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문제 정의
- 반면에, 참당귀의 지질대사 관련 효능에 대한 보고는 미흡한 편이다. 따라서 본 연구에서는 참당귀로부터 주요 pyranocoumarin 성분을 분리하고 고지혈증이나 동맥경화증 등 심혈관질환 치료제 개발의 주요한 표적인 ACAT 저해활성을 평가하여 새로운 건강기능성 소재로서 참당귀의 개발 가능성을 검토하고자 하였다.
- 한편, 참당귀는 뿌리를 약재로 사용하고 있고 주로 decursin, decrusinol angelate 성분연구도 주로 뿌리에서만 보고되어 있어, 다른 부위의 성분에 대한 연구보고는 미흡한 실정이다. 따라서 참당귀 부위별 주요 pyranocoumarin계 성분의 함량을 정량분석 함으로써 이용하지 않고 버려지는 참당귀 부산물의 이용도 증진을 위한 기초자료로 활용하고자 하였다. 먼저, 참당귀 꽃을 시료로 하여 분리한 decrusinol angelate(1), decursin(2)을 표준품으로 사용하고 HPLC-UV법으로 정성분석을 하였을 때(Fig.
제안 방법
- 10 µL의 콜레스테롤 수용액에 10 µL의 0.5 M KH2PO4 buffer(0.5 M KH2PO4, 10 mM dithiothreitol pH 7.4), 5 µL의 0.6 mM bovine serum albumin(BSA, essentially fattyl acid free), hACAT1과 hACAT2가 각각 과량 발현된 Hi5 세포들로부터 분리한 microsomal fraction 10 µL, 활성검정용 시료액 10 µL 및 45 µL의 증류수를 가하여 총 90 µL인 혼합물을 제조하였다.
- CH2Cl2 농축액 30 g을 대상으로 silica gel이 충진된 column (5×40 cm)에서 open column chromatography를 실시하였다.
- MS spectrometer의 Electrospray ionization(ESI)은 positive ion mode로 하여 collision gas를 질소로 사용하였고, spray voltage 와 source 온도는 각각 3,000 V, 750°C로 하였다.
- 2), HPLC 역상 컬럼에서 두 성분을 분리하여 검출할 수 있을 것으로 추정되었다. 그러나 보다 정확하게 참당귀 각 부위 추출물에서 두 성분을 확인하고 정량하기 위하여 LC/MS/MS 분석을 실시하였다. 참당귀의 꽃, 종자, 잎, 뿌리는 80% MeOH 로 추출한 후 decrusinol angelate(1), decursin(2)의 함량을 LC/ MS/MS의 positive ion mode, MRM mode를 사용하여 측정하였다.
- 5, 6 eV, entrance potential (EP)는 decursin, decursinol angelate 각각 39, 91 eV로 하였다. 성분의 정량분석은 multiple reaction monitoring(MRM) mode 로 unit resolution에서 실시하였다. MRM 분석을 위한 deurcinol angelate와 decursin에 해당하는 ion pair(protonated molecular ion/product ion)은 각각 m/z 329.
- 시약 및 기기. 식물시료로부터 유효성분의 분리와 정제를 위해 silica gel column chromatography(silica gel 60, Merck, 70~230 mesh)를 실시하였다. TLC 분석에는 Silica gel 60 F254(precoated, Merck)를 사용하고 이때 detection reagent로는 10% H2SO4 용액을 사용하였다.
- 이 혼합물의 방사선량을 1450 Microbeta liquid scintillation counter(Wallac Oy, Finland)로 측정하였다. 양성 대조군으로는 oleic acid anilide를 사용하였으며, 다음과 같은 방법으로 저해율을 계산하였다.
- 용출용매로 Hexane:EtOAc(30:1→1:10) 혼합용매를 사용하여 기울기 용리로 500 mL씩 용출한 분획으로부터 최종 compound 1(857 mg), 2(1250 mg)를 각각 분리정제하였다.
- , Ballston Spa, NY) 4 mL를 첨가하였다. 이 혼합물의 방사선량을 1450 Microbeta liquid scintillation counter(Wallac Oy, Finland)로 측정하였다. 양성 대조군으로는 oleic acid anilide를 사용하였으며, 다음과 같은 방법으로 저해율을 계산하였다.
- 즉, 아세톤에 1 mg/mL의 농도로 용해된 콜레스테롤 용액 6.67 µL를 아세톤 중의 10% triton WR-1339 6 µL와 혼합하고, 질소가스를 이용하여 아세톤을 증발시켜 제거하였다.
- 참당귀 부위별 시료의 성분 정량은 LC/MS/MS로 실시하였는데, LC 컬럼은 Zorbax eclipse XDB-C18(4.6×150 mm, 5 µm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 사용하고, LC 이동상 조건은 water(A), 90% ACN(0.1% formic acid, 2 mM acetic acid)(B)를 혼합하여 기울기 용리로 용출하였는데(0-30분: 50% B→70% B, 30-31분: 100% B, 31-37분: 50% B), 이때 이동상의 유속및 컬럼의 온도는 각각 0.8 mL/min, 20°C로 하였다.
- 참당귀 뿌리로부터 2종의 pyranocoumarin 성분을 분리하고 그들의 구조는 NMR 분석에 의해 각각 decursinol angelate(1), decursin(2)로 결정하였다. 이들 화합물에 대하여 hACAT 저해 활성을 검정해본 결과, decursinol angelate(1)가 약한 저해활성을 나타낸 반면 decursin(2)은 hACAT1와 hACAT2에 대하여 IC50 값이 각각 137, 168 µM로서 우수한 저해활성을 나타내었다.
- 참당귀 뿌리에서 분리한 decursinol angelate(1), decursin(2) 화합물에 대하여 지질대사 관련 기능성을 검토하기 위해 hACAT 저해활성을 평가하였다. 시료의 농도를 100 µg/mL로 하여 hACAT1, hACAT2에 대한 저해도를 측정한 결과, decursinol angelate(1)는 각각 39, 54%의 비교적 낮은 저해도를 나타내는 반면, decursin(2)은 각각 68, 75%의 우수한 저해도를 나타내었다.
- 참당귀 뿌리의 MeOH 추출액을 용매분배하여 얻은 CH2Cl2 분획으로부터 분리정제한 compound 1, 2는 구조확인을 위해 1H, 13C-NMR를 측정하였다. Compound 1, 2의 NMR spectra data를 면밀히 분석하고, 기보고된 여러 연구논문[Ryu 등, 1990; Lee 등, 2003b; Park 등, 2007b]의 NMR data와 비교한 결과, 각각 참당귀의 주요 pyranocoumarin 성분인 decursinol angelate(1), decursin(2)인 것으로 동정되었다(Fig.
- 그러나 보다 정확하게 참당귀 각 부위 추출물에서 두 성분을 확인하고 정량하기 위하여 LC/MS/MS 분석을 실시하였다. 참당귀의 꽃, 종자, 잎, 뿌리는 80% MeOH 로 추출한 후 decrusinol angelate(1), decursin(2)의 함량을 LC/ MS/MS의 positive ion mode, MRM mode를 사용하여 측정하였다. 그 결과, LC/MS/MS의 MRM mode에서 참당귀의 꽃을 비롯한 모든 부위에서 decrusinol angelate(1), decursin(2) 성분이 모두 존재하고 있음은 두 성분의 protonated molecular ion/ product ion 이온쌍으로 확인할 수 있었다.
- 한편, 참당귀 꽃 추출물의 HPLC-UV 분석에서 컬럼은 Zorbax SB-C18(4.6 250 mm, 5 µm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 사용하였고, LC 이동상 조건은 acetonitrile (A), water(B)를 혼합하여 기울기 용리로 용출하였으며(0-20분:60% A→100% A, 20-29분: 100% A, 29-35분: 60% A), UV 검출기 파장, 이동상의 유속 및 컬럼의 온도는 각각 280 nm, 0.8 mL/min, 35°C로 하였다.
- 이들 화합물에 대하여 hACAT 저해 활성을 검정해본 결과, decursinol angelate(1)가 약한 저해활성을 나타낸 반면 decursin(2)은 hACAT1와 hACAT2에 대하여 IC50 값이 각각 137, 168 µM로서 우수한 저해활성을 나타내었다. 한편, 참당귀의 뿌리를 비롯한 꽃, 종자, 잎 등 여러부위에서 decursinol angelate(1), decursin(2)를 정량분석하였는데, 이때 LC/MS/MS(ESI, positive ion mode, MRM mode) 분석을 이용하였다. Decursinol angelate의 함량은 뿌리>잎>종자>꽃 순으로 높았으며, decursin의 함량은 뿌리>종자>꽃>잎 순으로 높게 측정되었다.
대상 데이터
- (St. Louis, MO)에서 구입하였고 50% Grace’s insect medium은 Gibco-BRL(Grand Islands, NY)에서 구입하였으며 fetal bovine serum과 HyQSFX-Insect MP medium은 Hyclone(Lofan, UT)에서 구입하였다.
- DNA 제한효소는 New England Biolab(Beverly, MA)와 Invitrogen (Carlsbad, CA)으로부터 구입하였으며 형질전환 virus 생산과 insect cells(Sf9 & Hi5)를 위한 Bac-to-Bac system은 GibcoBRL에서 구입하였다.
- 식물시료. 대량시료 추출을 위한 참당귀(Angelica gigas) 뿌리는 수원의 농촌진흥청 국립식량과학원 포장에서 재배된 2년근 시료를 2006년 10월에 수확하여 상온에 건조한 후 분쇄한 것을 사용하였다. 참당귀 꽃 등 부위별 성분분석을 위한 시료는 2007년 10월에 위와 동일한 포장에서 재배된 2년근 참당귀를 수확하여 부위별로 동결건조한 후 분쇄한 것을 시료로 사용하였다.
- 대량시료 추출을 위한 참당귀(Angelica gigas) 뿌리는 수원의 농촌진흥청 국립식량과학원 포장에서 재배된 2년근 시료를 2006년 10월에 수확하여 상온에 건조한 후 분쇄한 것을 사용하였다. 참당귀 꽃 등 부위별 성분분석을 위한 시료는 2007년 10월에 위와 동일한 포장에서 재배된 2년근 참당귀를 수확하여 부위별로 동결건조한 후 분쇄한 것을 시료로 사용하였다.
이론/모형
- hACAT1/hACAT2 저해활성 측정. ACAT 저해 활성 측정은 Brecher과 Chan의 방법[Brecher 등, 1980; Lee 등, 2001]과 이를 약간 변형한 Cho 등[2003]의 방법으로 하였다. 즉, 아세톤에 1 mg/mL의 농도로 용해된 콜레스테롤 용액 6.
- TLC 분석에는 Silica gel 60 F254(precoated, Merck)를 사용하고 이때 detection reagent로는 10% H2SO4 용액을 사용하였다. 식물시료로부터 분리한 화합물들의 구조 동정을 위한 NMR 측정에는 JEOL JNM-LA400 FT-NMR spectrometer(JEOL Ltd., Tokyo, Japan)가 사용되었다. 기능성 성분의 LC/MS/MS 분석에는 Agilent 1200 HPLC system(Agilent Technolgies, Santa Clara, CA)과 TurboIonSpray source를 가지고 있는 3200 QTrap mass spectrometer(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)를 사용하였다.
성능/효과
- Decursinol angelate의 함량은 뿌리>잎>종자>꽃 순으로 높았 으며, decusin 함량은 뿌리>종자>꽃>잎 순으로 높았다(Fig. 5).
- Decursinol angelate의 함량은 뿌리>잎>종자>꽃 순으로 높았으며, decursin의 함량은 뿌리>종자>꽃>잎 순으로 높게 측정되었다.
- 참당귀의 꽃, 종자, 잎, 뿌리는 80% MeOH 로 추출한 후 decrusinol angelate(1), decursin(2)의 함량을 LC/ MS/MS의 positive ion mode, MRM mode를 사용하여 측정하였다. 그 결과, LC/MS/MS의 MRM mode에서 참당귀의 꽃을 비롯한 모든 부위에서 decrusinol angelate(1), decursin(2) 성분이 모두 존재하고 있음은 두 성분의 protonated molecular ion/ product ion 이온쌍으로 확인할 수 있었다. 즉, MRM mode 에서 두 성분 모두 공통적으로 m/z 329.
- 따라서 참당귀 부위별 주요 pyranocoumarin계 성분의 함량을 정량분석 함으로써 이용하지 않고 버려지는 참당귀 부산물의 이용도 증진을 위한 기초자료로 활용하고자 하였다. 먼저, 참당귀 꽃을 시료로 하여 분리한 decrusinol angelate(1), decursin(2)을 표준품으로 사용하고 HPLC-UV법으로 정성분석을 하였을 때(Fig. 2), HPLC 역상 컬럼에서 두 성분을 분리하여 검출할 수 있을 것으로 추정되었다. 그러나 보다 정확하게 참당귀 각 부위 추출물에서 두 성분을 확인하고 정량하기 위하여 LC/MS/MS 분석을 실시하였다.
- 시료의 농도를 100 µg/mL로 하여 hACAT1, hACAT2에 대한 저해도를 측정한 결과, decursinol angelate(1)는 각각 39, 54%의 비교적 낮은 저해도를 나타내는 반면, decursin(2)은 각각 68, 75%의 우수한 저해도를 나타내었다.
- 이들 화합물에 대하여 hACAT 저해 활성을 검정해본 결과, decursinol angelate(1)가 약한 저해활성을 나타낸 반면 decursin(2)은 hACAT1와 hACAT2에 대하여 IC50 값이 각각 137, 168 µM로서 우수한 저해활성을 나타내었다.
- Decursinol angelate의 함량은 뿌리>잎>종자>꽃 순으로 높았으며, decursin의 함량은 뿌리>종자>꽃>잎 순으로 높게 측정되었다. 이상의 결과들은, 참당귀의 decursin이 동맥경화와 같은 심혈관 질환의 개선과 치료를 위해 유용하게 이용될 수있음을 시사하였다. 또한 뿌리 이외에 그 동안 이용되지 않고 있던 참당귀 꽃, 잎과 같은 비상용부위에도 기능성물질인 decursin, decursinol angelate이 상당량 함유되어 있음이 구명되어 이러한 부위도 새로운 천연 기능성 소재로서 활용될 수 있음을 기대할 수 있었다.
- 그 결과, LC/MS/MS의 MRM mode에서 참당귀의 꽃을 비롯한 모든 부위에서 decrusinol angelate(1), decursin(2) 성분이 모두 존재하고 있음은 두 성분의 protonated molecular ion/ product ion 이온쌍으로 확인할 수 있었다. 즉, MRM mode 에서 두 성분 모두 공통적으로 m/z 329.2/229.2, 329.2/213.1 (protonated molecular ion/product ion) 이온쌍을 가지고 있었으며 각 성분의 특이 이온쌍으로는 decrusinol angelate(1)가 m/z 329.2/115.1 이온쌍, decusin(2)이 m/z 329.2/83.0 이온쌍을 가지고 있음을 확인하였으며(Fig. 3) 이 각각의 이온쌍을 이용하여 함량을 정량하였다(Fig.
- 활성이 높은 decursin에 대해서는 다양한 농도구간에서 저해도를 측정하여 IC50을 구해본 결과(Table 2), hACAT1과 hACAT2에 대하여 IC50 값이 각각 137, 168 µM을 나타내었다. 즉, hACAT1과 hACAT2에 대한 선택적 저해활성은 보이지 않았으며 양성 대조군으로 사용된 oleic acid anilide가 300 nM 처리 농도에서 hACAT1, hACAT2에 대한 저해도가 각각 57, 65%인 것과 비교하면(Table 1), decursin의 hACAT 저해활성이 아주 강력하지는 않았다. 그러나 쑥갓에서 분리한 hACAT 저해성분으로 보고된 5,5'-dibuthoxy-2,2'-bifuran의 hACAT1, hACAT2저해활성이 각각 IC50 값으로 160, 190 µM인 것과 비교하면 약간 높은 경향이었다[Song 등 2008].
- 839%로서 decursinol angelate 함량이 decursin 함량보다 약 4배 정도 높은 것이 특징이었다. 참당귀 종자에서는 decusin, decursinol angelate 성분이 각각 0.338, 0.645% 함유되어 있었고, 참당귀 꽃에서도 decusin, decursinol angelate 두 성분이 각각 0.262, 0.562% 함유되어 있었다. 특히, 참당귀 꽃은 꽃대가 크고 추출물은 적색소를 함유하고 있을 뿐 아니라 본 연구결과와 같이 참당귀 고유의 pyranocoumarin 성분도 다량 함유하고 있어서 향후 천연 기능성 소재로서 개발 가치가 높을 것으로 기대되었다.
- 활성이 높은 decursin에 대해서는 다양한 농도구간에서 저해도를 측정하여 IC50을 구해본 결과(Table 2), hACAT1과 hACAT2에 대하여 IC50 값이 각각 137, 168 µM을 나타내었다.
후속연구
- 결론적으로, 참당귀에서 분리한 decursin 성분은 ACAT 저해 활성이 높아 고지혈증, 동맥경화와 같은 심혈관 질환을 개선할수 있는 기능성 소재로의 개발 가능성을 보여주었으며, 또한 참당귀 잎과 꽃 등과 같은 비상용 부위에서도 decursin과 decursinol angelate 성분이 일정량 함유되어 있어 버려지는 참당귀 비상용 부위를 이용한 새로운 기능성 소재 개발이 가능할 것으로 기대되었다.
- 시료의 농도를 100 µg/mL로 하여 hACAT1, hACAT2에 대한 저해도를 측정한 결과, decursinol angelate(1)는 각각 39, 54%의 비교적 낮은 저해도를 나타내는 반면, decursin(2)은 각각 68, 75%의 우수한 저해도를 나타내었다. 두 화합물이 isoform인 것을 고려하면 활성과 구조상관성에 대한 검토가 향후에 필요할 것으로 사료되었다. 활성이 높은 decursin에 대해서는 다양한 농도구간에서 저해도를 측정하여 IC50을 구해본 결과(Table 2), hACAT1과 hACAT2에 대하여 IC50 값이 각각 137, 168 µM을 나타내었다.
- 이상의 결과들은, 참당귀의 decursin이 동맥경화와 같은 심혈관 질환의 개선과 치료를 위해 유용하게 이용될 수있음을 시사하였다. 또한 뿌리 이외에 그 동안 이용되지 않고 있던 참당귀 꽃, 잎과 같은 비상용부위에도 기능성물질인 decursin, decursinol angelate이 상당량 함유되어 있음이 구명되어 이러한 부위도 새로운 천연 기능성 소재로서 활용될 수 있음을 기대할 수 있었다.
- 562% 함유되어 있었다. 특히, 참당귀 꽃은 꽃대가 크고 추출물은 적색소를 함유하고 있을 뿐 아니라 본 연구결과와 같이 참당귀 고유의 pyranocoumarin 성분도 다량 함유하고 있어서 향후 천연 기능성 소재로서 개발 가치가 높을 것으로 기대되었다. 향후, 참당귀 뿌리 뿐 아니라 꽃 또는 잎을 기능성 소재로 개발하기 위해서는 개화기 이후 생육시기별로 참당귀 부위에 따른 pyranocoumarin 성분변이를 면밀히 검토해 볼 필요성이 있다.
- 특히, 참당귀 꽃은 꽃대가 크고 추출물은 적색소를 함유하고 있을 뿐 아니라 본 연구결과와 같이 참당귀 고유의 pyranocoumarin 성분도 다량 함유하고 있어서 향후 천연 기능성 소재로서 개발 가치가 높을 것으로 기대되었다. 향후, 참당귀 뿌리 뿐 아니라 꽃 또는 잎을 기능성 소재로 개발하기 위해서는 개화기 이후 생육시기별로 참당귀 부위에 따른 pyranocoumarin 성분변이를 면밀히 검토해 볼 필요성이 있다.
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