마귀쪽나무의 80% 에탄올 추출물을 25, 50 및 100 µg/ml의 농도로 48시간 동안 처리하였을 때, 정상 대조군에 비하여 농도 의존적으로 HL-60/ADR 세포의 크기가 축소되었으며, 핵의 모양이 불규칙하고 부분적인 핵의 응집현상을 관찰할 수 있었다 (Fig. 3).
1). 각각의 추출물을 100 ㎍/㎖ 의 농도로 처리하였을 때, HL-60/ ADR의 세포증식저해 효과는 까마귀쪽나무 (L. japonica) 80% 에탄올 추출물의 경우는 64.5%, 환삼덩굴 (H. japonicus) 80% 메탄올 추출물의 경우는 17.3%, 호랑가시나무 (I. cornuta) 80% 메탄올 추출물의 경우는 37.7%, 유칼립투스 (E. globulus) 100% 메탄올 추출물의 경우는 6.6%의 저해효과를 보였다. 이 중 저해효과가 가장 높은 까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물은 정상세포인 HEL-299에서 현저히 낮은 세포 증식억제 효과를 나타냄을 이미 보고하였다.
그 결과, 까마귀 쪽나무 80% 에탄올 추출물을 25, 50 및 100 µg/ml의 농도로 48시간 처리하였을 때, 까마귀쪽나무 추출물에 의해 sub-G1 hypodiploid 세포가 19, 22 및 31%로, 농도 의존적으로 apoptosis 세포가 증가되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2).
5에서처럼 9시간 이후부터 활성이 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한 caspase-3의 활성도와 비례하여, caspase-3 기질의 하나인 PARP (116 KDa)는 시간 의존적으로 PARP 분해 단백질 (85 KDa)로 나타나는 것을 확인하였다 (Fig. 5).
본 실험에서 까마귀쪽나무 80% 에탄올 추출물을 100 µg/ml의 농도로 3, 6, 9 및 12시간 동안 처리하여 caspase의 활성형인 cleaved caspase의 단백질 수준을 조사한 결과, Fig. 5에서처럼 9시간 이후부터 활성이 증가됨을 확인할 수 있었다.
후속연구
8) 또한, 잎으로부터 분리된 flavonoids 성분인 epicatechin, afzelin, quercitrin 및 tiliroside의 anti-complement activity를 조사한 결과, tiliroside가 complement system에 대해 가장 강력한 억제작용을 나타냄이 보고되었다.9) 한국에서 까마귀쪽나무는 식용으로 사용하였다는 보고가 있으나, 어떤 용도로 사용하였는지에 대한 연구 보고는 미미한 실정이므로 이 식물에 대한 항암효능을 비롯한 생리활성을 탐색하는 연구가 필요하다.
본 연구에서는 까마귀쪽나무의 추출물이 adriamycin에 내성을 가지고 있는 HL-60/ADR 세포에서 Bcl-2의 발현 감소 및 caspase를 활성화 함으로서 apoptosis를 유도하여 증식을 저해함을 밝혔다. 이와 같은 연구결과는 까마귀쪽나무 추출물이 항암제에 내성을 가지고 있는 내성암세포주에 대한 항암제로 이용될 수 있는 근거를 시사하며, 항암 치료제 또는 예방제의 유효 성분 및 그 작용기전 연구에 중요한 기초자료가 될 것이라고 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
까마귀쪽나무의 화학적 구성에 대한 기존의 연구에서 무엇이 발견되었다고 보고된 바 있는가?
) Jussieu)는 상록엽소교목으로서 수직적으로 표고 700 m 이내의 바닷가 및 산기슭에 분포한다. 이 식물의 화학적 구성에 대한 기존의 연구에서, 여러 종류의 essential oils, fatty acids, lactones, alkaloids 및 terpenoids가 발견되었다고 보고된 바가 있다.6,7) Lactones의 종류로 알려진 hamabiwalactone A, hamabiwalatone B, akolactone B, litsealactone A 및 litsealactone B가 분리되었다.
까마귀쪽나무는 어디에 분포하는가?
까마귀쪽나무(Litsea japonica (Thunb.) Jussieu)는 상록엽소교목으로서 수직적으로 표고 700 m 이내의 바닷가 및 산기슭에 분포한다. 이 식물의 화학적 구성에 대한 기존의 연구에서, 여러 종류의 essential oils, fatty acids, lactones, alkaloids 및 terpenoids가 발견되었다고 보고된 바가 있다.
tiliroside가 무엇에 대해 강력한 억제작용을 나타내는 것이 보고되었는가?
6,7) Lactones의 종류로 알려진 hamabiwalactone A, hamabiwalatone B, akolactone B, litsealactone A 및 litsealactone B가 분리되었다.8) 또한, 잎으로부터 분리된 flavonoids 성분인 epicatechin, afzelin, quercitrin 및 tiliroside의 anti-complement activity를 조사한 결과, tiliroside가 complement system에 대해 가장 강력한 억제작용을 나타냄이 보고되었다.9) 한국에서 까마귀쪽나무는 식용으로 사용하였다는 보고가 있으나, 어떤 용도로 사용하였는지에 대한 연구 보고는 미미한 실정이므로 이 식물에 대한 항암효능을 비롯한 생리활성을 탐색하는 연구가 필요하다.
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