선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구는 Kaempferol이 함유되어 있는 연수의 ethyl acetate 추출물과 Kaempferol의 생리활성(항산화 작용과 항암작용)과 그 기전을 명확히 밝히기 위하여 전자공여능, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유사활성 및 지질과산화능을 측정하여 항산화 효과를 측정하여 비타민 E의 항산화능과 비교하였으며 별아교종세포에 대한 항암효과를 측정하였다.
제안 방법
- Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물의 항암효과를 측정하고 비교하기 위하여 원광대학교 의과대학 해부학교실에서 분양받은 별아교종세포(C6 glioma)는 MEM배지에 10% fetal bovine serum, penicillin (25 unit/㎖) 및 fungizone을 첨가하여 사용하였다. 세포의 배양은 온도 37℃, 습도 95%, 탄산가스 농도 5%의 배양기를 사용하였다.
- Mosmann의 방법24)에 의하여, 별아교종세포(C6 glioma)를 각 배양용기에 5×104 cells/mL 세포수를 넣고 24시간 배양 후 연수 추출물인 ethyl acetate 추출물과 Kaempferol의 세포독성을 측정하기 위하여 위 시료를 각각 농도별로 첨가하여 48시간 배양한 후 분석 당일 조제한 MTT 50 ㎍/mL가 포함된 배양액을 배양 용기당 1 mL씩 넣고 3시간 배양 후 배양액을 버리고, dimethylsulfoxide (DMSO)를 2 mL/well씩 넣어 5분간 실온 방치하여 MTT formazan을 용해한 후, 흡광도는 540 nm에서 분광광도계 ELISA reader로 MTT의 흡광도를 측정하여 대조군과 비교 조사하였다.
- 1 mL)을 가한 다음, 실온에서 3분간 반응시킨 후 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료대신 증류수를 가하여 측정하였으며, 대조구의 흡광도가 최고치를 나타낼 때까지 24시간 단위로 흡광도를 측정하였다.
- 또한 비타민 E는 비타민 C와 함께 chlorpyrifos-ethyl (CE)에 의하여 증가하는 지질과산화를 감소시킬 수 있다고 보고되었다31). 따라서, 본 연구에서는 비타민 E의 이러한 효과 때문에 Kaempferol과 연수의 ethyl acetate의 항산화효과에 대한 비교 대조군으로 선정하였다.
- 실험을 위하여 일차 배양한 flask의 세포를 0.25% trypsin-EDTA로 처리하여 세포를 분리한 후, Turk형 혈구계산기를 이용하여 세포수가 5×104 cells/㎖가 되도록 세포부유액을 만들었다.
- 연수 추출물과 Kaempferol의 IC50 결정은 배양 중인 별아교종세포(C6 glioma)를 각 배양용기당 5×104 cells/mL씩 넣고 24시간 배양 후 1, 25, 50, 75, 100 μM의 연수 추출물과 Kaempferol를 첨가하여 48시간 배양한 후 MTT 정량을 하여 이들 각각에 대한 50% 억제농도인 IC50을 회귀방정식에 의해 구하였다.
- 연수 추출물과 Keampferol의 항산화능과 항암효과를 확인할 목적으로 항산화능은 전자공여능을 확인할 수 있는 DPPH 라디칼 소거능, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제를 확인 할 수 있는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 유사활성 및 지질과산화능으로 측정하였다. 항암효과는 MTT 흡광도를 측정하여 세포독성을 산정하였으며, 그 결과는 다음과 같다.
- 슈퍼옥사이드 디스뮤타제는 30 KDa 이상의 분자량을 가진 단백질로 체내에 흡수되지 않고 체외로 배출되며 열과 pH에 불안정하므로 이러한 단점을 보완할 수 있는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유사활성물질을 찾는 연구가 활발히 진행되고 있다. 연수에서 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유사활성물질을 찾기 위하여 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 유사활성을 측정하였다. 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 유사활성은 농도 의존적으로 증가하였고 증가비율은 비례하였으며 100 uM에서의 증가비율은 Kaempferol > 비타민 E > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다.
- 지질의 산화에 의하여 생성된 hydroperoxide가 촉 매력이 강한 전이 금속들에 의하여 분해되어서 생성되는 alkoxy radicals (RO), peroxy radicals (ROO), hydroxy radicals (OH) 및 malondialdehyde 및 4-hydroxynonenal 등은 간접적으로 단백질과 DNA의 손상을 일으킬 뿐만 아니라 노화와 암 발생의 중요한 인자가 되기도 한다. 이 원리를 이용하여 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물의 지질과산화를 측정하여 비교하였다. 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물은 시간이 경과함에 따라 대조군의 지질과산화의 증가에 반하여 지질과산화가 감소하였다.
- ethyl acetate를 이용한 추출물의 생리활성은 비교적 다른 용매제에 의한 추출물보다 생리활성이 좋은 것으로 보고되었다33). 이에 본 연구에서는 연수의 ethyl acetate 추출물을 선정하여 항산화작용과 항암작용을 측정하여 비타민 E와 Kaempferol의 효과와 비교하였다.
- 전자공여능은 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 50% 감소시켜는데 필요한 시료의 양을 IC50으로 하여 나타내었으며 100-[(시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)×100]으로 표시하였다.
- 연수 추출물과 Keampferol의 항산화능과 항암효과를 확인할 목적으로 항산화능은 전자공여능을 확인할 수 있는 DPPH 라디칼 소거능, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제를 확인 할 수 있는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 유사활성 및 지질과산화능으로 측정하였다. 항암효과는 MTT 흡광도를 측정하여 세포독성을 산정하였으며, 그 결과는 다음과 같다.
대상 데이터
- 본 실험 재료인 연수(Fig. 2)는 전주시 덕진구 전미동에서 재배한 연꽃의 일부이다. 연꽃의 연수를 23.
- 세포배양에 사용한 minimum essential medium (MEM)과 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) 및 fetal bovine serum, penicillin, streptomycin, fungizone 시약은 Gibco (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였고, 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 정량에 사용한 시약은 Sigma (ST. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- 세포의 배양은 CO2 incubator (Vision scientific Co., Bucheon, Korea)를 사용하였으며, 세포수의 계산은 Turk형 혈구계산기(Marienfeld Co., Mergentheim, Germany)를 이용하였다. MTT 정량에는 ELISA reader(Spectra max 250, Molecular Devices, Sunnyvale, USA)를 사용하였다.
- glioma)는 MEM배지에 10% fetal bovine serum, penicillin (25 unit/㎖) 및 fungizone을 첨가하여 사용하였다. 세포의 배양은 온도 37℃, 습도 95%, 탄산가스 농도 5%의 배양기를 사용하였다. 실험을 위하여 일차 배양한 flask의 세포를 0.
- 7%)을 얻었다. 이 중 ethyl acetate 추출물만 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과의 통계처리는 Students' t-test를 시행하였고 p-value가 0.05미만 일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- Marklund와 Marklund의 방법에22)에 따라 각 농도별 시료(0.2 mL)에 Tris-HCI buffer (50 mM tris [hydroxymethyl]amino-methane containing 10 mMM EDTA, pH 8.5, 3 mL)와 10 mM pyrogallol (0.2 mL)을 가하고 25℃에서 10분간 방치하였으며, 1 N HCl (1 mL)로 반응을 정지시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 유사활성은 100-[(시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)×100]으로 나타내었다.
- 전자공여능(electron donating ability)은 Blosis 방법21)에 의한 DPPH free radical 소거법으로 측정되었다. 즉 시료는 메탄올에 녹여 준비하고 메탄올에 녹인 0.
- 지질과산화는 Kikuzaki와 Nakatani의 방법23)에 따라 측정되었다. 즉 시료(3.
성능/효과
- 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물은 Table 1에서 보는 바와 같이 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능을 증가시켰고 DPPH 라디칼 소거능의 증가속도가 거의 비례하였으며 DPPH 라디칼 소거능은 비타민 E > Kaempferol > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다. 1 uM 농도에서 DPPH 라디칼 소거능을 기준으로 대조군 100%에 이르는 유의성을 검정한 결과 비타민 E, Kaempferol은 25 uM농도에서 유의한 차이가 있었으며, 연수의 ethyl acetate 추출물은 50 uM농도에서 유의한 차이가 있었다.
- 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 유사활성은 농도 의존적으로 증가하였고 증가비율은 비례하였으며 100 uM에서의 증가비율은 Kaempferol > 비타민 E > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다. 1 uM 농도의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유사활성을 기준으로 유의성을 검정한 결과 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물 모두에서 유의한 차이가 있었다(Table 2, Fig. 5).
- 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유사활성을 측정한 결과 유사활성은 농도 의존적으로 증가하였고 증가비율은 농도에 비례하였으며 100 uM에서의 증가비율은 Kaempferol >비타민 E > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다. 1 uM농도의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유사활성을 기준으로 유의성을 검정한 결과 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물 모두에서 25 uM에서 유의한 차이가 있었다.
- 1. 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물은 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능을 증가시켰고, DPPH 라디칼 소거능의 증가속도는 비례하였으며, DPPH 라디칼 소거능은 비타민 E > Kaempferol > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다.
- 2. 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 유사활성은 농도 의존적으로 증가하였고, 증가비율은 비례하였으며, 100 uM에서의 증가비율은 Kaempferol > 비타민 E > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다.
- 3. 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물은 시간이 경과함에 따라 대조군의 지질과산화의 증가에 반비례하여 지질과산화가 감소하였다. 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물의 지질과산화능은 24시간째에 각각 67%, 75% 및 67% 이었고, 96시간째에는 각각 98%, 98% 및 95% 이었으며 24시간째부터 각각 통계학적으로 유의한 차이가 있었다.
- 4. Kaempferol과 연수의 ethyl acetate 추출물은 별아 교종세포의 성장률을 농도 의존적으로 감소시켰으며, 100 uM 농도에서는 Kaempferol이 57%까지 ethyl acetate 추출물이 70%까지 감소시켰다. Kaempferol과 Ethyl acetate 추출물의 IC50농도는 각각 226.
- 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물은 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능을 증가시켰고, DPPH 라디칼 소거능의 증가속도는 비례하였으며, DPPH 라디칼 소거능은 비타민 E > Kaempferol > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다. DPPH 라디칼 소거능을 각각의 대조군과 비교한 결과 비타민 E, Kaempferol은 25 uM농도에서 통계학적으로 유의한 차이가 있었으며, 연수의 ethyl acetate 추출물은 50 uM 농도에서 통계학적으로 유의한 차이가 있었다.
- Kaempferol과 연수의 ethyl acetate 추출물을 별아 교종세포에 처리한 후 48시간째 MTT 흡광도를 측정하여 IC50농도를 산정한 결과 Kaempferol과 연수의 ethyl acetate 추출물은 IC50농도는 각각 226.5 uM과 268.6 uM 농도였다. 이 결과는 Borenfreund 등35)의 독성 판정 기준에 의하면 중간독성으로 판정할 수 있어 연수의 ethyl acetate 추출물은 우수한 항암효과가 있는 것으로 판정하였다.
- 은 화살나무 메탄올 추출물의 지질과산화의 관련한 항산화 효과를 검토하기 위하여 linoleic acid의 추출물을 첨가하여 40℃에서 96시간 동안 지질과산화물을 흡광도(500 nm)로 측정하였다. 그 결과 대조군은 24, 48, 96 시간 후 0.779, 0.789, 1.442로 흡광도가 측정되었고 0.2 mg/mL의 추출물을 첨가하였을 때에는 각각 0.244, 0.267, 0.291로 흡광도가 나타나 대조군에 비해 추출물 첨가구의 지질과산화수치가 각각 68.69%, 66.16%, 79.83%로 유의성 있게 감소되었고 비타민 E도 유사하였다고 보고하였다.
- 본 연구에서는 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물은 시간이 경과함에 따라 대조군의 지질과산화의 증가에 반하여 지질과산화가 감소하였다. 지질과산화의 시간경과에 따른 감소는 비타민 E ≥ Kaempferol > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다.
- 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물은 Table 1에서 보는 바와 같이 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능을 증가시켰고 DPPH 라디칼 소거능의 증가속도가 거의 비례하였으며 DPPH 라디칼 소거능은 비타민 E > Kaempferol > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다.
- 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물은 Table 1에서 보는 바와 같이 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능을 증가시켰고 DPPH 라디칼 소거능의 증가속도가 거의 비례하였으며 각각의 대조군과 비교한 결과 DPPH 라디칼 소거능은 비타민 E > Kaempferol > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다 (Table 1, Fig. 4).
- 이 원리를 이용하여 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물의 지질과산화를 측정하여 비교하였다. 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물은 시간이 경과함에 따라 대조군의 지질과산화의 증가에 반하여 지질과산화가 감소하였다. 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물의 지질과 산화능은 24시간째에 각각 67%, 75% 및 67%이었고 96시간째에는 각각 98%, 98% 및 95%이었으며 24시간째부터 각각 유의한 차이가 있었다 (Table 3, Fig.
- 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 비교한 결과 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물은 각각 2.672 uM, 3.754 uM 및 6.283 uM이었다. 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물은 Table 1에서 보는 바와 같이 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능을 증가시켰고 DPPH 라디칼 소거능의 증가속도가 거의 비례하였으며 DPPH 라디칼 소거능은 비타민 E > Kaempferol > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다.
- 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 유사활성은 농도 의존적으로 증가하였고 증가비율은 비례하였으며 100 uM에서의 증가비율은 Kaempferol > 비타민 E > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다.
- 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물은 시간이 경과함에 따라 대조군의 지질과산화의 증가에 반하여 지질과산화가 감소하였다. 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물의 지질과 산화능은 24시간째에 각각 67%, 75% 및 67%이었고 96시간째에는 각각 98%, 98% 및 95%이었으며 24시간째부터 각각 유의한 차이가 있었다 (Table 3, Fig. 6).
- 지질과산화의 시간경과에 따른 감소는 비타민 E ≥ Kaempferol > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다. 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물의 지질과산화능은 24시간째에 각각 67%, 75% 및 67% 이었고 96시간째에는 각각 98%, 98% 및 95% 이었으며 24시간째부터 각각 유의한 차이가 있었으므로, Kaempferol과 연수의 ethyl acetate 추출물은 우수한 지질과산화능이 있음을 관찰하였다. Gultekin 등31)도 비타민 E와 비타민 C는 Chlorpyrifosethyl에 의하여 증가하는 지질과산화를 감소시킬 수 있다고 보고하였다.
- 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물은 시간이 경과함에 따라 대조군의 지질과산화의 증가에 반비례하여 지질과산화가 감소하였다. 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물의 지질과산화능은 24시간째에 각각 67%, 75% 및 67% 이었고, 96시간째에는 각각 98%, 98% 및 95% 이었으며 24시간째부터 각각 통계학적으로 유의한 차이가 있었다.
- 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 유사활성은 농도 의존적으로 증가하였고, 증가비율은 비례하였으며, 100 uM에서의 증가비율은 Kaempferol > 비타민 E > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유사활성은 각각의 대조군과 비교한 결과 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물 모두에서 25 uM에서 통계학적으로 유의한 차이가 있었다.
- 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유사활성을 측정한 결과 유사활성은 농도 의존적으로 증가하였고 증가비율은 농도에 비례하였으며 100 uM에서의 증가비율은 Kaempferol >비타민 E > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다.
- 이상의 결과에서 연수의 ethyl acetate추출물은 우수한 항산화능과 항암효과가 있음을 알 수 있었다.
- 일반적으로 항산화능은 자유라디칼에 전자를 공여하여 산화를 억제하는 능력, 즉 DPPH의 전자공여능을 측정하는 방법이 이용된다. 지금까지 활성산소와 자유라디칼 생성을 억제하기 위하여 사용되고 있는 비타민 E와 연수 속에 다량 함유되어 있는 것으로 알려진 Kaempferol 및 ethyl acetate 연수 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 50% 환원시키는데 필요한 시료량 (RC50, 50 reduction concentration)으로 측정한 결과 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물은 각각 2.672 uM, 3.754 uM 및 6.283 uM이었다. 비타민 E, Kaempferol 및 연수의 ethyl acetate 추출물은 Table 1에서 보는 바와 같이 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능을 증가시켰고 DPPH 라디칼 소거능의 증가속도가 거의 비례하였으며 각각의 대조군과 비교한 결과 DPPH 라디칼 소거능은 비타민 E > Kaempferol > 연수의 ethyl acetate 추출물 순이었다 (Table 1, Fig.
- 수산기, 카르복실기 및 메톡시기가 결합된 페놀화합물과 플라보노이드는 암세포주에 대한 성장억제효과가 높은 것으로 보고되고 있다. 플라보노이드인 Kaempferol과 Kaempferol이 다량 함유된 것으로 알려진 연수의 ethyl acetate 추출물을 별아교종세포에 처리한 후 MTT정량분석법으로 흡광도를 측정한 결과 Kaempferol과 연수의 ethyl acetate 추출물은 별아교종세포의 성장률을 농도 의존적으로 감소시켰으며 100 uM 농도에서는 Kaempferol이 57%까지 ethyl acetate 추출물이 70%까지 감소시켰다. Kaempferol과 ethyl acetate 추출물의 IC50농도는 각각 226.
후속연구
- 연수의 ethyl acetate 추출물에는 Kaempferol과 Kaempferol 유도체가 함유되어 있으며 항산화작용과 항암작용이 나타나는 것으로 판단되며 해독효과도 나타날 것으로 생각한다. 이를 바탕으로 계속적인 연구가 이루어져야 할 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.