담배거세미나방에 살충효과를 나타내는 새로운 Bacillus thuringiensis 균주의 특성 Characterization of New Bacillus thuringiensis Isolated with Bioactivities to Tobacco Cutworm, Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae)원문보기
국내 토양으로부터 분리한 Bacillus thuringiensis 균주에서 담배거세미나방(Spodoptera litura)에 선택적으로 살충효과를 나타내는 새로운 균주를 선발하였다. 이 균주의 결정성 독소단백질은 위상차 현미경과 주사전자현미경으로 관찰한 결과 전형적인 이중피라미드 형태이며 H serotype으로 동정한 결과 Bacillus thuringiensis subsp. CAB 109로 동정되었다. 난방제 해충인 담배거세미나방 3령충에 대해 B. t. subsp. aizawai CAB 109균주외 분리된 다른 3균주의 생물활성을 비교 검토하였다. 살충활성 결과에서 B. t. subsp. aizawai CAB 109 균주가 $1.3{\times}10^7$ (cfu/ml)에서 100% 사망률로 다른 균주에 비해 높은 활성을 나타내었다. 담배거세미나방은 배추좀나방과 다르게 7일 이상 경과한 뒤에야 100% 사충률을 나타내었다. 한편, 담배거세미나방 2령, 3령, 4령충에 대한 살충활성의 검정에서 B. t. aizawai subsp. CAB 109 균주의 $LD_{50}$값이 각각 $9.78{\times}10^5,\;6.87{\times}10^6,\;1.83{\times}10^7$ (cfu/ml)으로 살충활성을 나타내었다. B. t.를 섭식한 담배거세미나방 유충의 사망 현상은 지효성이며 대조군보다 무게가 $6{\sim}7$배정도 적으며 다음 령기로 성장하지 못하고 죽었다. 또한 B. t. subsp. aizawai CAB 109 균주의 SDS-PAGE에서의 단백질 패턴과 trypsin을 처리한 단백질의 결과에서 기존의 B. t. subsp. aizawai와 CAB 109균주와의 차이점은 발견할 수 없었다.
국내 토양으로부터 분리한 Bacillus thuringiensis 균주에서 담배거세미나방(Spodoptera litura)에 선택적으로 살충효과를 나타내는 새로운 균주를 선발하였다. 이 균주의 결정성 독소단백질은 위상차 현미경과 주사전자현미경으로 관찰한 결과 전형적인 이중피라미드 형태이며 H serotype으로 동정한 결과 Bacillus thuringiensis subsp. CAB 109로 동정되었다. 난방제 해충인 담배거세미나방 3령충에 대해 B. t. subsp. aizawai CAB 109균주외 분리된 다른 3균주의 생물활성을 비교 검토하였다. 살충활성 결과에서 B. t. subsp. aizawai CAB 109 균주가 $1.3{\times}10^7$ (cfu/ml)에서 100% 사망률로 다른 균주에 비해 높은 활성을 나타내었다. 담배거세미나방은 배추좀나방과 다르게 7일 이상 경과한 뒤에야 100% 사충률을 나타내었다. 한편, 담배거세미나방 2령, 3령, 4령충에 대한 살충활성의 검정에서 B. t. aizawai subsp. CAB 109 균주의 $LD_{50}$값이 각각 $9.78{\times}10^5,\;6.87{\times}10^6,\;1.83{\times}10^7$ (cfu/ml)으로 살충활성을 나타내었다. B. t.를 섭식한 담배거세미나방 유충의 사망 현상은 지효성이며 대조군보다 무게가 $6{\sim}7$배정도 적으며 다음 령기로 성장하지 못하고 죽었다. 또한 B. t. subsp. aizawai CAB 109 균주의 SDS-PAGE에서의 단백질 패턴과 trypsin을 처리한 단백질의 결과에서 기존의 B. t. subsp. aizawai와 CAB 109균주와의 차이점은 발견할 수 없었다.
Bacillus thuringiensis with selected high toxicities against tobacco cutworm, Spodoptera litura were isolated from domestic soils. When being observed under a phase-contrast microscope, the insecticidal crystal proteins were showed a bipyramidal crystal types. New CAB 109 isolate was identified to B...
Bacillus thuringiensis with selected high toxicities against tobacco cutworm, Spodoptera litura were isolated from domestic soils. When being observed under a phase-contrast microscope, the insecticidal crystal proteins were showed a bipyramidal crystal types. New CAB 109 isolate was identified to B. thuringiensis subsp. aizawai in the H serotype. As a results of insecticidal activities between CAB 109 isolate and 3 existing ready-made products against 3rd larva of S. litura, CAB 109 isolate showed 100% mortality with spore concentration $(1.3{\times}10^7cfu/ml)$. It was a very high insecticidal activity compared with a existing ready-made B. t. products. $LD_{50}$ values of CAB 109 isolate was $9.78{\times}10^5,\;6.87{\times}10^6\;and\;1.83{\times}10^7cfu/ml$ spore concentration against 2nd, 3rd and 4th larva of S. litura, respectively. Unlike Plutella xylostella, S. litura was slowly died after application up to 7 days. The weight of S. litura larva applied with CAB 109 isolate were 6-7 times less than controlled group. Even though it didn't die, it did not grow into next larva. The result observed with scanning electron microscope was that CAB 109 isolate of B. t. aizawai formed a typical bipyramidal crystal protein type. Otherwise, when CAB 109 isolate was examined with SDS-PAGE and with trypsin, there was no difference between CAB 109 strain and ready-made products of B. thuringiensis.
Bacillus thuringiensis with selected high toxicities against tobacco cutworm, Spodoptera litura were isolated from domestic soils. When being observed under a phase-contrast microscope, the insecticidal crystal proteins were showed a bipyramidal crystal types. New CAB 109 isolate was identified to B. thuringiensis subsp. aizawai in the H serotype. As a results of insecticidal activities between CAB 109 isolate and 3 existing ready-made products against 3rd larva of S. litura, CAB 109 isolate showed 100% mortality with spore concentration $(1.3{\times}10^7cfu/ml)$. It was a very high insecticidal activity compared with a existing ready-made B. t. products. $LD_{50}$ values of CAB 109 isolate was $9.78{\times}10^5,\;6.87{\times}10^6\;and\;1.83{\times}10^7cfu/ml$ spore concentration against 2nd, 3rd and 4th larva of S. litura, respectively. Unlike Plutella xylostella, S. litura was slowly died after application up to 7 days. The weight of S. litura larva applied with CAB 109 isolate were 6-7 times less than controlled group. Even though it didn't die, it did not grow into next larva. The result observed with scanning electron microscope was that CAB 109 isolate of B. t. aizawai formed a typical bipyramidal crystal protein type. Otherwise, when CAB 109 isolate was examined with SDS-PAGE and with trypsin, there was no difference between CAB 109 strain and ready-made products of B. thuringiensis.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
어려운 실정이다. 따라서 방제하기 어려운 담배거세미나방의 생태학적 특성을 고려하여 친환경적인 생물적 방제 인자로 이용하여 방제하고자 국내 서식지의 토양으로부터 Bacillus thuringiensis 균주의 선발을 검토하였다. B.
따라서 본 연구에서는 난방제 해충인 담배거세미나방의 친환경적이며 종합적 방제 방법에 이용하고자 곤충병원성 미생물 자재의 선발을 검토하였다. 국내 토양으로부터 분리되어 담배거세미나방에 강한 살충활성을 나타내는 B.
가설 설정
에 대한 초기반응도 2령충은 3일후에 나타나는 반면, 노령충인 4령충은 5일후로 매우 느리게 나타나기 시작하였다 또한 4령의 7일 이후의 사망률은 60%로 나타나 100% 인 2령충에 비해 현저히 떨어졌다. 야외포장에서는 다양한 령기가 혼재되어있으므로 2, 3, 4령충이 혼재되어 있다고 가정하고 이들의 사충률의 평균값을 조사했다. 그 결과, 3령유충의 사망률과 비슷한 추이를 보여 106 (cfii/ml) 이상의 농도로 B.
f.에 대한 감수성이 높고 섭식량도 적은 발생 초기에 방제하는 것이 효과적일 것이다.
제안 방법
thuringiensis subsp. aizawai CAB 109 균주(Kim et al., 2006)를 동정하고 생물검정을 통하여 살충효과의 특성을 조사하였다.
thuringiensis subsp. aizawai CAB 109균주 그리고 T와 SB제품을 처리하여 7일 동안 생존율 추이를 조사하였다
thuringiensis subsp. aizawai CAB 109균주를 NA배지에 접종하고 27℃에서 4~7일 동안 배양하면서 위상차 현미경으로 내독소 결정체 단백질 형성을 관찰하고 나서 곤충에 대한 독성검정에 이용하였다. 선발된 B.
thuringiensis subsp. aizawai CAB 109균주의 활성 단백질 패턴을 기존의 균주들과의 차이점을 조사하기 위해 trypsin을 처리한 뒤 SDS-PAGE를 실시하였다. 이 결과 담배거세미나방에 대하여 B.
thuringiensis subsp. aizawai 균주와 살충성 독소 단백질의 형태를 비교해 보기 위해 주사전자현미경으로 관찰하였다. Fig.
thuringiensis subsp. aizawaiCAB 109의 배양액을 1^107 (cfu/ ml)의 동일한 농도로 2, 3, 4령충에 처리하여 령기간의 사망속도의 차이를 확인하였다. 령기가 높아질수록 3 t.
thuringiensis subsp. kurstaki (3abc) CAB 116의 5 개 균주를 SDS-PAGE를 통하여 단백질 패턴을 비교 조사하였다. 12% separating gel로 전기영동한 결과 CAB 109균주는 기존의 B.
담배거세미나방에 대한 생물활성 검정은 spore-cry마al mixture 희석액 100 pl를 0.5 g의 인공 사료에 첨가하여 2・3령 유충은 각각 30마리씩, 4령 유충은 20마리씩의 유충을 petri dish에 넣고 168시간 동안 치사율을 조사하였다.
사망 현상도 섭식 후 24시간이 지나면서 서서히 죽어가면서 섭식을 하지 않고 성장도 못하면서 령기도 변화되지 못하다가 결국 사망에 이른다. 따라서 이들 살아만 있는 해충의 무게를 6일째에 측정하여 비교하고 발육상태를 확인해보았다(Table 3). B.
시험에 사용하는 균주를 Nutrient agar 배지에 접종하여 27℃ 에서 5일 동안 배양한 후 위상차현미경에서 autolysis 가 일어나는 것을 확인한 뒤 15,000 ipm으로 원심 분리하여 집균하였다. 모든 샘플은 500 mM NaCl, 2% Triton X-100가 포함된 용액에서 3번, 500 mM NaCl이 포함된 용액에서 3번 세척되어졌다.
1978). 이 균주를 Nutrient agar plate (Difco) 을 사용하여 27℃ 에서 4일간 배양한 뒤, conducting silver paint (Ladd Res., USA)에서 금으로 코팅을 하여 표본을 준비하였으며 Philips XL 30 ESEM (Plilps, Netherlands) 을 이용하여 관찰하고 사진을 찍었다.
대상 데이터
thuringiensis 균주는 생물검정에 사용하기 위하여 배양액을 l.OxlO8 (cfb/i이)이상으로 만들어 적용하였다.
thuringiensis subsp. aizawai CAB 109균주가 100%의 가장 높은 활성을 나타내 CAB 109균주를 선발하여 실험을 수행하였다(Table 1).
본 실험에서 사용된 공시곤충으로 나비목 해충인 담배거세미나방㎛od即切YZ litura)-^ 농촌진흥청 농업과학기술 원으로부터 분양받아 인공사료를 사용하여 실험실에서 누대 사육하였다(Goh et al., 1990). 곤충은 온도 25±2℃, 광조건 16L : 8D, 상대습도 50~60%의 조건에서 사육되었다.
곤충은 온도 25±2℃, 광조건 16L : 8D, 상대습도 50~60%의 조건에서 사육되었다. 활성검정에 비교실험에 사용된 상품은 시중에서 구입하여 사용하였다.
이론/모형
Laemmli (1970)의 방법에 따라 12% separating gel (30% Acrylamide/Bis, 1.5 M Tris-HCl. pH 8.8, 10% SDS, TEMED, 10% Ammonium Persulf汀te)과 4% stacking gel (30% Acrylamide/Bis, 1 M Tris-HCl. p티 6.8, 10% SDS, TEMED, 10% Ammonium Persuliate)^- SDS-PAGE를 수행하였다. 전기 영동이 끝난 时은 0.
모든 실험은 3반복 실시하였으며, 담배거세미나방에 대한 치사율은 그 결과를 Finney (1971)의 probit 계산법에 기초한 PC 프로그램(Reymond, 1985)을 이용하여 반수 치사 농도(LD50)를 산출하였다.
성능/효과
aizawaiCAB 109 균주에 대해 담배거세미나방 2, 3, 4령충의 LG。값을 조사하였다. 결과는 각각 9.78x10s (cfii/ml), 6.87^106 (cfu/ml), 1.83x1" (cH/ml)으로 령기가 높아질수록 B. L에 대한 감수성이 현저히 낮아지는 것을 확인할 수 있다(Table 2). 이러한 결과는 화학농약에 의한 담배거세미나방 유충의 영 기별 약제 감수성 시험의 결과에서도 유사한 결과를 나타냈다 (Cho et al.
thuringiensis subsp. aizawai CAB 109 균주는 80%이상의 사충률을 보여 큰 차이를 보였으며 7일 후에는 100%의 사망률로 나타났다.
thuringiensis subsp. aizawai CAB 109균주는 살충효과를 높게 나타내나 단백질 패턴에서는 담배나방에 전혀 효과가 없는 기존의 B. thuringiensis subsp aizawai 균주와 거의 유사하게 나타내었다(Fig. 5).
야외포장에서는 다양한 령기가 혼재되어있으므로 2, 3, 4령충이 혼재되어 있다고 가정하고 이들의 사충률의 평균값을 조사했다. 그 결과, 3령유충의 사망률과 비슷한 추이를 보여 106 (cfii/ml) 이상의 농도로 B. 를 처리하여야 야외포장에서 담배거세미나방을 방제할 수 있을 것으로 사료된다(Fig. 3). Cho et al.
본 시험은 담배거세미나방에 살충효과를 나타내는 새로운 B. thuringiensis균주를 국내에서 분리, 선발을 검토하였다 Kim et al. (2006)은 사전 시험으로 분리된 16개의 B. thuringiensis 균주에서 해충에 활성을 나타내는 균주를 선발하여 일본규수대학에 보내 H serotype의 동정을 의뢰하였다 결과로서 무독성으로 나타난 CAB 101 균주가 ostriniae (8ac)로 동정되었고, CAB 104, CAB 110, CAB 111, CAB 116 등의 균주는 kurstaki (3abc)로 분류되었으며, CAB 109 균주는 aizawai (7)로 분류되었다 또한 원형크리스탈을 형성하고 파리목인 빨간집모기에만 활성을 나타낸 CAB 113 균주는 colmeri (2))로 분류되었다. 이 중 담배거세미나방에 대해 높은 활성을 보인 B.
aizawai 균주와 CAB 109균주 모두 전형적인 이중피라미드형 크리스탈을 형성흐! 였다. 이들 토양에서 분리 선발된 B. thuringiensis 균주에서 담배거세미나방에 50%이상의 활성을 보인 것은 CAB 104 균주를 포함하여 7개의 균주로 나타났으며 모두가 배추좀나방에도 동시에 살충 효과를 나타냈다.
(1996) 등의 연구에서 농약에 대한 감수성이 담배거세미나방의 유충의 령기가 낮을수록 효과가 우수하다고 보고하였다. 이와 유사한 결과로서 새롭게 분리된 B. thuringiensis2] CAB 104, 109, 110, 111균주의 경우에서도 담배거세미나방 2령 유충에 대해 모두 100%의 활성을 나타내고 있으나 3령 유충에 대한 활성검정에서는 차이가 나타났다. 이러한 균주의 생물활성 실험 결과, B.
후속연구
, 1989). 따라서 앞으로 CAB 109균주에 대한 유전학적 연구가 수행되어 균주의 특성이 판명되어야 할 것이다.
참고문헌 (27)
Ahn, S.B., I.S. Kim, W.S. Cho, M.H. Lee and K.M. Choi. 1989. The Occurance of the crop insect pests from Korea in 1988. Korean J. Appl. Entomol. 28(4): 246-253
Apaydin, O., A.F. Yenidunya, S. Harsa and H. Gunes. 2005. Isolation and characterization of Bacillus thuringiensis strains from different grain habitats in Turkey. World J. Microbiol. Biotechnol. 21: 285-292
Aronson, A.I., W. Beckman and P. Dunn. 1986. Bacillus thuringiensis and related insect pathogens. Microbil. Rev. 50: 1-24
Bae, S.D., B.R. Choi, Y.H. Song and H.J. Kim. 2003. Insecticide susceptibility in the different larva of tobacco cutworm, Spodoptera litura Fabricius (Lepidoptera: Noctuidae) collected in the soybean fields of Milyang, Korea. Korean J. Appl. Entomol. 42(3): 225-231
Bae, S.D., H.J., Kim, G.H., Lee and S.T., Park. 2007. Seasonal occurrence of tobacco cutworm, Spodoptera litura Fabricius and beet armyworm, Spodoptera exigua hubner using sex pheromone traps at different locations and regions in Yeongnam district. Korean J. Appl. Entomol. 46(1): 27-35
Bae, S.D., K.B. Park and Y.J. Oh. 1997. Effect of temperature and food source on the egg and larval development of tobacco cutworm, Spodoptera litura Fabricius. Korean J. Appl. Entomol. 36(1): 48-54
Cho, J.R., W.R. Song., S.Y., Hwang, H.S. Kim and J.O. Lee. 1996. Age-related susceptibilty of Spodoptera litura larvae to some insecticides. Korean J. Appl. Entomol. 35(3): 249-253
Choi, J.Y., H.S. Kim, B.R. Jin, K.Y. Seol, H.Y. Park and S.K. Kang. 1996. Pathogenicity and production of Spodoptera exigua nuclear polyhedrosis virus. Korean J. Appl. Entomol. 35(3): 228-231
Crickmore, N., D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van rie, D. Lereclus, J. Baum and D.H. Dean. 1998. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(3): 807-813
Da Silva, S.M.B., J.O. Silva-Werneck, R. Falcao, A.C. Gomes, R.R. Fragoso, M.T. Quezado, O.B.O. Neto, J.B. Aguiar, M.F. G. de Sa, A. Bravo and R.G. Monnerat. 2004. Characterization of novel Brazilian Bacillus thuringiensis strains active against Spodoptera frugiperda and other insect pests. J. Appl. Ent. 128: 102-107
Finney, D.J. 1971. Probit analysis, estimation of the median effective dose. Cambridge University Press. London. 19-47
Gill, S.S., E.A. Cowles and V. Francis. 1995. Identification, isolation, and cloning of a Bacillus thuringiensis CryIAc toxin binding protein from the midgut of the lepidopteran insect Heliothis virescens. J. Biol. Chem. 270: 27277-27282
Goh, H.G., S.G. Lee, B.P. Lee, K.M. Choi and J.H. Kim. 1990. Simple mass-rearing of beet armyworm, Spodoptera exigua (Hubner) (Lepidoptera: Noctuidae), on an artificial diet. Korean J. Appl. Entomol. 29: 180-183
Goh, H.G., J.D. Park, Y.M. Choi, K.M. Cho and I.S. Park. 1991. The host plants of beet armyworm, Spodoptera exigua (Hubner), (Lepidoptera: Noctuidae) and its occurrence. Korean J. Appl. Entomol. 30(2): 111-116
Goldberg, L.J. and J. Margalit. 1977. A bacterial spore demonstration rapid larvicidal activity against Anopheles serengotii, Uranotaenia unguiculata, Culex univittatus, Aedes aegypti and Culex pipiens. Mosq. News. 37: 355-358
Gough, J.M., D.H. Kemp, R.J. Akhurst, R.D. Pearson and K. Kongsuwan. 2005. Identification and characterization of proteins from Bacillus thuringiensis with high toxic activity against the sheep blowfly, Lucilia cuprina. J. Invertebr. Pathol. 90: 39-46
Kim, D.A., J.S. Kim, M.R. Kil, Y.N. Youn, D.S. Park and Y.M. Yu. 2006. Isolation and activity of insect pathogenic Bacillus thuringiensis strain from soil. Korean J. Appl. Entomol. 45(3): 357-362
Kim, S.G., J.D. Park, D.I. Kim., D.J. Im., K.C. Kim and Y.M. Yu. 2003. Effects of field application of Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus to control S. litura in chrysanthemum. Korean J. Appl. Entomol. 42(2): 153-157
Laemmli, U. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 277: 680-685
Lee, G.H., S.D. Bae, H.J. Kim, S.T. Park and M.Y. Choi. 2006. Economic injury levels for the common cutworm, Spodoptere litura (Fabricius) (Lepidoptera: Noctuidae) on soybean. Korean J. Appl. Entomol. 45(3): 333-337
Ohba, M. and K. Aizwa. 1978. Serological identification of Bacillus thuringiensis and related bacteria isolated in Japan. J. Invertebr. Pathol. 32: 303-309
Park, H.W., H.S. Kim, D.W. Lee, Y.M. Yu, B.R. Jin and S.K. Kang. 1995. Expression and synergistic effect of three types of crystal protein genes in Bacillus thuringiensis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 214(2): 602-607
Raymond, M. 1985. Presentation d'un programme d'analyse logprobit pour micro-ordinnateur. Cah. ORSTOM, Ser. Ent. Med. et Parasitol. 22: 117-121
Tamez-Guerra, P., A.A. Iracheta, B. Pereyra-Alferez, L.J. Galan- Wong, R. Gomez-Flores, R.S. Tamez-guerra, and C. Rodriguez- Padilla. 2004. Characterization of Mexican Bacillus thuringiensis strains toxic for lepidopteran and coleopteran larvae. J. Invertebr. Pathol. 8: 7-18
Yasutake, K., N.D. Binh, K. Kagoshima, A. Uemori, A. Ohgushi, M. Maeda, E. Mizuki, Y.M. Yu and M. Ohba. 2006. Occurrence of parasporin-producing Bacillus thuringiensis in Vietnam. Can. J. Microbiol. 52: 365-372
Zheng, S.J., B. Henken, R.A. de Maagd, A. Purwito, F.A. Krens and C. Kik. 2005. Two different Bacillus thuringiensis toxin genes confer resistance to beet armyworm (Spodoptera exigua Hubner) in transgemic Bt-shallots (Allium cepa L.). Transgemic Research, 14: 261-272
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.