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백삼, 홍삼, 흑삼 추출물의 생리활성 비교 연구
The comparative study on physiological activity of White ginseng, Red ginseng and Black ginseng extract 원문보기

디지털융복합연구 = Journal of digital convergence, v.14 no.5, 2016년, pp.459 - 471  

장아영 (중부대학교 한방건강관리학과) ,  승윤철 (중부대학교 한방건강관리학과) ,  지중구 (중부대학교 한방건강관리학과)

초록
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이 연구에서는 백삼(WG), 홍삼(RG) 흑삼(BG) 추출물의 효능차이를 비교하고자 항산화 및 항염 활성을 측정하였다. 세포독성 측정 결과 WG, RG, BG 모두 95% 이상의 세포 생존율을 나타내었고, 페놀함량, DPPH, ABTS 라디컬 소거능, ROS 생성량을 조사한 결과 WG와 RG에 비해 BG가 높은 항산화 활성을 보였다. NO생성 저해활성은 RG가, $PGE_2$생성 저해활성은 WG가 높았다. 염증성 사이토카인 생성량 감소에 미치는 영향을 측정한 결과, IL-$1{\beta}$ 생성량의 경우, WG와 RG가, IL-6 생성량의 경우 BG가 가장 큰 것으로 확인하였다. TNF-${\alpha}$ 생성량은 WG, RG, BG 모두 대조군과 비교하여 차이가 없었다. 이상의 분석 자료가 건강기능 식품과 기능성 화장품 원료 개발 등 전 임상단계의 기초적 자료로 가치가 있을 것으로 판단된다.

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

This study presents a comparative study for differences in efficacy and ingredient of white ginseng(WG), red ginseng(RG), and black ginseng(BG) using anti-oxidative activity test and anti-inflammatory activity test. In the results of cytotoxicity test for WG, RG, and BG, the survival rate of all cel...

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

  • 7 세포를 2×105 cells/well이 되도록 분주한 후 24시간 배양한 후 새로운 배양액으로 바꾸었다. 1, 10, 100(㎍/㎖)의 농도 WG, RG, BG 추출물을 처리하고, 1㎍/㎖의 농도의 LPS를 처리한 후 24시간 동안 세포 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 원심분리 후 상청액으로 IL-1β, IL-6, TNF-α는 Luminex를 이용하여 측정하였다.
  • 7 세포를 분주하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 배양액을 새롭게 교체하였고 1, 10, 100(㎍/㎖) 농도의 WG, RG, BG 추출물과 1㎍/㎖ 농도의 LPS를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. N1 buffer 50㎕를 각 well에 처리하고 10분 동안 상온에서 반응시켰다.
  • NO의 농도는 배양액 내의 nitric oxide 농도를 griess reagent system을 이용하여 측정하였다. 96 well plate에 1.
  • PGE2 측정은 PGE2 ELASA Kit를 이용하여 PGE2 표준시료 (standard) 0, 39, 78, 156, 312, 625, 1250, 2500pg/㎖의 농도를 이용하였다. 준비된 표준시료와 WG, RG, BG 추출물을 96 well plate에 150μl씩 분주하고, PGE2 mouse monoclonal antibody를 50㎕씩 첨가하여 상온에서 1시간 반응하였다.
  • WG, RG, BG 추출물을 최종 농도가 1, 10, 100, 1,000(㎍/㎖)의 농도가 되도록 희석시켰으며, ABTS 용액은 7.4mM ABTS(2,2–azino–bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))와 2.6mM potassium persulphate를 제조한 후, 암소에 하루 동안 방치하여 양이온 (ABTS·+)을 형성시킨 다음 734㎚에서 흡광도를 측정하여 ABTS·+ 용액의 흡광도 값이 1.5 이하가 나오도록 희석하였다.
  • WG, RG, BG 추출물의 phenol 함량은 Gutfinger의 방법[4]을 응용하여 측정하였다. 50% Foiln-Ciocalteu's phenol reagent 0.
  • WG, RG, BG 추출물의 최종 농도가 1, 10, 100, 1,000(㎍/㎖)의 농도가 되도록 희석시켰으며, 에탄올에 용해시킨 0.2mM의 DPPH 용액 150㎕와 WG, RG, BG 추출물 을 각각 100㎕씩 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 517㎚에서 흡광도를 측정하였다.
  • 5㎖ 증류수를 차례로 혼합한 뒤 30분 동안 정치한 다음 10분간 원심분리(12,000rpm)한 후 상청액을 취해 흡광도를 760nm에서 측정하였다. gallic acid를 표준물질로 하여 작성한 검량선에 따라 총 phenol 함량을 구하였으며 측정단위로는 GAE (Gallic acid equivalent)/g을 사용하였다.
  • 따라서 본 연구에서는 백삼, 홍삼 및 흑삼 추출물에 대하여 세포독성, 항산화 효과 및 항염증 효과 측정을 통하여 원료별 차이점을 비교하였다.
  • 7 세포는 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10㎕의 WST solution을 처리하여 세포배양기에서 30℃ 조건으로 30분간 반응시킨 후 450㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
  • 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였으며, WG, RG, BG 추출물을 1, 10, 100(㎍/㎖)의 농도로 처리하고, LPS 1㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
  • 1시간 반응 후, PGE2 conjugate 50㎕를 첨가하여 상온에서 2시간 반응하였다. 세척완충제(Wash buffer) 400㎕를 이용하여 세척 후, substrate solution 200㎕를 첨가하여 빛을 차단하고 30분 반응하여, stop solution 50㎕를 첨가하여 ELISA reader기 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.
  • 계대배양은 5회 이상, 시료 처 리 전 24시간을 적응시켰다. 세포 내 ROS 측정과, 항염 증 효능 측정 실험은 정상군(normal group), 대조군 (control group), 실험군으로 나누어 실험하였다, 대조군은 실험 목적에 따라 세포 내 활성산소나 염증을 유발시켰으며, 정상군은 대조군에서 증상이 유발되었는지 비교하기 위해 아무런 처치를 하지 않았다. 실험군은 실험시료를 농도별로 처리한 후 대조군과의 비교를 통해 효능을 평가하였다.
  • 세포 내 ROS 측정과, 항염 증 효능 측정 실험은 정상군(normal group), 대조군 (control group), 실험군으로 나누어 실험하였다, 대조군은 실험 목적에 따라 세포 내 활성산소나 염증을 유발시켰으며, 정상군은 대조군에서 증상이 유발되었는지 비교하기 위해 아무런 처치를 하지 않았다. 실험군은 실험시료를 농도별로 처리한 후 대조군과의 비교를 통해 효능을 평가하였다.
  • 5×105cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 실험하기 전에 새로운 배양액으로 교체하였고, WG, RG, BG 추출물을 1, 10, 100(㎍/㎖)의 농도로 처리하여 RAW 264.7 세포는 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10㎕의 WST solution을 처리하여 세포배양기에서 30℃ 조건으로 30분간 반응시킨 후 450㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
  • 배양 후, 5분간 원심 분리(1,200rpm)하여 모 은 세포를 PBS로 2회 세척한 후, DCF-DA은 10µM이 되도록 처리하여 15분간 상온, 암소에 두었다. 염색 후 PBS를 넣어 5분간 원심분리(1,200rpm)한 후 상등액을 제거하고 다시 PBS 400㎕를 부유시켜 유세포 분석기(Flow cytometer, Becton Dickinson, Co., U.S.A)를 이용 하여 형광강도의 세기에 따른 변화를 조사하였다.
  • 원심분리 후 상청액으로 IL-1β, IL-6, TNF-α는 Luminex를 이용하여 측정하였다.
  • 이후 N2 buffer 50㎕를 각 well에 처리한 후 10분 동안 반응시켰다. 이후 540㎚에서 흡광도를 측정한 후 Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.
  • 준비된 표준시료와 WG, RG, BG 추출물을 96 well plate에 150μl씩 분주하고, PGE2 mouse monoclonal antibody를 50㎕씩 첨가하여 상온에서 1시간 반응하였다.
  • 5 이하가 나오도록 희석하였다. 희석된 ABTS·+ 용액 150㎕와 WG, RG, BG 추출물을 각각 5㎕ 혼합하고, 실온에서 10분간 방치한 후, 734㎚에서 흡광도를 측정하였다.

대상 데이터

  • 본 실험에 사용된 기기는 감압증류장치(rotary vacuum evaporator), (Büchi B-480 Co., Switzerland), 동결건조기(freeze dryer, EYELA FDU-540 Co., Japan), CO2 incubator 배양기(Forma scientific Co., U.S.A.), clean bench (Vision scientific Co., Korea), autoclave (Sanyo Co., Japan), vortex mixer (Vision scientific Co., Korea), spectrophotometer (Shimadizu Co., Japan), centrifuge (Sigma Co., U.S.A.), deep-freezer (Sanyo Co., Japan), thermocycler system (MWG Biotech Co., Germany), ice-maker (Vision scientific Co., Korea), plate shaker (Lab-Line Co., U.S.A.), ELISA reader (Molecular Devices Co., U.S.A.), 유세포 분석기 (Flow cytometer, Becton Dickinson, Co., U.S.A.), HPLC (Shimadzu, Co., Japan), 환류 추출기(Mtops, Korea), 가열교반기(DAIHAN scientific Co., Korea) 등을 사용하였다.
  • 본 실험에 사용한 백삼(White ginseng, 이하 WG), 홍삼(Red ginseng, 이하 RG), 흑삼 (Black ginseng, 이하 BG)은 4년근으로써 금산지역의 약재시장에서 구입하였다. WG, RG, BG 각 30g에 물 500㎖을 넣고 10시간 동안 환류 추출 후 여과액을 얻었으며, 얻어진 여과액을 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하였다.
  • 실험에 사용된 RAW 264.7 세포(한국세포주 은행 Seoul, Korea))를 50㎖ 튜브에 옮기고 PBS 9㎖을 넣어 세포를 부유시킨 뒤 5분 동안 원심분리(1,200rpm)하여 상청액을 제거하였다. 세포가 있는 튜브에 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin으로 조성된 DMEM 배지 1㎖을 넣고 부유시켰다.

데이터처리

  • 실험 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's T-test 및 ANOVA를 사용하여 통계처리 하였으며 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.

이론/모형

  • Each cell was treated with 1, 10 and 100(㎍/㎖) of various extracts for 24hr. Cytotoxicity was measured using an MTT assay. the nomal means cell viability without treatment of ginseng extract.
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질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
인삼을 크게 백삼, 홍삼, 흑삼 등으로 구분짓는 기준은 무엇인가? 인삼은 크게 자연 상태의 수삼과 가공방법에 따라 백삼, 홍삼, 흑삼 등으로 분류되고, 백삼은 말린 형태에 따라 직삼, 곡삼, 반곡삼 등으로 구분하는데, 인삼을 열풍이나 햇볕 등 기타의 방법으로 말린 인삼을 뜻하며, 홍삼은 천삼, 지삼 및 양삼으로 구분되며, 생인삼 즉 수삼을 껍질을 유지한 상태로 증기 및 기타의 방법으로 찐 후 말린 인삼을 뜻한다. 또한, 흑삼은 2011년 12월 ⌜인삼산업법 ⌟에 의해 수삼을 증기로 쪄서 말리는 과정을 3회 이상 반복함에 따라 담흑갈색 또는 흑다갈색을 띠는 인삼을 말하며 일반적으로 삼을 아홉 번 찌고 말리는 과정을 반복하며 ‘구증구포’라는 한약의 전통적 가공법으로 제조한 인삼으로 알려져 있다.
인삼의 열처리 과정 중 유효성분의 종류와 함량이 달라지는 데, 백삼이나 홍삼에는 존재하지 않거나 소량 함유되어 있지만 흑삼에 다량 발견되는 성분은 무엇인가? 또한 열처리 과정 중 일부 성분이 화학적 변성을 거쳐 수삼이나 백삼에 존재하지 않는 새로운 유효 성분이 생성되고 증숙 정도에 따라 이러한 유효성분의 종류와 함량이 달라진다고 보고되었다[2]. 백삼이나 홍삼에는 존재하지 않거나 소량 함유되어 있는 ginsenoside Rg3, Rg5, Rh1, Rh2, 등의 성분들이 흑삼에는 다량 발견됨을 보고되어[3]. 가공 인삼의 종류별로 목적에 따라 활용법이 다를 것으로 생각된다.
인삼이란 무엇인가? A. Meyer, 人蔘)은 오가피과(Araliaceae) 파낙스(Panax)속에 속하는 다년생 초본으 로 뿌리뿐 아니라 잎, 줄기를 수천 년 전부터 약용해 온 우리나라의 대표적인 약용작물이다.
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참고문헌 (19)

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