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문제 정의
- 14) 이에 저자는 전술한 T림프구의 조절인자들이 타액에서 발현된다면, 타액을 이용한 진단학적 방법이 가능하리라 생각하였다. OLP, RAS 환자들의 비자극성 전타액 (Unstimulated whole salva, UWS)내 T림프구 조절인자들의 mRNA 발현양상을 살펴보고, 정상인의 발현양상과 비교분석하여, 이것의 진단학적 가치가 있는지를 살펴보고자 한다.
제안 방법
- RNA는 Trizol reagent (Gibco BRL)을 이용하여 추출하였으며, DNase I (Gibco BRL)을 처리하여 DNA 오염 가능성을 배제하였다. 추출한 3 μg의 RNA를 1 μg의 oligo(dT)와 혼합시켜 70℃에서 5분간 반응시킨 후 역전사 반응액 (Promega, Madison, WI : 1×reverse transcription buffer, 5mM dNTP mixture, 5mM MgCl2, 10 units rRNasin, 10 units avian myeloblastosis virus reverse transcriptase)을 혼합하여 42℃에서 30분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
- SPSS 17.0을 이용하였고, EOLP, RAS, 정상인에서 나타나는 CD28, CD45, CD152, CD154, CD279등의 상대적인 mRNA의 발현양상을 비교하기 위하여 Kruskal wallis test를 이용하였으며, p<0.05 수준에서 유의성을 결정하였다.
- 세포덩이를 Hanks 평형염액 (Life technologies, MI)에 재현탁시킨 후 40 μm 두께의 멸균된 나일론 막 (BD Biosciences, Bedford, MA)에 통과시켜 상피세포를 분리해냈다.
- 추출한 3 μg의 RNA를 1 μg의 oligo(dT)와 혼합시켜 70℃에서 5분간 반응시킨 후 역전사 반응액 (Promega, Madison, WI : 1×reverse transcription buffer, 5mM dNTP mixture, 5mM MgCl2, 10 units rRNasin, 10 units avian myeloblastosis virus reverse transcriptase)을 혼합하여 42℃에서 30분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 실시간 RT-PCR은 합성한 cDNA, 각각의 primers와 SYBR Green PCR Master Mix Reagent Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 혼합하여 실시간 역전사중합효소연쇄반응을 시행하였다 (Table 2). mRNA의 상대적인 수준은 Corbett Research에서 제공한 소프트웨어 (Corbett Research)를 사용하여 분석하였고, 결과는 정상군 수치의 배수로 표현하였다.
- 추출한 3 μg의 RNA를 1 μg의 oligo(dT)와 혼합시켜 70℃에서 5분간 반응시킨 후 역전사 반응액 (Promega, Madison, WI : 1×reverse transcription buffer, 5mM dNTP mixture, 5mM MgCl2, 10 units rRNasin, 10 units avian myeloblastosis virus reverse transcriptase)을 혼합하여 42℃에서 30분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
- 타액 채득은 채득 1시간 전부터 음식이나 물의 섭취를 제한한 후 원심분리가 가능한 용기에 뱉는 방법으로 10분간 실시하였고, -80℃에서 냉동 저장 후 24시간 이내에 상피세포를 분리하였다. 타액을 Zap-o-Globin 용해제 (Beckman Coulter, USA)가 2방울 첨가된 등장액 (Hematronix, Inc, CA, USA)으로 10배 희석한 후, 2000 rpm에서 10분간 원심 분리하였다.
대상 데이터
- 구강질환 및 전신질환이 없고 그리고 약물을 복용하지 않는 건강한 중년 여성 8명을 대조군으로 하였다 (Table 1).
- 전남대학교 치과병원 구강내과에 내원한 환자들 중 EOLP 또는 RAS로 진단받은 환자들 중 임상실험에 대해 충분한 설명 후 자발적으로 동의한 환자들을 대상으로 하였고, 그 중 활동성 구강질환, 특이적 전신질환, 그리고 약물처방 등을 받는 환자들은 배제하여 EOLP군 18명과 RAS군 12명을 실험군으로 하였다.
이론/모형
- 실시간 RT-PCR은 합성한 cDNA, 각각의 primers와 SYBR Green PCR Master Mix Reagent Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 혼합하여 실시간 역전사중합효소연쇄반응을 시행하였다 (Table 2). mRNA의 상대적인 수준은 Corbett Research에서 제공한 소프트웨어 (Corbett Research)를 사용하여 분석하였고, 결과는 정상군 수치의 배수로 표현하였다.
성능/효과
- 1) 임상적 소견에 따라 비미란형 (Non-erosive OLP, NEOLP)과 미란형 (Erosive OLP, EOLP)으로 구분하고 있다.2) Wickham 선조로 알려진 백색의 융기된 레이스 모양의 조직이 주로 관찰되는 NEOLP는 증상이 거의 없으나, 홍반 및 백색 위막부위가 혼재되어 나타나는 EOLP는 뜨겁거나 매운 음식 등에 대해 민감한 통증을 호소한다.1-4) EOLP는 위막성 캔디다증, 점막성 유천포창, 심상성 천포창, 홍반성 루프스 등과 감별하기가 어렵고, 편평세포암종으로의 전이 가능성 때문에 조직검사가 필요하다.
- EOLP 환자군의 비자극성 전타액에서 나타난 CD28, CD45, CD152, CD154, CD279들의 mRNA 발현양상은 정상군과 비교 결과, CD45, CD154, CD279에서 유의한 차이를 보였고, RAS군과의 비교 결과 CD152에서 유의한 차이를 보였다. 뿐만 아니라 RAS군의 비자극성 전타액에서 나타난 CD28, CD45, CD152, CD154, CD279들의 mRNA의 발현 양상은 정상군과 비교 결과 CD28, CD45, CD154, CD279에서 유의한 차이를 보였다.
- RAS군과 정상군의 비교 결과 CD45, CD279는 높게 발현되었고, CD28, CD154는 낮게 발현되었다. EOLP군과 RAS군의 비교 결과, CD152만 EOLP군에서 높게 측정되었다 (Table 3, 4).
- EOLP군과 정상군의 비교 결과, CD45, CD279는 높게 측정되었고, CD154는 낮게 측정되었다. RAS군과 정상군의 비교 결과 CD45, CD279는 높게 발현되었고, CD28, CD154는 낮게 발현되었다.
- EOLP군과 정상군의 비교 결과, CD45, CD279는 높게 측정되었고, CD154는 낮게 측정되었다. RAS군과 정상군의 비교 결과 CD45, CD279는 높게 발현되었고, CD28, CD154는 낮게 발현되었다. EOLP군과 RAS군의 비교 결과, CD152만 EOLP군에서 높게 측정되었다 (Table 3, 4).
- 11,20) Zhao 등21)에 의하면 APC에 의한 MHC class II 항원 복합체가 CD28과 CD152, CD54 등에 의해 T림프구를 조절한다고 하였는데, 이는 Sugerman 등5)과 Lodi 등6)에 의한 가설과 일맥상통한다. 본 연구에서는 EOLP군에서 통계적으로 유의하진 않으나 CD28이 다소 높게 관찰되는 경향이 보이는데, 이는 T림프구를 활성화시키는 것으로 여겨지고, 더불어 CD152의 발현 양상이 정상인과 유사한 양상을 보이는 것은 CD28에 의한 활성화된 T림프구에 대한 CD152의 억제가 불충분하여 질환의 심도에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- Rodríguez-Núñez 등17)에 의하면, EOLP의 혈액에서 CD4+CD45RO+ T림프구가 높게 발현되고, CD4+CD45RA+ 및 CD8+CD45RA+ T림프구가 낮게 발현된다고 하였다. 본 연구에서는 혈액이 아닌 타액 내 CD45의 mRNA의 발현 양상을 보았는데, EOLP군의 CD45은 정상인에 비하여 20배 이상 발현되었고, 다른 조절인자들에 비하여 10배 이상 풍부하게 발현되었다. RAS군에서도 정상인에 비하여 10배 이상 발현되었다.
- 18) Neppelberg 등19)의 연구에 의하면 자멸사를 촉진하는 CD40/CD154는 OLP에서 하향조절 (down-regulation)된다고 보고하였다. 본 연구에서도 CD154는 EOLP군과 RAS군 모두 낮게 발현되었는데, 이는 시간에 따른 점진적인 감소로 해석할 수 있고, CD154의 낮은 발현은 질병의 진행을 억제하는 역할을 한다고 생각할 수 있다.
- Youngnak-Piboonratanakit 등23)의 연구에 의하면 CD279는 CD274와 함께 각화세포에 영향을 미쳐 구강편평태선의 자가면역기전을 활성화시킨다고 보고하고 있다. 본 연구에서도 EOLP 및 RAS군 모두 CD279의 높은 활성도가 측정되었으며, 이는 면역기전을 활성화시켜 질병을 심화시키는 역할을 수행하였을 것으로 사료된다.
- EOLP 환자군의 비자극성 전타액에서 나타난 CD28, CD45, CD152, CD154, CD279들의 mRNA 발현양상은 정상군과 비교 결과, CD45, CD154, CD279에서 유의한 차이를 보였고, RAS군과의 비교 결과 CD152에서 유의한 차이를 보였다. 뿐만 아니라 RAS군의 비자극성 전타액에서 나타난 CD28, CD45, CD152, CD154, CD279들의 mRNA의 발현 양상은 정상군과 비교 결과 CD28, CD45, CD154, CD279에서 유의한 차이를 보였다. 이상의 결과를 통해, 타액을 이용한 진단법이 유용할 수 있고, EOLP 및 RAS 환자들의 비자극성 전타액내 T림프구 조절인자들의 발현 양상은 각 질환의 진단에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
- 이상에서 살펴본 바와 같이 OLP와 RAS는 T림프구에 의해 매개되는 면역질환이므로, T림프구의 분화, 활성화, 억제, 조절 등은 각 질환의 병태생리에 매우 중요하다. T림프구의 표면에 수용기성 물질로 부착하여 T림프구를 조절하는 인자들에는 CD28, CD45, CD152, CD154, CD279 등이 있다.
후속연구
- 14) 본 연구에서는 T림프구의 조절인자들을 살펴보았는데, 전술한 바와 같이 조직 및 혈액학적 연구와 비슷한 결과를 도출하고 있어, 본 연구의 타당성 및 타액을 이용한 진단학적 방법의 유용성은 높으리라 사료된다. 향후 조직병변의 면역조직 화학검사 결과와 타액을 이용한 본 연구결과를 비교분석하여 타액을 이용한 점막질환의 진단학적 유용성을 확립할 수 있을 것으로 생각된다.
- 13) 최근에는 타액 내 특이성분을 찾아내 질병의 진단에 이용하는 연구가 활발하게 이루어지고 있는데, 타액을 이용한 진단학적 방법은 기존의 조직검사에 비하여 비침습적이고, 통증이 수반되지 않으며, 쉽고, 간편한 이점이 있다.14) 이에 저자는 전술한 T림프구의 조절인자들이 타액에서 발현된다면, 타액을 이용한 진단학적 방법이 가능하리라 생각하였다. OLP, RAS 환자들의 비자극성 전타액 (Unstimulated whole salva, UWS)내 T림프구 조절인자들의 mRNA 발현양상을 살펴보고, 정상인의 발현양상과 비교분석하여, 이것의 진단학적 가치가 있는지를 살펴보고자 한다.
- RAS군에서도 정상인에 비하여 10배 이상 발현되었다. 이는 T림프구의 활성 혹은 억제, 분화, 조절에 다양한 기능을 하였을 것으로 사료되나, 선행 연구에서는 다양한 이성체를 분별하고, 각각의 역할에 대해 다양한 해석을 이야기하고 있어, 본 연구의 결과도 다양한 이성체에 대한 다각적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 뿐만 아니라 RAS군의 비자극성 전타액에서 나타난 CD28, CD45, CD152, CD154, CD279들의 mRNA의 발현 양상은 정상군과 비교 결과 CD28, CD45, CD154, CD279에서 유의한 차이를 보였다. 이상의 결과를 통해, 타액을 이용한 진단법이 유용할 수 있고, EOLP 및 RAS 환자들의 비자극성 전타액내 T림프구 조절인자들의 발현 양상은 각 질환의 진단에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
- 14) 본 연구에서는 T림프구의 조절인자들을 살펴보았는데, 전술한 바와 같이 조직 및 혈액학적 연구와 비슷한 결과를 도출하고 있어, 본 연구의 타당성 및 타액을 이용한 진단학적 방법의 유용성은 높으리라 사료된다. 향후 조직병변의 면역조직 화학검사 결과와 타액을 이용한 본 연구결과를 비교분석하여 타액을 이용한 점막질환의 진단학적 유용성을 확립할 수 있을 것으로 생각된다.
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