[국내논문]백삼 및 홍삼 추출물의 사상체질별 면역세포 활성효과 Effect of White and Red Ginseng Extracts on the Immunological Activities in Lymphocytes Isolated from Sasang Constitution Blood Cells원문보기
각 체질별(태음인, 소양인, 소음인)로 5명씩 혈액을 채취하여 임파구를 분리한 후 백삼 및 홍삼 에탄을 추출물을 투여하여 면역효능(proliferation, NO생성 및 TNF-$\alpha$의 분비능)을 측정한 결과, 한방에서 음인을 보하는 약재로 알려진 백삼의 경우 소음인 군의 임파구에서 가장 높은 임파구 증식능, NO 생성 및 TNF-$\alpha$의 분비능을 나타냈으나, 소양인군에서는 가장 낮은 면역활성을 나타내었다(P<0.05). 그러나 홍삼 추출물의 경우 각 체질군에서 면역활성의 차이가 없이 유사한 것으로 나타났다(P > 0.05). 또한, 체질별 임파구에 LPS처리한 대조군보다 백삼 및 홍삼 추출물을 첨가한 처리군에서 NO생성 및 TNF-$\alpha$의 분비능이 현저하게 높은 것으로 나타났다(P<0.05).백삼과 달리 홍삼 추출물에서 각 체질군에 면역활성의 차이가 없는 것은 인삼의 가공처리 과정에서 성분변화의 차이에 기인하는 것으로 사료된다. 따라서 본 연구 결과, 홍삼추출물로부터 체질에 영향을 미치지 않는 성분을 규명한다면 새로운 맞춤형 체질마커로 개발할 수 있으리라 사료된다.
각 체질별(태음인, 소양인, 소음인)로 5명씩 혈액을 채취하여 임파구를 분리한 후 백삼 및 홍삼 에탄을 추출물을 투여하여 면역효능(proliferation, NO생성 및 TNF-$\alpha$의 분비능)을 측정한 결과, 한방에서 음인을 보하는 약재로 알려진 백삼의 경우 소음인 군의 임파구에서 가장 높은 임파구 증식능, NO 생성 및 TNF-$\alpha$의 분비능을 나타냈으나, 소양인군에서는 가장 낮은 면역활성을 나타내었다(P<0.05). 그러나 홍삼 추출물의 경우 각 체질군에서 면역활성의 차이가 없이 유사한 것으로 나타났다(P > 0.05). 또한, 체질별 임파구에 LPS처리한 대조군보다 백삼 및 홍삼 추출물을 첨가한 처리군에서 NO생성 및 TNF-$\alpha$의 분비능이 현저하게 높은 것으로 나타났다(P<0.05).백삼과 달리 홍삼 추출물에서 각 체질군에 면역활성의 차이가 없는 것은 인삼의 가공처리 과정에서 성분변화의 차이에 기인하는 것으로 사료된다. 따라서 본 연구 결과, 홍삼추출물로부터 체질에 영향을 미치지 않는 성분을 규명한다면 새로운 맞춤형 체질마커로 개발할 수 있으리라 사료된다.
The effects of white ginseng and red ginseng ethanol extracts on the proliferation, nitric oxide (NO) production and tumor necrosis factor-$\alpha$ (TNF-$\alpha$) in human Band T lymphocytes isolated from blood cell of sasang constitution were examined in vitro. White ginseng e...
The effects of white ginseng and red ginseng ethanol extracts on the proliferation, nitric oxide (NO) production and tumor necrosis factor-$\alpha$ (TNF-$\alpha$) in human Band T lymphocytes isolated from blood cell of sasang constitution were examined in vitro. White ginseng extract known as medicine suitable for soeumin constitution showed the highest immune activities such as proliferation, NO production and TNF-$\alpha$ in soeumin constitution, and followed by taeeumin and soyangin, respectively (P<0.05). However, there were immunologically insignificant differences among sasang constitution lymphocytes treated by red ginseng ethanol extract. Both white and red ginseng ethanol extracts showed significantly higher immunological activities than LPS-induced sasang constitution lymphocytes on NO production and TNF-$\alpha$ release (P<0.05). The different immunological activities of white and red ginseng extracts in sasang constitution lymphocytes might be due to the component changes during the processing of ginseng. Thus, the findings of components suitable for all constitutions from red ginseng extract could be applied as a new constitution marker.
The effects of white ginseng and red ginseng ethanol extracts on the proliferation, nitric oxide (NO) production and tumor necrosis factor-$\alpha$ (TNF-$\alpha$) in human Band T lymphocytes isolated from blood cell of sasang constitution were examined in vitro. White ginseng extract known as medicine suitable for soeumin constitution showed the highest immune activities such as proliferation, NO production and TNF-$\alpha$ in soeumin constitution, and followed by taeeumin and soyangin, respectively (P<0.05). However, there were immunologically insignificant differences among sasang constitution lymphocytes treated by red ginseng ethanol extract. Both white and red ginseng ethanol extracts showed significantly higher immunological activities than LPS-induced sasang constitution lymphocytes on NO production and TNF-$\alpha$ release (P<0.05). The different immunological activities of white and red ginseng extracts in sasang constitution lymphocytes might be due to the component changes during the processing of ginseng. Thus, the findings of components suitable for all constitutions from red ginseng extract could be applied as a new constitution marker.
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문제 정의
따라서 본 연구는 사상체질의 藥性 분류 도구로서 사상개념을 중심으로 음인 약재인 백삼, 양인과 음인 공통 약재인 홍삼을 대상으로 각 체질별로 면역학적 방법으로 분석하였고 이에 대한 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.
지금까지 한의학에서는 사상체질이론에 따라 약제 처방 시 개인의 체질에 따른 처방을 하고 있으나 과학적인 증거가 매우 미약하였다. 따라서, 본 연구는 체질의 개념을 동양적인 관점에서 출발하여 인삼이 지니고 있는 면역학적 효능을 각기 다른 체질에서 어떠한 차이가 나는가를 과학적으로 규명하기 위하여 수행되었다. Fig.
제안 방법
K대학교 바이오산업공학부 재학생 중 질병이 없고 건강한 체질 감별 희망자 77명(남학생 35명, 여학생 42명)을 선정하였으며, 사상체질 전문한의사로부터 설문지법과 형태학적 분류에 의한 두 방법을 사용하여 체질을 분류하였다. 두 방법 모두 공통으로 나타나는 각 체질군(태음인, 소양인, 소음인)을 5명씩 선정하여 K대학교 의대병원 임상병리과 전문가의 지원을 받아 선별된 지원자들을 대상으로 혈액을 각 50 ml씩 채취하여 즉시 아이스박스에 넣은 후 30분 이내에 본 실험실로 운반 하여 즉시 실험에 사용하였다.
의한 두 방법을 사용하여 체질을 분류하였다. 두 방법 모두 공통으로 나타나는 각 체질군(태음인, 소양인, 소음인)을 5명씩 선정하여 K대학교 의대병원 임상병리과 전문가의 지원을 받아 선별된 지원자들을 대상으로 혈액을 각 50 ml씩 채취하여 즉시 아이스박스에 넣은 후 30분 이내에 본 실험실로 운반 하여 즉시 실험에 사용하였다.
백삼 및 홍삼의 추출은 flask 내 백삼 및 홍삼원료를 200 g씩 넣고 시료 중량 10배량에 해당하는 70% ethyl alcohol (에탄올)을 2L씩 가하여 25 수욕 상에서 24시간 2회 반복 추출한 후 감압여과장치로 여과하였다. 여액을 rotary vacuum evaporator(Eyela N-N-series, Japan)롤 사용하여 농축한 후, 동결 건조하여 4oC 냉장고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
태음인, 소양인, 소음인 각각 5명으로부터 채취한 50 ml의 혈액을 두 개의 50ml-conical tube에 나눈 후, 동량의 DPBS(Mg2+, Ca2+ without, Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, CAMBREX) 25 ml씩 넣어 잘 섞이도록 혼합하였다. 다시 2개의 50 ml-conical tube에 나눈 후 혈액과 DPBS 혼합층이 ficoll 층 위에 있을 수 있도록 ficoll-paque(Amersham Biosciences)를 conical tube 아래로 조심스럽게 넣어준 후, 53 xg로 15분간 원심 분리하여 lymphocyte와 monocyte 층을 얻었다.
다시 2개의 50 ml-conical tube에 나눈 후 혈액과 DPBS 혼합층이 ficoll 층 위에 있을 수 있도록 ficoll-paque(Amersham Biosciences)를 conical tube 아래로 조심스럽게 넣어준 후, 53 xg로 15분간 원심 분리하여 lymphocyte와 monocyte 층을 얻었다. 이 세포들을 각각 DPBS로 3회 세척, 원심 분리하여 pure pellet을 얻은 후 RPMI 1640 배지와 혼합하여 cell culture dish에 분주한 다음, 약 1시간 동안 배양(37oC, CO2 5.0%)하였다. 1시간 배양 후, lymphocyte를 분리하여 RPMI 1640 배지로 3회 세척하여 모아 따로 배양하고 monocyte는 macrophage를 활성화시키는 GM-CSF 10μl를첨가하여 배양한 후, proliferation, nitric oxide(NO) 생성능, tumor necrosis factor-α(TNF-α) 분비능을 실험하였다.
0%)하였다. 1시간 배양 후, lymphocyte를 분리하여 RPMI 1640 배지로 3회 세척하여 모아 따로 배양하고 monocyte는 macrophage를 활성화시키는 GM-CSF 10μl를첨가하여 배양한 후, proliferation, nitric oxide(NO) 생성능, tumor necrosis factor-α(TNF-α) 분비능을 실험하였다. Proliferation(세포 증식능)을 측정은 음성 대조군(체질별 면역세포에 RPMI 1640 배지만 사용), 양성 대조군(음성 대조군에 B세포의 mitogen인 lipopolysaccharide (LPS)나 T세포의 mitogen 인 concanavalin A(con A)를 첨가) 및 처리군(양성대조군에 백삼 및 홍삼 에탄올 추출물을 500 μg/ml씩 첨가)을 사용하였으며, NO 생성능과 TNF-α 분비능 측정은 체질별 면역세포에 LPS를 첨가한 대조군과 대조군에 백삼 및 홍삼 에탄올 추출물을 500 μg/ml씩 첨가한 처리군을 각각 사용하였다.
1시간 배양 후, lymphocyte를 분리하여 RPMI 1640 배지로 3회 세척하여 모아 따로 배양하고 monocyte는 macrophage를 활성화시키는 GM-CSF 10μl를첨가하여 배양한 후, proliferation, nitric oxide(NO) 생성능, tumor necrosis factor-α(TNF-α) 분비능을 실험하였다. Proliferation(세포 증식능)을 측정은 음성 대조군(체질별 면역세포에 RPMI 1640 배지만 사용), 양성 대조군(음성 대조군에 B세포의 mitogen인 lipopolysaccharide (LPS)나 T세포의 mitogen 인 concanavalin A(con A)를 첨가) 및 처리군(양성대조군에 백삼 및 홍삼 에탄올 추출물을 500 μg/ml씩 첨가)을 사용하였으며, NO 생성능과 TNF-α 분비능 측정은 체질별 면역세포에 LPS를 첨가한 대조군과 대조군에 백삼 및 홍삼 에탄올 추출물을 500 μg/ml씩 첨가한 처리군을 각각 사용하였다.
제거하였다. 백삼 및 홍삼 에탄올 추출물을 각각 500 μg/ml 조제하여 각 well에 20 μ씩 주입하였고, LPS를 2 μg/ml 넣고 24시간 동안 배양 하였으며(37oC, CO2 5.0%), 배양한 후에 생성된 NO양은 96 well plate에 배양액 100 μl와 100 μ의 Griess 시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid : 1% N- naphthylamine-2HCl in water = 1:1 (v/v))을 혼합하여 실온에서 반응시킨 후 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
대식세포에서의 약물 처리 농도 및 시간 경과에 따른 항암 활성과 관련된 TNF-α의 분비능의 변화를 관찰하기 위해 각 체질 군에 대하여 백삼 및 홍삼 에탄올 추출물을 500 μg/ml씩 대식세포 배양액(5 x 106 cells/ml)에 각각 처리하여 일정 시간 경과 후 TNF-α의 분비능의 변화를 측정하였다. TNF-α의 측정은 ELISA kit (Human Biotrak ELISA System, Amersham Biosciences)를 사용하여 수행하였다.
데이터처리
모든 실험값은 SPSS(statistical package for the social science) 12.0 package program을 이용하여 각 처리구의 평균과 표준편차를 산출하고 Duncan 및 Tukey법을 이용하여각 처리구간의 유의차를 5% (p < 0.05) 유의 수준에서 검증하였다.
이론/모형
실험에 사용한 MTT법은 Mosmann15)이 개발하여 Kotnik 등16)이 변형시킨 방법으로, 96-well plate의 각 well에 태음인 군, 소양인군, 소음인군 각 5명의 임파구 부유액 100 μl (5 x 106 cells/ml)가 되도록 조제 하여 분주한 후, B세포 mitogen인 LPS와 T세포 mitogen인 con A를 각각 5 μg/ml 와 15 μg/ml를 분주하였으며 처리구인 백삼 및 홍삼 에탄올 추출물은 500 μg/ml씩 첨가하여 37oC, CO2 5.0%의 조건에서 44시간 배양한 후, MTT assay를 실시하였다. 배양 후 MTT 용액 10 μl 가하고 알루미늄 호일로 빛을 차단한 상태에서 4시간 동안 다시 배양한 후 formazan crystal 형성을 유도하였다.
후 TNF-α의 분비능의 변화를 측정하였다. TNF-α의 측정은 ELISA kit (Human Biotrak ELISA System, Amersham Biosciences)를 사용하여 수행하였다. Kit에서 제공된 ELISA 희석용액 50 μl를 96-well plate에 분주한 후, 배양액 시료 또는 Kit에서 제공된 표준 용액을 각각 50 μl씩 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다.
성능/효과
1A에 나타내었다. 백삼 에탄올 추출물의 각 체질별 임파구 증식능은 LPS를 첨가한 양성 대조군에 비해 백삼 추출물을 첨가한 처리구에서 각 체질군별로 임파구 증식 능이 현저하게 상승하는 결과를 보여 백삼 추출물이 임파구증식 능에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다(P < 0.05). 특히, 음인 약재로 알려진 백삼의 경우18) 소음인군에서 가장 높은 임파구 증식능을 나타내었으며 태음인이 다음이고 소양인에서 가장 낮은 활성을 나타내었다.
특히, 음인 약재로 알려진 백삼의 경우18) 소음인군에서 가장 높은 임파구 증식능을 나타내었으며 태음인이 다음이고 소양인에서 가장 낮은 활성을 나타내었다. 반면에 홍삼 에탄올 추출물을 투여한 처리군 에서는 체질군에 상관없이 모두 비슷한 활성을 나타내었으며 양성대조군에 비하여 비슷하거나 약간 높은 임파구 증식능을 보였다. 이와 같은 결과는 T세포에서도 비슷하게 나타났다 (Fig.
1B). Con A를 첨가한 양성 대조군에 비해 백삼 에탄올 추출물을 첨가한 처리군에서 각 체질 군별로 임파구 증식능이 훨씬 상승하였고 소음인에서 가장 높은 임파구 증식능을 나타냈으며, 태음인 및 소양인 순으로 나타났다 (P<0.05). 반면에, 홍삼 에탄올 추출물 처리군에서는 체질 군에 상관없이 거의 비슷한 임파구 증식능을 나타내었다.
2에 나타내었다. 백삼 에탄올 추출물의 각 체질별 NO 생성능은 LPS를 첨가한 대조군에 비해 백삼에탄올 추출물을 첨가한 처리군에서 음인(소음인, 태음인) 체질 군 에서는 현저하게 높은 NO 분비능을 나타냈으나 소양인에서는 비슷하게 나타났다(P < 0.05). 반면, 홍삼 에탄올 추출물 처리군에서는 LPS 대조군보다는 통계적으로 유의하게 NO 분비능이 증가하였으나 각 체질군 에는 차이가 거의 없는 것으로 나타났다.
05). 반면, 홍삼 에탄올 추출물 처리군에서는 LPS 대조군보다는 통계적으로 유의하게 NO 분비능이 증가하였으나 각 체질군 에는 차이가 거의 없는 것으로 나타났다. 지금까지 인삼사포닌 또는 사포닌의 활성 성분인 ginsenoside들은 NO생성을 증가시킴으로써 중추신경계 기능, 면역기능, 심혈관계기능, 항산화작용 및 장기보호 효과를 나타내었다.
3에 나타내었다. LPS 대조군에 비하여 백삼 에탄올 추출물 처리군은 소음인에서 현저하게 높은 TNF-α 분비능을 나타냈으며, 태음인 및 소양인 순으로 나타났다(P < 0.05). 반면, 홍삼 에탄올 추출물처리 군에서는 모든 체질군 에서 유의적인 차이가 없었으나 LPS 대조군보다는 현저하게 높은 TNF-α 분비능을 나타내었다(P<0.
05). 반면, 홍삼 에탄올 추출물처리 군에서는 모든 체질군 에서 유의적인 차이가 없었으나 LPS 대조군보다는 현저하게 높은 TNF-α 분비능을 나타내었다(P<0.05). 뇌세포를 구성하고 있는 교세포(glial cell) 는중추신경계세포 활성물질을 생성하는 세포로 대식세포를 활성화시키는 물질인 LPS등의 자극에 의하여 TNF-α, Ⅱ.
후속연구
18) 그러나 인삼을 포함한 모든 천연물에 대한 생리활성연구는 대부분 동물세포나 동물을 중심으로 수행되었으며 사람의 체질을 기준으로 분석한 연구는 전 세계에서 전무하다. 따라서, 본 연구에서 얻은 결과는 과학적으로 매우 커다란 의미가 있으며 향후 질병예방의학으로서 새로운 연구방향을 제시할 수 있는 시도라고 사료된다.
19) 그러나 본 연구에서는 동일한 원료로부터 백삼과 홍삼을 제조하여 체질별 효능분석을 한 것이 아니라 시중에서 구입하여 사용하였기 때문에 이러한 체질별 면역활성의 차이가 제조가공 중 성분 변화에 의한 것인지를 규명하는 것이 쉽지 않다. 따라서, 동일한 원료로부터 제조가공방법을 이용하여 백삼과 홍삼을 제조한 후 각 추출물의 성분으로부터 체질에 영향을 미치는 성분과 미치지 않는 성분을 밝혀낸다면 인삼의 식품 성분을 새로운 맞춤형 체질마커로 개발할 수 있을 것으로 사료된다.
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