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문제 정의
- 본 연구에서는 지치의 색소성분을 활용한 기능성 건강기능식품 소재를 개발하기 위해 지치 뿌리의 헥산 추출물로부터 acetylshikonin을 분리하고, 저밀도지질단백질(LDL) 산화 저해활성과 새로운 항암제 개발 타겟인 farnesyl:protien transferase (FPTase) 효소에 대한 저해활성을 검정하였다.
제안 방법
- 지치 뿌리의 분말 시료 3 kg에 헥산 12 L를 넣고 10일 동안 상온에 방치하여 총 4회 동일 방법으로 추출하고, 여과한 후 진공 농축하였다. 5-6회 추출은 남아있는 시료 잔사에 용매 6 L 정도 추가하여 상온 진탕 추출한 후 여과하여 진공 농축하였다. 총 6회에 거쳐 농축한 헥산 농축액(Hexane ext.
- FPTase 효소활성 측정. FPTase 효소활성은 섬광근접접근법(scintillation proximity assay, SPA)으로 측정하였으며[Reiss 등, 1990b], FPTase 효소는 Reiss 등의 방법[Reiss 등, 1990a]에 따라 정제하였다.
- FPTase 효소활성은 섬광근접접근법(scintillation proximity assay, SPA)으로 측정하였으며[Reiss 등, 1990b], FPTase 효소는 Reiss 등의 방법[Reiss 등, 1990a]에 따라 정제하였다. FPTase의 효소활성은 [3H]-farnesyl pyrophosphate로부터 Biotin-KKKSKTKCVIM으로 [3H]-farnesyl이 전이되는 것을 측정하는 것으로 검정하였다. 즉 20 µL tritium으로 치환된 3H-Farnesyl pyrophosphate(3H-FPP), 20 µL biotin lamin B peptide, 10 µL acetylshikonin, 10 µL의 buffer(50 mM TrisHCl, pH 7.
- 용출용매로는 Hexane:EtOAc(30:1→1:11) 혼합용매와 EtOAc:MeOH(25:1→1:2) 혼합용매의 기울기 용리로 용출하면서 500 mL씩 분취하여 총 421개 분획을 분취하였다. 각 분취 분획은 UV 검출기 520 nm의 파장에서 HPLC 분석으로 동일성을 확인한 후 유사한 패턴의 분획들은 서로 합쳐 재농축하여 최종 농축 분획 30개(Fr. 1~30)를 얻었다. 최종 30개의 분획 중 Fr.
- 또 3개의 methyl carbon signal들이 각각 δ 25.74(C-16), 20.95(C-18), 17.92(C-15)에서 관측되었으며 이 signal들에 상응하는 methyl proton signal들을 각각 δ 1.75(1H, s, H-16), 2.20(1H, s, H-18), 1.67(1H, s, H-15)에서 관측하였다.
- 이외 1H, 13C-NMR, DEPT, HMQC, HMBC spectra data를 면밀히 분석한 결과, compound 1은 nathoquinone계 화합물인 acetylshikonin인 것으로 추정되었다. 또한 compound 1의 NMR 분석 데이터가 문헌치와도 일치하여[Hwang 등, 2000] 그 구조를 최종 acetylshikonin (Fig. 1)으로 결정하였다.
- 반응액에 150 µL STOP/bead 시약을 넣어주어 반응을 종결시키고 30분간 상온에서 방치한 후에 liquid scintillation counter로 반응정도를 측정하였다.
- LDL oxidation 측정. 분리한 acetylshikonin의 생리활성 측정을 위해 먼저 human LDL의 Cu2+-유도형 과산화에 대한 보호 효과를 in vitro 측정하였다. 혈액은 대한적십자혈액원의 연구용 혈액기증프로그램의 가이드라인에 대하여 동의한 건강한 정상인으로부터 지원받은 후 표준방법[Havel 등, 1955]을 약간 변형하여 LDL을 분리하였다[Ahn 등, 2001].
- 이때 Blank 1은 시료와 효소가 모두 없는 경우이고, Blank 2는 시료는 있고 효소가 없는 경우이고, Control은 시료는 없고 효소만 있는 경우이다. 이렇게 계산된 값들로부터 자료회귀(data regression)을 이용하여 acetylshikonin이 암세포의 성장을 50% 억제하는 농도인 IC50값으로 FPTase 저해활성을 측정하였다.
- 즉 PBS용액에 있는 LDL 용액(250 µL, 50-100 µg protein)에 10 µM CuSO4를 추가하였다.
- 지치뿌리 시료는 1년근 재배 지치를 한국생약협회에서 구입하여 사용하였으며, voucher specimen (MPS000071)은 농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부 식물 표본실에 보관중이다. 지치 뿌리의 분말 시료 3 kg에 헥산 12 L를 넣고 10일 동안 상온에 방치하여 총 4회 동일 방법으로 추출하고, 여과한 후 진공 농축하였다. 5-6회 추출은 남아있는 시료 잔사에 용매 6 L 정도 추가하여 상온 진탕 추출한 후 여과하여 진공 농축하였다.
- 지치의 compound 1을 이용한 건강기능식품 소재 개발 가능성을 검토하기 위해 동맥경화증 개선효과와 새로운 타켓에 의한 항암효과를 평가하였다. 먼저 동맥경화증 개선효과를 평가하기 위해 Cu2+로 유도된 human LDL 산화억제 효과를 검정한 결과, 단일농도 20 µg/mL 처리에서 compound 1은 92%의 LDL 산화 저해도를 나타내었다(Table 1).
- 총 6회에 거쳐 농축한 헥산 농축액(Hexane ext., 26 g)은 silica gel이 충진된 column(5×40 cm)에서 column chromatography를 실시하였다.
대상 데이터
- 최종 혼합물은 95℃에서 5분간 가열하고 얼음으로 냉각시킨 후 1000×g에서 2분간 원심분리 하였다. 생성된 MDA(malondialdehyde)의 흡광도는 532 nm에서 측정하였으며 tertamethoxypropane으로부터 얻은 MDA를 표준품으로 이용하여 정량하였다.
- 용출용매로는 Hexane:EtOAc(30:1→1:11) 혼합용매와 EtOAc:MeOH(25:1→1:2) 혼합용매의 기울기 용리로 용출하면서 500 mL씩 분취하여 총 421개 분획을 분취하였다.
- 추출 및 분리. 지치뿌리 시료는 1년근 재배 지치를 한국생약협회에서 구입하여 사용하였으며, voucher specimen (MPS000071)은 농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부 식물 표본실에 보관중이다. 지치 뿌리의 분말 시료 3 kg에 헥산 12 L를 넣고 10일 동안 상온에 방치하여 총 4회 동일 방법으로 추출하고, 여과한 후 진공 농축하였다.
이론/모형
- FPTase 효소활성 측정. FPTase 효소활성은 섬광근접접근법(scintillation proximity assay, SPA)으로 측정하였으며[Reiss 등, 1990b], FPTase 효소는 Reiss 등의 방법[Reiss 등, 1990a]에 따라 정제하였다. FPTase의 효소활성은 [3H]-farnesyl pyrophosphate로부터 Biotin-KKKSKTKCVIM으로 [3H]-farnesyl이 전이되는 것을 측정하는 것으로 검정하였다.
- 혈액은 대한적십자혈액원의 연구용 혈액기증프로그램의 가이드라인에 대하여 동의한 건강한 정상인으로부터 지원받은 후 표준방법[Havel 등, 1955]을 약간 변형하여 LDL을 분리하였다[Ahn 등, 2001]. LDL 산화정도는 Buege와 Aust의 TBARS(thiobarbituric acid reactive substances) assay[Buege와 Aust, 1978]를 약간 변형한 Ahn 등의 방법[2001]으로 측정하였다. 즉 PBS용액에 있는 LDL 용액(250 µL, 50-100 µg protein)에 10 µM CuSO4를 추가하였다.
- 1 g)을 최종 분리, 정제하였다. 분리한 화합물의 구조 동정을 위한 분광학적 분석의 NMR 측정에는 JEOL JNM-LA400 FT-NMR spectrometer(JEOL Ltd., Tokyo, Japan)가 사용되었고, EI/MS 측정에는 JEOL JMS-AX505WA(JEOL Ltd., Tokyo, Japan)가 사용되었다.
성능/효과
- 단일농도에서의 acetylshikonin의 우수한 항산화능을 1차 확인한 후, 강력한 항산화제인 probucol를 양성대조구로 하여 acetylshikonin(1)의 LDL 산화 저해를 농도별로 측정하여 비교한 결과, IC50 값이 8.8 µM로 측정되었다(Table 2).
- 먼저 동맥경화증 개선효과를 평가하기 위해 Cu2+로 유도된 human LDL 산화억제 효과를 검정한 결과, 단일농도 20 µg/mL 처리에서 compound 1은 92%의 LDL 산화 저해도를 나타내었다(Table 1).
- 이들 flavonoid 성분의 LDL 산화 저해도 IC50 값이 6.3~26.9 µM 수준임을 감안할 때 acetylshikonin(1)은 천연물 수준에서는 상당히 우수한 LDL 산화 저해능으로 평가되었다.
- 지치 뿌리에서 분리한 acetylshikonin(1)의 FPTase에 대한 저해 활성을 측정한 결과, Table 3에서와 같이 IC50 값이 23 µM(7.7 µg/mL)로서 우수한 저해능을 나타내었다.
후속연구
- 2 µg/mL로서 보고되기도 하였는데[Kwon 등, 2009], quinone계 구조를 가진 천연색소 성분들이 비교적 우수한 FPTase 저해활성을 나타내고 있어 구조-활성 상관성이 있을 것으로 추정할 수 있었다. 그러나 이 부분에 대한 판단은 다양한 화합물로 구조-활성 상관성에 대한 연구가 이루어져야 가능할 것이다.
- 반면에 지치의 뿌리는 전통적으로 식용, 약용으로 이용되었을 정도로 안전성이 높기 때문에[Lee 등, 1998], 지치의 주요 색소 성분인 acetylshikonin(1)은 보다 안전한 LDL 산화 저해제로서 개발이 가능할 것으로 예상되었고 동맥경화성 심장질환을 개선하거나 예방하는 효과가 클 것으로 기대되었다. 다만, 지치의 acetylshikonin에 대해서도 HDL-cholesterol의 농도변화에 미치는 영향에 대한 검토가 차후에 이루어져야 할 것으로 사료되었다.
- 본 연구의 결과로부터, 지치 색소는 동맥경화성 심장질환을 개선하거나 예방하는 효과 및 항암 활성이 우수하므로 이들 활성과 관련된 건강기능식품 소재로 개발이 가능할 것으로 기대되었다. 특히 식품 안전성과 기능성에 대한 요구도가 점차 높아지는 요즘, 지치 색소는 기능성 천연색소로서 그 가치가 새롭게 부각될 것으로 전망된다.
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