담배거세미나방과 파밤나방에 활성이 있는 Bacillus thuringiensis subsp. aizawai CAB109 균주의 특성 Characterization of Bacillus thuringiensis subsp. aizawai CAB109 isolate with bioactivities to Spodoptera litura and Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae)원문보기
국내에서 분리된 Bacillus thuringiensis subsp. aizawai CAB109균주가 난방제 해충으로 알려진 담배거세미나방과 파밤나방에 동시에 높은 독성을 보이는 것으로 나타났다. B.t. CAB109 균주의 활성을 평가하기 위해 혈청형이 aizawai이면서 미생물농약으로 시판중인 TB-WP제품 및 SC제품과의 살충활성을 비교한 결과, B.t. CAB109균주, TB-WP제품, SC제품은 담배거세미나방 2령충에 대한 반수치사농도($LC_{50}$)가 각각 $1.3{\times}10^5cfu/ml$, $2.3{\times}10^6cfu/ml$, $5.2{\times}10^5cfu/ml$으로 나타났고 파밤나방 2령충에 대한 반수치사농도는 $1.8{\times}10^4cfu/ml$, $1.3{\times}10^6cfu/ml$, $1.5{\times}10^6cfu/ml$으로 나타나 두 종 해충 모두에서 B.t. CAB109 균주가 독성이 더 높은 것을 볼 수 있었다. B.t. CAB109균주가 이미 알려져 있는 aizawai와 비교해 차이가 나는 새로운 유전자를 소유하는지 확인하기 위해 Plasmid DNA를 추출하여 전기영동 한 결과 B.t. subsp. aizawai HD-133과 다른 패턴을 보이는 것을 확인 할 수 있었고 Cry1-Cry5의 primer를 사용하여 PCR을 진행한 결과 B.t. subsp. aizawai CAB109균주는 Cry1Aa, 1Ab, 1C, 1D를 B.t. subsp. aizawai HD-133은 Cry1Aa, 1Ab를 가지고 있음을 확인 할 수 있었다.
국내에서 분리된 Bacillus thuringiensis subsp. aizawai CAB109균주가 난방제 해충으로 알려진 담배거세미나방과 파밤나방에 동시에 높은 독성을 보이는 것으로 나타났다. B.t. CAB109 균주의 활성을 평가하기 위해 혈청형이 aizawai이면서 미생물농약으로 시판중인 TB-WP제품 및 SC제품과의 살충활성을 비교한 결과, B.t. CAB109균주, TB-WP제품, SC제품은 담배거세미나방 2령충에 대한 반수치사농도($LC_{50}$)가 각각 $1.3{\times}10^5cfu/ml$, $2.3{\times}10^6cfu/ml$, $5.2{\times}10^5cfu/ml$으로 나타났고 파밤나방 2령충에 대한 반수치사농도는 $1.8{\times}10^4cfu/ml$, $1.3{\times}10^6cfu/ml$, $1.5{\times}10^6cfu/ml$으로 나타나 두 종 해충 모두에서 B.t. CAB109 균주가 독성이 더 높은 것을 볼 수 있었다. B.t. CAB109균주가 이미 알려져 있는 aizawai와 비교해 차이가 나는 새로운 유전자를 소유하는지 확인하기 위해 Plasmid DNA를 추출하여 전기영동 한 결과 B.t. subsp. aizawai HD-133과 다른 패턴을 보이는 것을 확인 할 수 있었고 Cry1-Cry5의 primer를 사용하여 PCR을 진행한 결과 B.t. subsp. aizawai CAB109균주는 Cry1Aa, 1Ab, 1C, 1D를 B.t. subsp. aizawai HD-133은 Cry1Aa, 1Ab를 가지고 있음을 확인 할 수 있었다.
Bacillus thuringiensis subsp. aizawai CAB109 isolated in Korea is known active against Spodoptera sp.. Especially, B. thuringiensis aizawai CAB109 isolates showed 100% mortality against Spodoptera litura and Spodoptera exigua. To screen highly active B. thuringiensis, the pathogenicity of B. thuring...
Bacillus thuringiensis subsp. aizawai CAB109 isolated in Korea is known active against Spodoptera sp.. Especially, B. thuringiensis aizawai CAB109 isolates showed 100% mortality against Spodoptera litura and Spodoptera exigua. To screen highly active B. thuringiensis, the pathogenicity of B. thuringiensis CAB109 was compared with that of commercialized B. thuringiensis products. $LC_{50}$ values of CAB109, product TB-WP and product SC strains of B. thuringiensis were $1.3{\times}10^5$, $2.3{\times}10^6$ and $5.2{\times}10^5\;cfu/ml$ against the 2nd larva of S. litura and $1.8{\times}10^4$, $1.3{\times}10^6$ and $1.5{\times}10^6\;cfu/ml$ against the 2nd larva S. exigua, respectively. To determine new gene's existence and absence, the plasmid DNA was extracted, and compared to that of B.t. aizawai HD-133. Both B. thuringiensis were not like plasmid DNA pattern. PCR technique was used to predict both plasmid DNA's cry gene. PCR products analysis showed that B.t. CAB109 harbor Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1C and Cry1D and B.t. HD-133 has Cry1Aa and Cry1Ab, respectively.
Bacillus thuringiensis subsp. aizawai CAB109 isolated in Korea is known active against Spodoptera sp.. Especially, B. thuringiensis aizawai CAB109 isolates showed 100% mortality against Spodoptera litura and Spodoptera exigua. To screen highly active B. thuringiensis, the pathogenicity of B. thuringiensis CAB109 was compared with that of commercialized B. thuringiensis products. $LC_{50}$ values of CAB109, product TB-WP and product SC strains of B. thuringiensis were $1.3{\times}10^5$, $2.3{\times}10^6$ and $5.2{\times}10^5\;cfu/ml$ against the 2nd larva of S. litura and $1.8{\times}10^4$, $1.3{\times}10^6$ and $1.5{\times}10^6\;cfu/ml$ against the 2nd larva S. exigua, respectively. To determine new gene's existence and absence, the plasmid DNA was extracted, and compared to that of B.t. aizawai HD-133. Both B. thuringiensis were not like plasmid DNA pattern. PCR technique was used to predict both plasmid DNA's cry gene. PCR products analysis showed that B.t. CAB109 harbor Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1C and Cry1D and B.t. HD-133 has Cry1Aa and Cry1Ab, respectively.
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문제 정의
subsp. aizawai CAB 109균주의 이용가능성을 검토하고자 하였다.
제안 방법
aizawai CAB109 균주의 Cry gene을 확인하기 위해 11개의 primer를 사용하였다(Table 1)(Porcar and Juarez-Perez, 2003). Top DNA polymerase 1U, dNTP 250uM, Tris-HCl(pH 9.0) 10mM, KCl 30mM, MgCl2 1.5mM이 포함되어 있는 PCR premix를 이용하여 20ul의 반응물로 PCR을 수행하였다. 주형 DNA는 94℃에서 1분, 47℃에서 30초, 72℃ 1분의 조건으로 수행하였다.
aizawai CAB109, TB-WP 제품, SC제품은 NA배지에 접종하여 27℃에서 4-6일 동안 배양 후 위상차 현미경으로 내독소 결정체 단백질 형성을 관찰하면서 내독소 단백질을 형성하였을 때, 배지10위의 균을 모아 원심튜브와 원심분리기를 이용해 1.0×106 (cfu/ml)에 해당하는 포자와 내독소단백질이 혼재된 균액을 가지고 살충정도를 4단계로 나누어 생물검정에 사용하였다.
subsp. aizawai CAB109균주의 다른 해충으로의 기주범위 및 생물활성을 확인하기 위해 실험실에서 사육중인 나비목 해충인 배추좀나방, 파밤나방, 파리목 해충인 빨간집모기와 이집트숲모기 그리고 야외충인 미국흰불나방, 암청색줄무늬나방, 쌀바구미를 채집하여 총 8종에 대한 살충 활성을 검정하였다(Table 2). 검정 결과 파밤나방, 담배거세미나방에는 100%로의 살충력을 보였으며 파리목 해충인 빨간집모기와 이집트숲모기, 딱정벌레목인 쌀바구미에는 살충활성을 나타내지 않았다.
subsp. aizawai HD-133 균주의 plasmid DNA 패턴을 확인하였다. 실험에서 담배거세미나방과 파밤나방에 활성이 있는 B.
subsp. aizawai TB-WP제품과 SC제품을 배양하여 이들 간의 반수치사농도(LC50)값을 조사하였다. B.
담배거세미나방과 파밤나방에 대한 생물활성 검정은 희석액 100 μl를 0.5g의 인공 사료에 첨가하여 2령 유충 10마리씩 petri dish에 넣고 각기 120시간, 96시간 동안 치사율을 조사하였다.
5g의 인공 사료에 첨가하여 2령 유충 10마리씩 petri dish에 넣고 각기 120시간, 96시간 동안 치사율을 조사하였다. 모든 실험은 3반복실시 하였다(Kim et al., 2008, Choi et al., 2008).
미국흰불나방과 암청색줄무늬밤나방에 대한 생물활성 검정은 야외충과 기주를 채집하여 직경 3 cm에 200μl의 1.0×109 (cfu/ml)의 균액을 뿌려 음건한 뒤 10마리씩 48시간 동안 관찰하였다.
실험에 사용된 균주를 LB배지(10 ml)에 접종하여 28-30℃, 180-250rpm의 조건하에서 16시간동안 배양하였다. 배양액의 1ml를 SPY배지(0.2% (NH4)2DO4, 1.4% K2HPO4, 0.6% KH2PO4, 0.1% Sodium citrate, 0.02% MgSO4․7H2O, 0.1% Yeast extract, 0.1% Glucose)에 접종하여 OD600 측정값이 0.7-1.0이 될 때까지 4시간 정도 배양한 후, 배양된 균은 모두 10,000 rpm, 5분, 4℃의 조건으로 원심분리하여 균체만 회수 하였다. 상청액은 버리고 수확한 균체에 P1용액(50 mM Tris․Cl, pH8, 10 mM EDTA, 100 ㎍/ml RNaseA) 4 ml와 라이소자임(50 mg/ml)을 50ul 첨가하고 37℃에서 30분정도 반응시킨 후, P2용액(200 mM 수산화나트륨, 1% SDS) 4ml에 5분, 상온에서 반응시키고 P3용액(3M 초산칼륨) 4m에 ICE에서 15분동안 반응시키고 12,000rpm, 15분, 4℃의 조건으로 원심분리하였다.
배추좀나방에 대한 생물활성 검정은 직경 2cm의 배추 잎에 100μl의 희석액을 뿌려 습기가 완전히 마를 때까지 음건한 뒤, 각 구당 2령 유충 20마리씩을 petri dish에 넣고 48시간동안 치사율을 조사하였다.
빨간집모기와 이집트숲모기에 대한 생물활성 검정은 300μl의 1.0×109 (cfu/ml)의 균액을 멸균수 30 ml에 희석하여 부화 후 3-4일된 유충 20마리씩을 플라스틱 컵에 넣고 25℃에서 48시간 동안 치사율을 조사하였다(Kil et al., 2008).
쌀바구미에 대한 검정은 쌀 1 g에 200 μl의 희석액을 뿌려 습기가 완전히 마를 때까지 음건한 뒤, 각 구당 20마리의 성충을 넣고 48시간 동안 치사율을 조사하였다.
3×106 cfu/ml의 농도로 5×2m의 면적에 살포하였다. 약제 처리는 1주일 간격으로 3회 처리하고 모든 실험은 3회 반복 실시하였다. 처리구에서 임의로 파 30 포기를 선택하여 피해주수와 해충수를 확인하였다(Jin et al.
또한, 나비목해충인 배추좀나방, 암청색줄무늬나방에 대해 높은 독성 효과를 나타내었다. 위 균주가 독성을 보이는 해충 중에서 난방제 해충으로 알려져 있는 파밤나방과 담배거세미나방에 대해 독성을 보이는 것을 확인하고 좀 더 정확한 살충활성을 확인하기 위해 담배거세미나방과 파밤나방 두 종 나비목해충에 대한 반수치사농도를 확인하였다(Table 3, 4). B.
대상 데이터
aizawai CAB109 균주 및 대조군으로서 시판 중인 TB-WP 제품을 약 2.3×106 cfu/ml의 농도로 5×2m의 면적에 살포하였다.
subsp. aizawai CAB109 균주가 독성을 보이는지 확인하기 위해 2008년 8월 11일부터 9월 3일까지 전남 진도군 군내면 녹진리의 파밭에서 파밤나방을 대상으로 포장 검정을 실시하였다. 검정 당시의 포장 상황은 주당 해충 밀도가 약 0.
subsp. aizawai CAB109 균주를 사용하였다. 생물활성과 살충성 독소단백질 유전자를 비교하기 위해, 대조 균주로서 시판중인 B.
subsp. aizawai 제품인 TB-WP제품(토박이)과 SC제품(스콜피온)은 구입하여 사용하였다.
파리목인 모기는 서울대학교 농업생명과학대학으로부터 분양받은 빨간집모기(Culex pipiens pallens), 이집트숲모기(Aedes aegypti)로 치어사료에 yeast extrast를 첨가한 먹이로 사육하여 사용하였다. 딱정벌레목 해충인 쌀바구미(Sitophilus oryzae)는 야외개체군을 채집하여 사용하였다. 모든 곤충은 온도 25±2℃, 광조건 16L:8D, 상대습도 50-60%의 조건에서 사육되었다.
, 1990). 미국흰불나방(Hyphanria cunea) 및 암청색줄무늬밤나방(Arete coerulea)은 대전 유성구 충남대학교 인근에서 채집하여 사용하였다. 파리목인 모기는 서울대학교 농업생명과학대학으로부터 분양받은 빨간집모기(Culex pipiens pallens), 이집트숲모기(Aedes aegypti)로 치어사료에 yeast extrast를 첨가한 먹이로 사육하여 사용하였다.
본 실험에서 사용된 나비목 해충인 배추좀나방(Plutella xylostella), 파밤나방(S. exigua), 담배거세미나방(S. litura)은 농촌진흥청 농업기술과학원으로부터 분양받았으며 인공먹이를 사용하여 실험실에서 누대 사육하였다. 인공먹이는 이미 알려진 것을 토대로 하여 만들었다(Goh et al.
미국흰불나방(Hyphanria cunea) 및 암청색줄무늬밤나방(Arete coerulea)은 대전 유성구 충남대학교 인근에서 채집하여 사용하였다. 파리목인 모기는 서울대학교 농업생명과학대학으로부터 분양받은 빨간집모기(Culex pipiens pallens), 이집트숲모기(Aedes aegypti)로 치어사료에 yeast extrast를 첨가한 먹이로 사육하여 사용하였다. 딱정벌레목 해충인 쌀바구미(Sitophilus oryzae)는 야외개체군을 채집하여 사용하였다.
이론/모형
subsp. aizawai CAB109 균주의 Cry gene을 확인하기 위해 11개의 primer를 사용하였다(Table 1)(Porcar and Juarez-Perez, 2003). Top DNA polymerase 1U, dNTP 250uM, Tris-HCl(pH 9.
파밤나방과 담배거세미나방의 반수치사농도(LC50) 희석농도는 담배거세미나방과 파밤나방 유충이 모두 사망하는 농도와 생존하는 농도까지 일정한 비율로 5-7가지의 농도 범위로 하여 조사된 사충율을 가지고 Finney(1971)의 probit 계산법에 기초한 PC프로그램(Raymond, 1985)을 이용하여 반수치사농도(LC50)을 산출하였다.
) 희석농도는 담배거세미나방과 파밤나방 유충이 모두 사망하는 농도와 생존하는 농도까지 일정한 비율로 5-7가지의 농도 범위로 하여 조사된 사충율을 가지고 Finney(1971)의 probit 계산법에 기초한 PC프로그램(Raymond, 1985)을 이용하여 반수치사농도(LC50)을 산출하였다.
성능/효과
subsp. aizawai CAB109 균주는 이미 보고되어 사용하는 있는 대조균주와 동일하지 않은 신규균주임을 확인할 수 있었다.
subsp. aizawai CAB109 균주에 포함되어 있는 Cry gene을 확인하기 위해 plasmid DNA를 PCR 수행한 결과, 담배거세미나방과 파밤나방에 대해 활성을 보이지 않은 B.t. aizawai HD-133은 Cry 1Aa, Cry1Ab만을 포함하고 있고 B.t. aizawai CAB109는 Cry1Aa, Cry1Ab이외에도 Cry1C, Cry1D를 포함하고 있는 것을 확인 할 수 있다(Fig. 4). 본 실험에서 B.
subsp. aizawai CAB109는 TB-WP 제품보다 파밤나방에 의한 피해가 적은 것을 확인 할 수 있었으나(Table 6), 통계학적유의성은 없는 것으로 확인되어 살충율에 차이를 보인 두 미생물 균주 처리도 피해엽 비율에 있어서는 큰 차이를 나타내지 않는다는 것을 알 수 있었다.
subsp. aizawai CAB109는 파밤나방과 담배거세미나방에 대해 기존에 시판되어 방제에 이용되고 있는 두 미생물살충제보다 높은 살충활성을 보이는 것을 확인 할 수 있었으며, 파 재배지에서의 야외포장실험 결과에서도 방제 효과를 보여주었다. 또한, 플라스미드 DNA와 Cry gene을 PCR로 확인한 결과에서도 두 종 해충의 방제를 위해 사용하고 있는 기존 미생물제제의 균주와 다른 유전 양상이 확인되어, 추후 위의 결과를 토대로 추가적인 생물검정과 Cry 유전자의 염기서열 분석을 통해 분자생물학적으로 새로운 균주임을 확인함과 동시에, 신규 미생물살충제로서의 가능성을 검토할 계획이다.
subsp. aizawai CAB109와 TB-WP 제품 간에 처리 후 1주와 2주차의 살충효과간의 차이 또한 통계학적으로도 유의성이 있는 것으로 나타났다. 하지만 3주차에는 살충율에 있어 차이를 보였지만, 이들 간의 차이는 통계학적으로는 유의성이 없는 것으로 나타났다.
aizawai CAB109의 LC95값으로 대조균주인 두 기존 생물농약의 농도를 동일하게 처리한 후 확인해 본 결과 B.t. aizawai CAB109가 기존 생물농약보다 고독성을 나타내었으며, 실험 후 2일 차부터 다른 생물농약에 비해 더 빠른 살충효과를 보이는 것을 확인 할 수 있다(Fig. 1 & 2).
aizawai TB-WP제품, SC제품은 담배거세미나방 2령충에 대해 각기 1.3×105, 2.3×106 그리고 5.2×105 (cfu/ml)의 반수치사농도를, 파밤나방에 대해서는 각각 1.8x104, 1.3x106, 1.5x106의 반수치사 농도 값을 나타내어 두 종 해충 모두에 있어 시험한 기존 B.t.미생물제제들보다 살충효과가 높게 나타남을 확인할 수 있었다(Table 3 & 4).
aizawai CAB109균주의 다른 해충으로의 기주범위 및 생물활성을 확인하기 위해 실험실에서 사육중인 나비목 해충인 배추좀나방, 파밤나방, 파리목 해충인 빨간집모기와 이집트숲모기 그리고 야외충인 미국흰불나방, 암청색줄무늬나방, 쌀바구미를 채집하여 총 8종에 대한 살충 활성을 검정하였다(Table 2). 검정 결과 파밤나방, 담배거세미나방에는 100%로의 살충력을 보였으며 파리목 해충인 빨간집모기와 이집트숲모기, 딱정벌레목인 쌀바구미에는 살충활성을 나타내지 않았다. 또한, 나비목해충인 배추좀나방, 암청색줄무늬나방에 대해 높은 독성 효과를 나타내었다.
aizawai CAB109 균주가 독성을 보이는지 확인하기 위해 2008년 8월 11일부터 9월 3일까지 전남 진도군 군내면 녹진리의 파밭에서 파밤나방을 대상으로 포장 검정을 실시하였다. 검정 당시의 포장 상황은 주당 해충 밀도가 약 0.2 마리였으며 피해주율은 20%였다. 토양 시료로부터 분리된 B.
미생물 농약 뿐만 아니라 화학농약보다도 더 효과가 좋았던 것을 확인할 수 있다. 그리고 화학농약과의 교호처리에서도 다른 B.t. 보다 높은 방제효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
aizawai HD-133은 6개의 플라스미드를 포함하고 있는 것으로 조사 되었다. 또한 B.t. aizawai CAB109 균주는 HD-133에 비해 2개의 플라스미드가 다른 곳에 위치해 있음을 알 수 있었다(Fig. 3). 이 결과를 토대로 B.
검정 결과 파밤나방, 담배거세미나방에는 100%로의 살충력을 보였으며 파리목 해충인 빨간집모기와 이집트숲모기, 딱정벌레목인 쌀바구미에는 살충활성을 나타내지 않았다. 또한, 나비목해충인 배추좀나방, 암청색줄무늬나방에 대해 높은 독성 효과를 나타내었다. 위 균주가 독성을 보이는 해충 중에서 난방제 해충으로 알려져 있는 파밤나방과 담배거세미나방에 대해 독성을 보이는 것을 확인하고 좀 더 정확한 살충활성을 확인하기 위해 담배거세미나방과 파밤나방 두 종 나비목해충에 대한 반수치사농도를 확인하였다(Table 3, 4).
후속연구
aizawai CAB109는 파밤나방과 담배거세미나방에 대해 기존에 시판되어 방제에 이용되고 있는 두 미생물살충제보다 높은 살충활성을 보이는 것을 확인 할 수 있었으며, 파 재배지에서의 야외포장실험 결과에서도 방제 효과를 보여주었다. 또한, 플라스미드 DNA와 Cry gene을 PCR로 확인한 결과에서도 두 종 해충의 방제를 위해 사용하고 있는 기존 미생물제제의 균주와 다른 유전 양상이 확인되어, 추후 위의 결과를 토대로 추가적인 생물검정과 Cry 유전자의 염기서열 분석을 통해 분자생물학적으로 새로운 균주임을 확인함과 동시에, 신규 미생물살충제로서의 가능성을 검토할 계획이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
파밤나방의 원산지는 어디인가?
, 1984). 파밤나방은 동남아시아가 원산지로서 주로 열대 및 아열대지역에 넓게 분포하고 있으나 이동성이 강하여 최근에 온대지역에도 발생이 증가하고 있다. 기주범위가 광범위하여 채소, 화훼, 과수 등 40과 200여종에 달하고, 국내에서는 파, 배추, 수박 등에 다발생하여 큰 피해를 주고 있다(Ahn et al.
파밤나방의 기주범위는 어떠하며 국내에서는 어떤 종류에 다발생하여 큰 피해를 주고 있는가?
파밤나방은 동남아시아가 원산지로서 주로 열대 및 아열대지역에 넓게 분포하고 있으나 이동성이 강하여 최근에 온대지역에도 발생이 증가하고 있다. 기주범위가 광범위하여 채소, 화훼, 과수 등 40과 200여종에 달하고, 국내에서는 파, 배추, 수박 등에 다발생하여 큰 피해를 주고 있다(Ahn et al., 1989).
파밤나방의 분포지역은 어디인가?
, 1989). 파밤나방은 우리나라 남부지방의 밭작물에 대발생하여 큰 피해를 주고 한국, 중국, 대만을 포함한 아시아지역과 이집트, 인도, 오스트레일리아 및 태평양군도 등에 이르는 열대, 아열대 및 온대에 걸쳐 폭 넓게 분포하고 있는 난지성 해충이다. 담배거세미나방은 두과작물, 십자화과, 가지과, 화본과, 광엽성작물, 화훼류에 이르는 110여종이 넘는 기주를 가해하는 대표적인 광식성 해충의 하나이다.
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