[논문]HepG2 세포에서 까마귀쪽나무 과육 열수 추출물의 소포체 스트레스 억제 효능

김은옥; 제갈경환; 김재광; 이주상; 박정아; 김상찬; 조일제

doi:10.14374/hfs.2018.26.4.307

[국내논문] HepG2 세포에서 까마귀쪽나무 과육 열수 추출물의 소포체 스트레스 억제 효능
Inhibitory Effects of Litsea japonica Flesh Water Extract against Endoplasmic Reticulum Stress in HepG2 Cells 원문보기

大韓韓醫學方劑學會誌 = Herbal formula science, v.26 no.4, 2018년, pp.307 - 318

김은옥 (대구한의대학교 한의과대학) , 제갈경환 (대구한의대학교 한의과대학) , 김재광 (대구한의대학교 한의과대학) , 이주상 (제주한의학연구원) , 박정아 (대구한의대학교 한의과대학) , 김상찬 (대구한의대학교 한의과대학) , 조일제 (대구한의대학교 한의과대학)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : Endoplasmic reticulum (ER) stress designates cellular responses to the accumulation of misfolded and unfolded proteins in ER, which is related to a variety of liver diseases. Present study investigated the inhibitory effects of Litsea japonica flesh water extract (LJE) aganist ER stress. Methods : After HepG2 cells were pretreated with LJE and subsequently exposed to tunicamycin (Tm) or thapsigargin (Tg), expression of C/EBP homologous protein (CHOP), glucose regulated protein 78 kDa (GRP78), asparagine synthetase (ASNS), and endoplasmic reticulum DnaJ homologue 4 (ERDJ4) were determined by immunoblot and real-time PCR analysis. Three canonical signaling pathways in response to ER stress were examined to explore molecular mechanisms involved. Results : Pretreatment of 1 mg/mL LJE inhibited Tm- or Tg-induced CHOP expression, while L. japonica fruit water extract did not. In addition, LJE decreased the levels of GRP78, ASNS, and ERDJ4 mRNA by Tm. Moreover, phosphorylations of eukaryotic translation initiation factor $2{\alpha}$ and inositol-requiring enzyme 1, expression of nuclear form of activating transcription factor $6{\alpha}$, and transactivation of ER stress response element- and unfolded protein response element-harboring luciferase activities were inhibited by LJE pretreatment. Conclusions : Present results suggest that LJE would be a candidate to prevent or treat ER stress-mediated liver injuries.

Keyword

표/그림 (4)

그림 Figure 1. The effect of L. japonica water extract on ER stress-mediated CHOP expression.
그림 Figure 2. The effect of LJE on ER stress-dependent target genes expression.
그림 Figure 3. The effect of LJE on Tm-mediated UPR signaling pathway.
그림 Figure 4. The effect of LJE on ERSE- and UPRE-luciferase activity by Tm.

AI 본문요약
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문제 정의

한의학에서 열매를 약용부위로 삼는 본초들의 경우 종종 열매 전체 (예, 白荳蔲, 砂仁, 草果, 吳茱萸, 枳實 등), 종자 (예, 桃仁, 巴豆, 杏仁, 檳榔子 등) 또는 과육 (예, 烏梅, 山茱萸 등)을 구분하여 이용한다. 따라서 본 연구에서는 까마귀쪽나무 열매를 급만성 간질환 치료 및 예방의 신규 약용소재로써 활용 가능성을 제고하기 위한 한의학적 접근법으로써 과육 열수 추출물과 종자를 포함하는 열매 열수 추출물을 각각 구분하여 제조한 후 세포 수준에서의 소포체 스트레스에 대한 까마귀쪽나무 열매의 효능 및 기전을 연구하였다.

제안 방법

. 까마귀쪽나무 열매의 소포체 스트레스 제어 효능을 연구하기 위하여 0.1-1 mg/mL의 까마귀쪽나무 열매 열수 추출물 (LJfE)과 까마귀쪽나무 과육 열수 추출물 (LJE)을 전 처치한 HepG2 세포에 3 μg/mL의 Tm을 9시간 동안 처치하여 CHOP 단백질의 변화를 면역화학 분석으로 연구하였다. 선행 연구보고와 유사하게³⁾, HepG2 세포에 Tm 자극은 무처치 대조세포와 비교하여 통계적으로 유의하게 CHOP 단백질의 발현을 증가시켰다.
1 mg/mL의 LJE에 의한 CHOP 단백질 발현 억제가 전사 조절을 통하여 나타나는 결과인지 확인하기 위하여 CHOP mRNA를 real-time PCR 분석으로 연구하였다. HepG2 세포에 9시간 동안의 3 μg/mL의 Tm 자극은 CHOP mRNA를 무처치 대조세포 대비 21.
LJE에 의한 UPR 신호 전달 과정의 제어가 궁극적으로 UPR에 의하여 활성화되는 전사인자들을 억제할 수 있는지 연구하기 위하여 HepG2 세포에 ERSE와 UPRE 영역을 포함하는 재조합 플라스미드를 형질도 입한 후 리포터 유전자 분석을 수행하였다. 12시간 동안의 3 μg/mL의 Tm 자극은 ERSE와 UPRE가 결합된 luciferase 활성을 증가시켰으며, 1 mg/mL의 LJE 전처치는 Tm에 의하여 증가한 ERSE와 UPRE 매개 luciferase 활성을 통계적으로 유의하게 억제하였다.

대상 데이터

까마귀쪽나무 열매는 제주한의학연구원으로부터 검증받은 시료를 분양 받았으며, 과육을 얻기 위해 씨앗을 제거하였다. 까마귀쪽나무 열매 전체 또는 과육 각 100 g을 물 1 L에 넣어 3시간 동안 가열하여 얻은 추출액을 Whatman No.
HepG2 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 구입하였으며, 10% fetal bovine serum, 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 포함한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하여 실험목적에 맞는 multi-well plate 바닥 면적의 80-90% 정도 성장시킨 후 실험에 이용하였다. 12시간 정도 serum이 포함되지 않은 DMEM에서 성장을 정지시킨 HepG2 세포는 0.

데이터처리

모든 실험결과는 3회 반복시행 후 mean ± standard deviation (S.D.)로 표기하였으며, 그룹간 통계적 유의성은 one way analysis of variance로 분석한 후, 등분산 가정의 결과에 따라 Tukey HSD test 또는 Dunnett T3 test로 사후 검정하였다. 모든 결과의 통계적 유의성은 P < 0.

성능/효과

또한 골관절염 환자를 대상으로 한 임상시험에서도 까마귀쪽나무 열매 추출물이 골관절염 환자의 통증 정도와 무릎 강직을 개선 할 수 있음을 보고하였다¹⁹⁾. 본 연구그룹에서는 까마귀쪽나무 열매 추출물의 활용 분야를 확대하기 위한 예비 연구로써 간실질세포주에서 tert-butylhydroperoxide로 유도한 산화적 스트레스에 대한 억제 효능을 확인하였으며 (data not shown), 이를 통해 까마귀쪽나무 열매 추출물이 급만성 간질환에도 활용될 수 있는 가능성을 확인하였다.
따라서 본 연구에서는 소포체 스트레스에 대한 까마귀쪽나무 열매 추출물의 효과와 소포체 스트레스와 관련된 세포 내 신호 분자들의 변화를 연구하고자 우선적으로 CHOP 단백질의 발현 변화를 관찰하였다. HepG2 세포에서 다양한 농도의 까마귀쪽나무 과육 (LJE) 및 열매 열수 추출물 (LJfE)의 전처치 중 1 mg/mL의 과육 열수 추출물 (LJE) 전처치만이 특이적으로 Tm에 의하여 증가한 CHOP 발현을 억제하였다. 더불어 1 mg/mL의 LJE는 Tg에 의한 CHOP 단백질의 증가 또한 통계적으로 유의하게 억제하였다.
LJE에 의한 소포체 스트레스 의존적 신호 네트워크의 억제가 궁극적으로 전사인자들에 의한 전사활성화가 제어될 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 ERSE 및 UPRE가 포함된 리포터 유전자 분석을 수행한 결과, Tm에 의하여 증가된 ERSE 및 UPRE 리포터 유전자 활성이 LJE 전처 치에 의하여 억제될 수 있음을 규명하였다. 이상의 결과는 LJE는 소포체 스트레스에 의하여 활성화되는 신호 분자의 활성, 전사인자의 활성화 및 표적 유전자군의 전사 제어를 통해 소포체 스트레스를 억제할 수 있음을 나타낸다.

후속연구

Tanaka 등 (1990) 과 Takeda 등 (1972)은 까마귀쪽나무에 lactones, fatty acids, essential oils, alkaloids 및 terpenoids 등의 생리활성 성분을 포함하고 있음을 보고하였다^29,30). 따라서 과육에 포함된 소포체 스트레스의 억제에 관여하는 유효성분들의 동정과 열매 및 과육 추출 물 내의 이들 유효성분들의 함유량과 관련된 후속 연구가 지속적으로 필요할 것으로 사료된다.
그러나, LJE 단독처치는 ASNS과 ERDJ4 mRNA, 소포체 스트레스 유도성 신호 분자들(ATF6, eIF2α 및 IRE1)의 활성, ERSE 및 UPRE 의존적 리포터 유전자 활성은 변화시키지 못하였다. 이와 같은 결과는 연구 방법의 민감도에 따른 차이 또는 다른 신호 분자의 활성화를 통하여 LJE가 선택적으로 CHOP 및 GRP78의 전사를 조절한 것으로 생각되며 이에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 판단된다.
본 연구에서는 까마귀쪽나무 과육 열수 추출물이 세포 수준에서 소포체 스트레스에 대한 억제 효능이 있음을 규명하여, 급만성 간질환 치료 및 예방의 신규 약용소재로써 까마귀쪽나무 과육의 활용 가능성을 제시하였다. 이상의 연구와 더불어 까마귀쪽나무 과육 열수 추출물에 함유된 지표(효능)성분 연구, 까마귀쪽나무 과육 열수 추출물에 의한 소포체 스트레스 신호 분자들의 제어와 관련된 상위 신호 분자 연구, 동물 수준에서의 효능 및 안전성과 관련된 연구가 지속적으로 이루어진다면 급만성 간질환의 예방 또는 치료를 위한 처방에 까마귀쪽나무 과육을 추가하여 구성하거나, 처방을 구성하는 일부 약재를 대체할 수 있는 의약소재로써 까마귀쪽나무 과육을 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	과육에 포함된 소포체 속에서 GRP78의 반응은 무엇인가?	GRP78은 소포체 내 존재하는 대표적인 molecular chaperone으로서 소포체 스트레스에 의하여 활성화된 ATF6 의존적으로 발현이 증가하며 소포체 내 변형된 단백질의 축적을 억제한다31). ERDJ4는 DnaJ protein family의 하나로서 소포체 스트레스에 의하 여 XBP-1 의존적으로 발현이 증가하는 소포체 내 chaperone 분자이다32).
	소포체란 무엇인가?	소포체 (endoplasmic reticulum, ER)는 진핵세포에서 단백질의 성숙, 단백질의 분비 및 지질 대사에 있어 핵심적인 기능을 담당하는 세포 내 소기관으로 소포체 항상성의 파괴는 다양한 인체 질환의 발생과 밀접한 연관이 있다1) . 소포체 내 Ca2+ 또는 ATP의 고갈, 지단백질과 바이러스 유래 단백질의 과잉 생성, 불완전한 접힘과 수식을 가진 비정상 단백질들의 축적, proteasome 매개 단백질 분해 반응의 교란 등은 unfolded protein response (UPR)로써 소포체 스트레스를 유발한다.
	까마귀쪽나무의 국내 분포 지역과 다른 명칭은 무엇인가?	) Juss.)는 녹나무과 (Lauraceae) 까마귀쪽나무속의 상록 소교목으로 우리나라의 제주도를 포함한 남부지역에 자생하고 가마귀쪽나무 혹은 구럼비나무로 불리운다. 특히 까마귀쪽나무의 열매는 핵과로 타원형이며 8-9월 말경에 검은 자주색으로 익으며 식용이 가능하다고 보고되었으나,《神農本草經》,《中藥大辭典》,《鄕藥集成方》,《本草綱目》에 수재된 약용소재는 아니다.

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