Surface plasmon resonance (SPR) biosensor has been used to detect many biochemical reactions, because this label-free sensor has high sensitivity and rapid response. The reactions are monitored by refractive index changes of the SPR biosensor. Iprovalicarb is protective, curative, and eradicative sy...
Surface plasmon resonance (SPR) biosensor has been used to detect many biochemical reactions, because this label-free sensor has high sensitivity and rapid response. The reactions are monitored by refractive index changes of the SPR biosensor. Iprovalicarb is protective, curative, and eradicative systemic fungicide introduced by Bayer AG in 1999. It has potential far control of downy mildew infesting onion, cucumber, grape and melon, late blight infesting tomato and potato, and anthracnose infesting watermelon and pepper. It is strictly limited to the maximum residue limit. In this study, the applicability of a portable SPR biosensor (Spreeta, Texas instrument, TX, USA) to detect the iprovalicarb residue was examined. The sensor chip was adopted to detect the reaction of iprovalicarb to immobilized iprovalicarb-antibody. The binding of the iprovalicarb onto the biosensor surface was measured by change of the refractive index (RI). Characteristics of the sensor chip including specificity, sensitivity, stability, and reusability were analyzed. In calibration test for seven levels of iprovalicarb concentration (0.32 to 5,000 mg/L) with three replications, a Sigmoidal model with Hill function was obtained between relative RI value and the iprovalicarb concentration with R-square of 0.998. It took 30 minutes to complete a set of detecting assay with the SPR biosensor.
Surface plasmon resonance (SPR) biosensor has been used to detect many biochemical reactions, because this label-free sensor has high sensitivity and rapid response. The reactions are monitored by refractive index changes of the SPR biosensor. Iprovalicarb is protective, curative, and eradicative systemic fungicide introduced by Bayer AG in 1999. It has potential far control of downy mildew infesting onion, cucumber, grape and melon, late blight infesting tomato and potato, and anthracnose infesting watermelon and pepper. It is strictly limited to the maximum residue limit. In this study, the applicability of a portable SPR biosensor (Spreeta, Texas instrument, TX, USA) to detect the iprovalicarb residue was examined. The sensor chip was adopted to detect the reaction of iprovalicarb to immobilized iprovalicarb-antibody. The binding of the iprovalicarb onto the biosensor surface was measured by change of the refractive index (RI). Characteristics of the sensor chip including specificity, sensitivity, stability, and reusability were analyzed. In calibration test for seven levels of iprovalicarb concentration (0.32 to 5,000 mg/L) with three replications, a Sigmoidal model with Hill function was obtained between relative RI value and the iprovalicarb concentration with R-square of 0.998. It took 30 minutes to complete a set of detecting assay with the SPR biosensor.
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문제 정의
본 연구에서는 표면플라즈몬공명(SPR) 원리로 제작하여 시판 중인 SPR 바이오센서 칩과 즉정시스템(Spreeta, Texas instrument, TX, USA)을 이용한 SPR 바이오센서 측정시스템을 구성하고, 살균제인 iprovalicarb의 검출 가능성을 구명하였다. 이를 위하여 SPR 바이오센서의 금막 표면에 iprovalicarb 항체를 고정하고 시료를 반응시킨 후, 바이오센서의 굴절률 변화를 분석하여 iprovalicarb를 검출하였다.
제안 방법
(4) 비선형 곡선적합에 의한 시그모이드 모형(Hill 함수)을이용하여, 항체희석비가 1:16, 000일 때의 상대굴절률과 iprovalicarb 농도 사이의 측정모델(결정계수: 0.998)을구하였다.
센서 간의 편차를 제거하기 위하여 매 실험마다 센서의 초기화 과정을 전처리로 수행하였으며, 반응 후 시간 경과에 따른 굴절률 차와 공명각 변화를 측정하였다. Iprovalicarb 의 농도별(대조구 포함)로 3회 반복하여 수집된 SPR 바이오센서의 출력신호를 통계처리하여 iprovalicarb 농도에 따른 상대 굴절률간의 관계식을 구하였다.
SPR 바이오센서를 1회 사용 후 금막 표면을 세척하여 항체를 제외한 흡착물질을 제거하고 8 mg/L 농도의 iprovalicarb 로 반복하여 측정한 결과를 비교였다. 측정값으로 상대굴절률 AR/)을 구하고 식 (3)으로 상대척도(relative scale)를 계산하였다(Cho and Kim, 2003).
SPR 바이오센서의 검출성능을 평가하기 위해, 항체를 고정화한 센서에 iprovalicarb 시료를 농도별(5000, 1000, 200, 40, 8, 1.6, 0.32 mg/L)로 희석하여 사용하였고, 시료 농도 0 mg/L 대조구로서 농약시료를 첨가하지 않은 PBS 완충용액을 사용하였다. 항체의 농도는 Lee et al.
이를 위하여 SPR 바이오센서의 금막 표면에 iprovalicarb 항체를 고정하고 시료를 반응시킨 후, 바이오센서의 굴절률 변화를 분석하여 iprovalicarb를 검출하였다. 또한, 바이오센서의 검출 특성을 평가하기 위하여, 센서의 측정 감도 특이성 및 안정성을 분석하여 iprovalicarb를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는지를 조사하였다.
이후 금막에 고정화된 티올기에 항체가 흡착되는 활성도를 높이기 위해 3차 증류수로 세척하였다 PBS 완충용액으로 용해시킨 항체 용액(1 mg/mL)을 마이크로 피펫을 이용하여 1회 150 |1L 씩 센서의 금막 표면에 떨어뜨려, 120분 동안 40분을 주기로 총 3회 공급하여 24℃ 상온에서 반응시켰다 이때 항체의 농도가 1~2 mg/mL 범위에 미치지 못하면 티올기와 흡착반응이 형성되지 않으므로 예비실험을 통해 적정농도가-1 mg/mL 임을 확인 후 실험을 계속하였다. 마지막으로 센서의 금막표면을 PBS 완충용액으로 1~2분간 세척 후 10% Blocker™ BSA 로 10분 간 블로킹 처리하였다.
본 연구에서는 Spreeta™ SPR 센서와 면역반응을 이용하여 살균제 iprovalicarb를 검출할 SPR 바오센서 시스템을 구성하였고, 바이오센서의 특이성, 잔류농약의 검출능력 및 재사용성을 분석하였다. 본 연구를 통해 얻어진 연구결과를 요약하면 다음과 같다.
티올화 항체를 화학흡착에 의해 고정시킨 센서 칩의 재사용성을 평가하기 위해, 새 센서 칩에 항체를 고정화하여 1회 사용 후, 고농도(1 M)와 저농도 (10 mM) 의 NaOH로 세정작업을 통해 항체에 반응된 농약 시료만 제거한 후, 상대신호의 크기가 30% 이하로 측정될 때까지 이 과정을 반복하였다. 세정 작업은 항체의 손상을 최소한으로 줄이기 우]해, 센서의 핀을 위로 향하도록 하고, 금막 표면의 길이 방향을 수직과 45° 경사지게 한 후, 피펫으로 세정액을 100 ml 씩 금막 바로 위의 테두리에 떨어뜨려, 세정액이 중력에 의해 금막 표면의 길이 방향으로 흐르도록 하고, 이 작업을 4회 반복하였다.
(2004)이 발표한 효소 면역법에 사용된 최적 희석비인 1, 8000과 1:16, 000을 사용하였다. 센서 간의 편차를 제거하기 위하여 매 실험마다 센서의 초기화 과정을 전처리로 수행하였으며, 반응 후 시간 경과에 따른 굴절률 차와 공명각 변화를 측정하였다. Iprovalicarb 의 농도별(대조구 포함)로 3회 반복하여 수집된 SPR 바이오센서의 출력신호를 통계처리하여 iprovalicarb 농도에 따른 상대 굴절률간의 관계식을 구하였다.
센서 초기화를 위해 분석용 프로그램을 실행한 후, 센서 헤드부, 신호변환기, RS-232C, 컴퓨터와의 연결 상태를 확인하였다 연결 상태를 확인 후 옵션 메뉴의 하드웨어 서브 메뉴에서 SPR 입력장치를 128화소 센서로 설정 후, 센서의 정상 상태 확인을 위해 데이터 메뉴의 원시 신호보기 서브 메뉴를 통해 센서 입력와 조명강도(7-medium을 .5 ms의 적분 시간)를확인하였다. 유량 시스템을 준비하여, 공기 주입상태에서 이상적인 설정 값으로 센서를 초기화하고, 일정시간동안 기준선 완충용액(base line buffer)으로 3차 증류수를 센서에 공급하여 기준선을 잡아 주었다.
센서의 검출성능과 측정 감도를 평가하기 위해, 센서의 금막표면에 항체를 고정화한 후 iprovalicarb의 농도를 0.32, 1.6, 8, 40, 200, 1000, 5000 ug/L로 준비하여 SPR 센서에 반응 시켜 결과를 측정하였다. 그림 8은 항체의 농도를 원액 대비 각각 1:16, 000과 1:8, 000의 비율로 용해하여 고정화 시킨 후 농약 시료를 연동펌프로 금막 표면에 주입한 후 측정된 굴절률 변화의 매 1분간 평균값을 나타낸다.
2004). 센서의 금막 표면에 항체를 고정화하기 위하여, 우선 금막의표면을 PBS-Triton 또는 PBS 완충용액으로 세척하여 금막표면의 이물질을 제거한 후, 실온에서 완전 건조하였다. 마이크로 피펫으로 DSP 용액(4 mg/mL의 DMSO) 100 |1L를 센서의 금막 표면에 1회 떨어뜨린 후 24℃ 상온에서 30분간 반응시켰다.
센서의 특이성 평가를 위해, 항체 고정화된 센서의 금 막 표면에 iprovalicarb 시료 BSA 및 살균제 imidacloprid를 각각 반응시켜 굴절률의 변화를 즉정하였다. 특이성 평가를 위해 사용된 화합물의 농도는 모두 200 mg/L로 하였다.
저해하는 문제가 발생한다. 실험에 사용된 연동 펌프의 조절 손잡이 위치에 따른 유속을 예비실험을 통해 관계식을 구하고, 이상적인 항원-항체의 결합 반응에 필요한 최적 유속을 시행착오법에 의해 0.54 mL/min으로 결정하였다.
5 ms의 적분 시간)를확인하였다. 유량 시스템을 준비하여, 공기 주입상태에서 이상적인 설정 값으로 센서를 초기화하고, 일정시간동안 기준선 완충용액(base line buffer)으로 3차 증류수를 센서에 공급하여 기준선을 잡아 주었다.
이를 위하여 SPR 바이오센서의 금막 표면에 iprovalicarb 항체를 고정하고 시료를 반응시킨 후, 바이오센서의 굴절률 변화를 분석하여 iprovalicarb를 검출하였다. 또한, 바이오센서의 검출 특성을 평가하기 위하여, 센서의 측정 감도 특이성 및 안정성을 분석하여 iprovalicarb를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는지를 조사하였다.
DMSO 용액을 이용한 세척은 블로킹(blicking) 역할을 동시에 수행하여, 금막에 더 이상의 티올기가 흡착하지 못하게 하였다. 이후 금막에 고정화된 티올기에 항체가 흡착되는 활성도를 높이기 위해 3차 증류수로 세척하였다 PBS 완충용액으로 용해시킨 항체 용액(1 mg/mL)을 마이크로 피펫을 이용하여 1회 150 |1L 씩 센서의 금막 표면에 떨어뜨려, 120분 동안 40분을 주기로 총 3회 공급하여 24℃ 상온에서 반응시켰다 이때 항체의 농도가 1~2 mg/mL 범위에 미치지 못하면 티올기와 흡착반응이 형성되지 않으므로 예비실험을 통해 적정농도가-1 mg/mL 임을 확인 후 실험을 계속하였다. 마지막으로 센서의 금막표면을 PBS 완충용액으로 1~2분간 세척 후 10% Blocker™ BSA 로 10분 간 블로킹 처리하였다.
역할을 가능하게 한다. 티올화 항체를 화학흡착에 의해 고정시킨 센서 칩의 재사용성을 평가하기 위해, 새 센서 칩에 항체를 고정화하여 1회 사용 후, 고농도(1 M)와 저농도 (10 mM) 의 NaOH로 세정작업을 통해 항체에 반응된 농약 시료만 제거한 후, 상대신호의 크기가 30% 이하로 측정될 때까지 이 과정을 반복하였다. 세정 작업은 항체의 손상을 최소한으로 줄이기 우]해, 센서의 핀을 위로 향하도록 하고, 금막 표면의 길이 방향을 수직과 45° 경사지게 한 후, 피펫으로 세정액을 100 ml 씩 금막 바로 위의 테두리에 떨어뜨려, 세정액이 중력에 의해 금막 표면의 길이 방향으로 흐르도록 하고, 이 작업을 4회 반복하였다.
표면플라즈몬공명과 면역 분석법을 이용한 바이오센서의 성능평가.에 필요한 iprovalicarb와 p-methylphenylethylamine는 Bayer AG(Leverkusen, Germany)에서 분석 등급으로 공급받았다.
항체가 고정화된 센서의 금막 표면에 플로우셀 (flow cell)을 부착하고 연동펌프로 유속을 조절하여 농약 시료를 공급하도록 하였다 주입된 농약시료는 센서의 금막 표면에서 항체와 결합반응을 하고 나머지는 배출되도록 하였다.
항체를 센서의 금막 표면에 고정화하고, 농약시료를 추가한 후 SPR 곡선의 공명각이 변화되는 정도와 시간의 경과에 따른 굴절률 변화를 즉정하였으며, SPR 바이오센서의 특이성을 알아보기 위해 항체가 고정화되지 않은 센서에도 동일한 조건으로 농약시료를 추가하고 굴절률 변화를 측정하였다.
대상 데이터
농약시료의 주입을 위해 정격유속 0.03-1.00 mL/min을 갖는 저용량 변속 연동펌프(KH-73160-00, Cole-Parmer, Vermon, Ⅱ, USA)와 Viton 튜빙 재료를 사용하였다.
본 연구에 사용된 SPR 센서의 광원은 840 nm의 편광 근적외선 발광다이오드(LED)이며, 구조는 그림 1과 같다. 설정된 조명 강도에 의해 LED에서 투사된 빛은 센서의 금막 표면에 부착된 분석물에 의해 광특성이 바뀐 상태로 전반사 굴절이 되며, 굴절된 빛은 센서 천장 면에 장착된 금반사경에 의해 광다이오드 어레이로 전달된다.
센서 칩의 금막 표면에 고정할 항체와 결합할 티올기(-SH) 를 코팅하기 위해 티올화 가교제(thiolation cross-linker)로 DSP (3, 3' -dithiodipropionic acid, Sigma, USA)를 사용하였으며, DSP는 용매 DMSO(dimethyl solfbxide, Cica, USA)로 4 mg/mL의 비율로 용해하여 사용하였다.
실험에 필요한 완충용액의 용매 또는 센서의 금막 표면을 세척하기 위해 PBS 완충용액을 사용하였으며, 센서 표면에 고정화된 항체를 포함한 완전 세척을 위하여 계면활성제인 Triton X-100(Fluka, Japan)을 사용하였다. 세척액은 1%의 비율로 거품이 생기지 않도록 주의하면서 초순도 3차 증류수에 용해하여 실온에서 보관하면서 사용하였다.
성능평가.에 필요한 iprovalicarb와 p-methylphenylethylamine는 Bayer AG(Leverkusen, Germany)에서 분석 등급으로 공급받았다. 농약시료는 공급받은 iprovalicarb 표준시약 100 |ig/L 를 PBS(phosphate buffered saline, Sigma, USA) 완충용액에 1:8, 000과 1:16, 000으로 희석하여 농도를 맞추어 4℃ 냉장고에 보관하면서 사용하였다.
이론/모형
본 연구에서는 항체고정화를 위해 티올화된 리간드를 금속 표면에 화학적으로 흡착시키는 방법을 사용하였다(Pierce, 2004). 센서의 금막 표면에 항체를 고정화하기 위하여, 우선 금막의표면을 PBS-Triton 또는 PBS 완충용액으로 세척하여 금막표면의 이물질을 제거한 후, 실온에서 완전 건조하였다.
성능/효과
(1) 센서 칩의 특이성 분석에서 본 실험에 사용된 항체의 고정화 유무에 따른 SPR 곡선의 최소점에서의 공명 각이 픽셀번호로 81에서 90으로 변화됨을 확인하였다
(3) 항체의 희석 비율이 1:8, 000과 1:16, 000일 때 iprovalicarb 시료에 대한 SPR 바이오센서의 검출 성능을 확인한 결과 0.32 ug/J까지 검출이 가능하고, 검출에 필요한 반응시간은 각각 42분과 30분으로 나타났다.
(5) 센서 칩의 재 사용성을 평가한 결과, 동일한 센서를 2 회 이상 반복하여 사용하였을 때 검출능력은 최초 사용에 비해 75% 이하로 감소하였다. 따라서 재사용성은 양호하지 않은 것으로 확인되었다.
비해 75% 이하로 감소하였다. 따라서 재사용성은 양호하지 않은 것으로 확인되었다.
290으로 증가하였다. 이어 320초에 센서에 증류수를 주입하고 60초 후인 380초에 굴절률은 1.284로 감소하여, Spreeta™ 센서가 정상적으로 작동함을 확인하였다.
항체의 농도와 관계없이 모든 농도범위에서 양호한 측정 결과를 보여주고 있어 최소 0.32 mg/L까지 검출이 가능하여, 잔류 허용한계인 0.5 mg/kg의 검출이 충분한 것으로 확인되었다. 반응시간은 항체의 희석비가 높은 1:16, 000의 경우가 30 분 정도로 희석비가 낮은 1:8, 000의 경우 40분 정도로 나타났고, 굴절률 변화는 1:8, 000의 경우가 큰 것으로 확인되었다.
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