[논문]Kaempferol, quercetin 및 그 배당체들의 apoptosis 조절을 통한 신경세포 보호 효과

김지현; 이상현; 조은주; 김현영

doi:10.5762/kais.2019.20.2.286

Kaempferol, quercetin 및 그 배당체들의 apoptosis 조절을 통한 신경세포 보호 효과
Neuroprotective Effects of Kaempferol, Quercetin, and Its Glycosides by Regulation of Apoptosis 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.20 no.2, 2019년, pp.286 - 293

김지현 (부산대학교 식품영양학과) , 이상현 (중앙대학교 식물시스템과학과) , 조은주 (부산대학교 식품영양학과) , 김현영 (경남과학기술대학교 식품과학부)

초록
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알츠하이머 질환은 대표적인 신경퇴행성 질환으로, 뇌 내에서 $A{\beta}$ 단백질 축적은 알츠하이머 질환의 원인으로 알려져 있다. 본 연구에서는 amyloid beta ($A{\beta}$)로 손상을 유도한 SH-SY5Y 신경세포에서 kaempferol, kaempferol-3-O-glucoside, quercetin, quercetin-3-${\beta}$-D-glucoside의 신경세포 보호 효과에 대해 검토하였다. SH-SY5Y 신경세포에 $A{\beta}_{25-35}$ ($25{\mu}M$)를 처리하였을 때, 처리하지 않은 normal군에 비해 세포생존율이 유의적으로 감소하였다. 반면, kaempferol, quercetin 및 그 배당체들을 각각 처리하였을 때 $A{\beta}_{25-35}$만을 처리한 control군에 비해 유의적으로 세포생존율의 증가를 나타내었다. 또한, apoptosis에 관여하는 cleaved caspase9, Bcl-2-associated X protein (Bax) 단백질 발현을 측정한 결과, normal군에 비해 control군에서 유의적으로 cleaved caspase9 및 Bax 단백질 발현의 증가를 나타내어 $A{\beta}$ 유도 신경세포 손상으로 인한 apoptosis가 유발됨을 확인 하였으며, kaempferol, quercetin 및 그 배당체들의 처리 시 apoptosis 관련 단백질 발현이 감소함으로써 신경세포 보호 효능이 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과는 kaempferol, quercetin 및 그 배당체들이 apoptosis 조절을 통해 신경세포 보호 효과를 나타내며, 신경세포 손상으로 인한 알츠하이머 질환을 예방하는 유용한 소재로써 사용 가능성이 있음을 보여준다.

Abstract ▼ AI-Helper

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease caused by accumulation of amyloid beta ($A{\beta}$) in the brain. In the present study, we investigated the neuroprotective effects of four flavonoids such as kaempferol, kaempferol-3-O-glucoside, quercetin, and quercetin-3-${\beta}$-D-glucoside against neuronal apoptosis induced by $A{\beta}$ in SH-SY5Y neuronal cells. Treatment with $A{\beta}$ decreased cell viability compared to the non-treated normal group. However, treatment with the four flavonoids increased cell viability in SH-SY5Y cells treated with $A{\beta}$. In addition, we measured the expression of apoptosis-related proteins such as Bcl-2-associated X protein (Bax) and cleaved caspase-9. Treatment with the four flavonoids down-regulated Bax and cleaved caspase-9 in $A{\beta}$-treated SH-SY5Y neuronal cells. Overall, the results of the present study demonstrated the neuroprotective effect of flavonoids by anti-apoptotic activity in $A{\beta}$-induced SH-SY5Y neuronal cells. These results suggest that these four flavonoids would be useful therapeutic and prevention agents for AD.

주제어

표/그림 (3)

그림 Fig. 1. Chemical structure of kaempferol (A), kaempferol -3-O-glucoside (B), quercetin (C), quercetin-3-β -D-glucoside (D)
표 Table 1. Effect of kaempferol, quercetin and its glycosides on cell viability of SH-SY5Y cells treated with Aβ_25-35
그림 Fig. 2. Effect of kaempferol (K), kaempferol-3-O-glucoside (KG), quercetin (Q), and quercetin-3-β-D-glucoside(QG) on apoptosis-related protein expression in SH-SY5Y cells treated with Aβ_25-35. Values are mean ± SD. ^a~dMeans with the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test. N:normal group; C:control group; K:kaempferol; KG:kaempferol-3-O-glucoside

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 kaempferol과 그 배당체인 kaempferol-3-O-glucoside, quercetin과 그 배당체인 quercetin-3-β-D-glucoside의 총 4가지 활성성분의 Aβ 유도 SH-SY5Y 신경세포에서 apoptosis 조절을 통한 신경세포 보호 효과에 대해 알아보았다.

제안 방법

24시간 뒤, 시료를 농도별(0.25, 0.5, 1 μM)로 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator 내에서 4시간 배양시키고, 그 뒤 세포의 손상을 유도하기 위하여 Aβ25-35를 25 μM의 농도로 처리하여 동일한 조건에서 배양시켰다.
Aβ25-35 유도 신경세포 사멸에 대한 보호 기전을 규명하기 위해, apoptosis에 관여하는 단백질인 cleavedcaspase-9과 Bax 단백질 발현을 측정하였다 (Fig. 2).
Aβ25-35의 처리로 신경세포 손상을 유도한 SH-SY5Y 세포에서 kaempferol, kaempferol-3-O-glucoside,quercetin, quercetin-3-β-D-glucoside를 각각 처리하여 세포 생존율을 측정을 통해 4가지 flavonoids의SH-SY5Y 신경세포 보호 효과를 살펴보았다 (Table 1).
Aβ로 손상을 유도한 신경세포에서 kaempferol, kaempferol-3-O-glucoside, quercetin,quercetin-β-D-glucoside의 신경세포 보호 효능을 검토하였다.
먼저 SH-SY5Y 세포에 kaempferol, kaempferol-3-Oglucoside, quercetin, quercetin-3-β-D-glucoside를 0.5,1, 2.5, 5 uM의 농도로 각각 처리하였을 때, 5 uM의 농도까지 90% 이상의 세포 생존율을 나타냄을 확인하여본 실험농도를 설정하여 실험을 진행하였다(data not shown).
24시간 뒤, 배양한 세포에 RIPA buffer를 첨가하여 4℃,12,000 rpm에서 30분간 원심분리하고 상층액을 e-tube로 옮겼다. 상층액은 Bio-Rad protein assay kit를 이용하여 단백질 정량을 실시하였다. 각 시료를 10%의 sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel(SDS-PAGE)에서 80V로 전기영동한 뒤, PVDFmembrane에 100V에서 2시간동안 transfer하였다.
그 뒤, membrane을 5% skim milk를 이용하여 실온에서 1시간동안 blocking하여 각각 1:200의 농도로 희석한 cleaved caspase9 또는 Bax를 1차 항체를 4℃에서 overnight 반응시켰다. 이후, 1:500으로 희석한 2차 항체와 실온에서 1시간 반응시킨 뒤, 동량으로 희석한 ECL solution을 가하여 발광시켜 Chemilium inescence image system (Davinch-Chemi^TM)을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.

대상 데이터

Western blotting에 사용한 RIPA buffer는 ElpisBiotech. (Daejeon, KoreA)에서, polyvinyldene fluoride(PVDF) membrane은 Millipore (Billerica, MA, USA)에서, cleaved caspase 9와 2차 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서, Bax는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, MA, USA)에서,enhanced chemiluminescence (ECL)는 Bio-Rad(Hercules, USA)사에서 구입하여 실험에 사용하였다.
SH-SY5Y 신경세포는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul,Korea)에서 구입하였다. 세포 배양을 위한 Dulbecco'smodified eagle medium (DMEM) 배지, fetal bovine serum (FBS), 100 units/mL penicillin streptomycin,tripsin EDTA 시약은 Welgene (Daegu, Korea)에서 구입하여 세포 배양에 사용하였다.
세포 배양을 위한 Dulbecco'smodified eagle medium (DMEM) 배지, fetal bovine serum (FBS), 100 units/mL penicillin streptomycin,tripsin EDTA 시약은 Welgene (Daegu, Korea)에서 구입하여 세포 배양에 사용하였다.
(St Louis, MO, USA)에서 구매하여, 37℃에서 72시간 동안 응집시켜 실험에 사용하였다. 세포 생존율 측정에 사용한 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Bio Basic(Roronto, Canada)에서, dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Bio Pure (Ontario, Canada)사에서 구입하여 사용하였다. Western blotting에 사용한 RIPA buffer는 ElpisBiotech.
실험에 사용한 kaempferol, quercetin, quercetin-3-β-D-glucoside는 Sigma chemical Co. (St Louis, MO,USA)에서 kaempferol-3-O-glucoside는 Extrasynthese(Genay, France)사에서 구매하여 사용하였다.

데이터처리

a~dMeans with the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
a~dMeanswith the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
모든 실험에서 나온 대조군과 각 시료들로부터 얻은 결과들은 평균 ± 표준편차로 나타내었고, Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 프로그램을 이용하여 각 실험 결과로부터 analysis of variance(ANOVA)를 구한 후 Duncan's multiple test(P<0.05)를 이용하여 각 군의 평균 간의 유의성 검정을 실시하였다.

성능/효과

Quercetin 또는 quercetin-3-β-D-glucoside를 각각 처리하였을 때 모든 농도에서 Aβ25-35만을 처리한 control군에 비해 유의적으로 높은 세포 생존율을 나타내었다.
Quercetin 및 quercetin-3-β-D-glucoside를 1 μM의 농도로 각각 처리하여 단백질 발현 측정을 통해 apoptosis 조절 기전을 확인한 결과, control군에 비해 quercetin과 배당체인 quercetin-3-β-D-glucoside 처리 군에서 cleaved caspase-9과 Bax 단백질 발현의 유의한 감소를 통해 apoptosis에 대한 보호 효과를 확인하였다.
그 결과 각각의 활성물질은 Aβ만을 처리한 control군에 비해 유의적으로 세포생존율의 증가를 나타내었다.
따라서 kaempferol 및 그 배당체인 kaempferol-3-O-glucoside와 quercetin 및 그 배당체인 quercetin-3-β-D-glucoside는 Aβ25-35로 손상을 유도한 신경세포에서 세포 생존율 증가를 통해 Aβ25-35로 손상을 유도한 신경세포에서의 보호 효능이 있는 것으로 생각되며, 특히 kaempferol, quercetin과 같은 aglycone에 비해 배당체에서 신경세포 보호 활성이 높음을 확인하였다.
따라서 본 연구결과를 통해 kaempferol, quercetin 및 그 배당체들은 pro-apoptosis인자인 cleaved caspase-9와 Bax 단백질 발현 억제를 통해 Aβ로 유도된 SH-SY5Y 신경세포의 apoptosis를 억제함을 확인하였다.
반면 kaempferol 및 kaempferol-3-O-glucoside를 1 μM의 농도로 처리하였을 경우, apoptosis에 관여하는 단백질인 cleavedcaspase-9과 Bax 단백질 발현의 유의한 감소를 통해 apoptosis에 조절을 통한 신경세포 보호 효과를 확인하였다.
뿐만 아니라, kaempferol, kaempferol-3-O-glucoside,quercetin, quercetin-β-D-glucoside는 control군에 비해 cleaved caspase-9와 Bax 단백질 발현을 50% 이상 감소시켜 Aβ로 유도된 SH-SY5Y 신경세포의 apoptosis를 억제함으로써 신경세포를 보호하는 것으로 보이며, 이러한 결과들은 flavonoid 계열의 활성성분인 kaempferol,quercetin이 신경퇴행성 질환의 유용한 소재로 이용 될 수 있음을 시사한다.
뿐만 아니라,quercetin-3-β-D-glucoside는 0.25, 0.5 μM의 농도에서 각각 70.33%, 69.15%의 우수한 세포 생존율을 나타내어 Aβ25-35 유도 신경세포 손상에 대한 보호 효과를 확인하였다.
특히, 모든 농도에서 quercetin 처리 군에 비해 quercetin-3-β-D-glucoside 처리 군에서 높은 세포 생존율을 나타내었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	알츠하이머 질환이란?	알츠하이머 질환(Alzheime'rs disease)은 노화에 따른 대표적인 신경퇴행성 질환으로, 기억력, 학습능력, 인지능력 손상 등의 특징을 나타낸다[1]. 아밀로이드 베타(amyloid beta; Aβ)는 알츠하이머 질환의 대표적인 원인으로 알려지고 있다[2].
	알츠하이머 질환의 특징은?	알츠하이머 질환(Alzheime'rs disease)은 노화에 따른 대표적인 신경퇴행성 질환으로, 기억력, 학습능력, 인지능력 손상 등의 특징을 나타낸다[1]. 아밀로이드 베타(amyloid beta; Aβ)는 알츠하이머 질환의 대표적인 원인으로 알려지고 있다[2].
	SH-SY5Y 신경세포 세포 배양 방법은?	SH-SY5Y 신경세포는 100 units/mL의 penicillin streptomycin과 10%의 FBS가 함유된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며,배양된 세포는 2~3일에 한 번씩 배양액을 바꾸어 주면서 배양시켰다. 세포 분화가 80% 이상 도달하였을 때 phosphate buffered saline (pH 7.4)으로 부착된 세포를 세척한 뒤, 0.02% EDTA가 함유된 0.05% trypsin으로 부착된 세포를 분리하여 1,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 세포를 집적시킨 뒤, 배지에 넣고 골고루 분산시켜 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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