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문제 정의
- 목질계 바이오매스 전처리시 발생하는 저해물질로써 퓨란류, 유기산류, 페놀류를 포함한 발효에 있어, S. cerevisiae K35와 P. stipitis KCCM 12009가 에탄올 생산에 미치는 영향을 중심으로 연구를 수행하였다. 본 연구에 사용된 두 균주 모두 24시간 내에 100 g/L의 glucose를 모두 소비하였으며, 40 g/L 이상의 에탄올을 생산하였다.
- 본 연구에서는 목질계 바이오매스를 이용한 바이오에탄올의 경제적 생산을 위한 기초 연구로써 분해산물의 잔류 농도에 따른 에탄올 발효균주의 내성 및 저해제가 미치는 영향을 평가하고자 6탄당 (glucose)을 탄소원으로 한 합성배지에 저해물질인 유기산 (organic acid) 계열의 acetate와 퓨란 (furan) 계열의 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF), furfural, 그리고 페놀 (phenol) 계열인 syringaldehyde, vanillic acid, syringic acid 등의 저해물질이 존재시, Saccharomyces cerevisiae K35와 Pichia stipitis KCCM 12009를 이용한 발효공정에서 두 균주의 생장과 에탄올 생산에 미치는 영향을 확인하고자 하였으며, 이를 통하여 전처리 공정시 고려되어야 할 분해산물의 적정 처리 농도를 파악함으로써 경제적인 목질계 바이오매스를 이용한 바이오에탄올 생산에 기초자료를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- S. cerevisiae K35와 P. stipitis KCCM 12009를 이용한 에탄올 발효에 있어 acetate가 미치는 영향을 확인하였다 (Fig. 2, Fig. 3). 배양액에 acetate가 5 g/L 및 10 g/L 존재하는 경우, S.
- S. cerevisiae K35와 P. stipitis KCCM 12009를 이용한 에탄올 발효에 있어 페놀류인 syringaldehyde, vanillic acid, syringic acid가 미치는 영향을 확인하였다 (Fig. 2, Fig. 3). 먼저, 배양액에 syringaldehyde가 1 g/L 및 2 g/L 존재하는 경우, S.
- S. cerevisiae K35와 P. stipitis KCCM 12009를 이용한 에탄올 발효에 있어 퓨란류인 5-HMF와 furfural이 미치는 영향을 확인하였다 (Fig. 2, Fig. 3). 배양액에 5-HMF가1 g/L 및 2 g/L 존재하는 경우, S.
- 배양액에서 채취한 샘플은 분광광도계 (Shimadzu UV-1800, Japan)를 사용하여 600 nm에서 균체량을 측정하였다.
- 1). 이후 기술된 내용에서는 농도별로 저해제가 첨가된 실험을 통하여 S. cerevisiae K35와 P. stipitis KCCM 12009가 일부 세포성장에 대한 내용과 함께 에탄올 생산에 미치는 영향을 중심으로 결과를 나타내었다.
대상 데이터
- YM broth, yeast extract, peptone 등의 배지는 Difco(Detroit, MI, USA)에서 구입하였다. Acetic acid, furfural, 5-hydroxymethylfurfural, syringaldehyde는 Sigma-Aldrich(St, Louis, MO, USA)에서, vanillic acid는 Alfa (Shore Road, Heysham, Lancs), 그리고 syringic acid은 Acros (New Jersey, USA)에서 구입하였다. 이외의 모든 시약들은 experimental grade 또는 그 이상의 순도를 갖는 시약을 이용하였다.
- HPLC는 refractive index detector가 탑재된 Agilent 1200 series 모델을 이용하였으며, 컬럼 (column)은 Biorad사의 Aminex HPX-87H column (300 × 7.8 mm)을 사용하였다.
- KCCM 12009가 사용되었다. YM broth, yeast extract, peptone 등의 배지는 Difco(Detroit, MI, USA)에서 구입하였다. Acetic acid, furfural, 5-hydroxymethylfurfural, syringaldehyde는 Sigma-Aldrich(St, Louis, MO, USA)에서, vanillic acid는 Alfa (Shore Road, Heysham, Lancs), 그리고 syringic acid은 Acros (New Jersey, USA)에서 구입하였다.
- stipitis KCCM 12009가 에탄올 생산에 미치는 영향을 중심으로 연구를 수행하였다. 본 연구에 사용된 두 균주 모두 24시간 내에 100 g/L의 glucose를 모두 소비하였으며, 40 g/L 이상의 에탄올을 생산하였다. 저해물질로 퓨란 (5-HMF, furfural)류가 1-2 g/L 존재시, S.
- 본 연구에서는 에탄올 발효 및 저해영향 파악을 위한 균주로서 S. cerevisiae K35 및 P. KCCM 12009가 사용되었다. YM broth, yeast extract, peptone 등의 배지는 Difco(Detroit, MI, USA)에서 구입하였다.
- 에탄올 (ethanol) 및 글루코오스 (glucose)의 농도를 측정하기 위해 배양액 5 mL을 취하고 10,000 G에서 15분 동안 원심분리기를 이용하여 균체를 침강시킨 후 상등액을 0.20 μM의 필터 (Advantec DISMIC 13JP PTFE 0.20 μM, Japan)로 필터링한 후 HPLC 분석용 샘플을 준비하였다.
성능/효과
- stipitis KCCM 12009는 그와 반대의 경향을 보였다. Acetate가 5 g/L 이상 존재하는 경우, S. cerevisiae K35와 P. stipitis KCCM 12009 두 균주 모두에 균체량 및 에탄올 생산에 대한 저해정도가 가장 높았다. 또한, 페놀류 (syringaldehyde, vanillic acid, syringic acid)가 각각 1-2 g/L 존재시, S.
- stipitis KCCM 12009의 발효 (reference fermentation)시, 24시간 내에 100 g/L의 glucose를 모두 소비했으며, 균체량 (cell growth)의 경우, 24시간 배양 후의 OD600값은 각각 약 15와 12, 48시간 배양 후에는 각각 약 16과 20의 값을 보였다. S. cerevisiae K35의 균체량 패턴은 glucose의 소비 추이와 뚜렷한 반대 경향을 보였으며 24시간에 균체량이 최대를 나타내었고 이후 감속기에 접어드는 반면, P. stipitis KCCM 12009는 48시간까지 계속적인 대수기 상태에 있었다. 세포 성장의 차이가 있음에도 에탄올 생산 패턴은 24시간에 모두 40 g/L 이상의 농도를 보였으며, 이후 큰 변화가 없었다 (Fig.
- 4%의 상대적 에탄올 생산량을 보였다. Syringaldehyde, vanillic acid, syringic acid가 각각 1-2 g/L 존재시 S. cerevisiae K35는 저해물질이 존재하지 않는 발효에 비해 상대적으로 적은 세포성장을 보였으나 에탄올 생산량은 비슷하거나 미량 증가하는 특성을 보였다. 반면, P.
- 6%의 상대적 에탄올 생산량을 보였다. 두 번째로, 배양액에 vanillic acid가 1 g/L 및 2 g/L 존재하는 경우, S. cerevisiae K35는 24시간 경과 후 98.8% 및 107.7%의 상대적 에탄올 생산량을 보였고, 48시간 경과 후에는 107.6% 및 100.4%의 상대적 에탄올 생산량을 보인 반면, P. stipitis KCCM 12009는 24시간 경과 후 85.5% 및 0.4%의 상대적 에탄올 생산량을, 48시간 경과 후 각각 105.5% 및 106.3%의 상대적 에탄올 생산량을 보였다. 마지막으로 배양액에 syringic acid가 1 g/L 및 2 g/L 존재하는 경우, S.
- stipitis KCCM 12009 두 균주 모두에 균체량 및 에탄올 생산에 대한 저해정도가 가장 높았다. 또한, 페놀류 (syringaldehyde, vanillic acid, syringic acid)가 각각 1-2 g/L 존재시, S. cerevisiae K35는 비교적 적은 세포성장 저해영향과 소량 증가하는 에탄올 생산량을 보인 반면, P. stipitis KCCM 12009는 전반적으로 S. cerevisiae K35의 세포성장과 에탄올 생산에 있어 유사한 경향을 보였으나, syringaldehyde와 vanillic acid가 2 g/L 존재시에는 24시간에 균생장이 급격히 감소함과 동시에 에탄올 생산량도 감소함을 보였고, 48시간 배양 후 저해물질의 영향에서 벗어나 정상적인 세포성장과 에탄올을 생산하는 경향을 보였다. S.
- 3%의 상대적 에탄올 생산량을 보였다. 마지막으로 배양액에 syringic acid가 1 g/L 및 2 g/L 존재하는 경우, S. cerevisiae K35는 24시간 배양 후 108.4% 및 102.8%의 상대적 에탄올 생산량을 보였으며, P. stipitis KCCM 12009는 24시간 배양 후 각각 9.3% 및 87.2%의 상대적 에탄올 생산량을, 48시간 배양 후 100% 및 108.4%의 상대적 에탄올 생산량을 보였다. Syringaldehyde, vanillic acid, syringic acid가 각각 1-2 g/L 존재시 S.
- 3). 먼저, 배양액에 syringaldehyde가 1 g/L 및 2 g/L 존재하는 경우, S. cerevisiae K35는 24시간 경과 후 99.5% 및 98.5%의 상대적 에탄올 생산량을, 48시간 경과 후 99.5% 및 97.7%의 상대적 에탄올 생산량을 보인 반면, P. stipitis KCCM 12009는 24시간 경과 후 각각 94.8% 및 5.6%의 상대적에탄올 생산량을 보였고, 48시간 경과 후 102.3% 및 97.6%의 상대적 에탄올 생산량을 보였다. 두 번째로, 배양액에 vanillic acid가 1 g/L 및 2 g/L 존재하는 경우, S.
- cerevisiae K35는 저해물질이 존재하지 않는 발효에 비해 상대적으로 적은 세포성장을 보였으나 에탄올 생산량은 비슷하거나 미량 증가하는 특성을 보였다. 반면, P. stipitis KCCM 12009의 경우, S. cerevisiae K35의 세포성장과 에탄올 생산시 비슷한 경향을 보였으나, syringaldehyde와 vanillic acid가 2 g/L 존재시에는 24시간에 균생장이 급격히 감소함과 동시에 에탄올 생산량도 감소하였고, 48시간 경과 후 저해물질의 영향에서 벗어나 정상적인 균생장과 에탄올을 생산하는 경향을 나타내었다.
- 3). 배양액에 5-HMF가1 g/L 및 2 g/L 존재하는 경우, S. cerevisiae K35는 24시간 경과 후 각각 18.9% 및 32.3%의 상대적 에탄올 생산량 (relative ethanol productivity, %)을 보였고, 48시간 경과 후 100.7% 및 94.5%의 상대적 에탄올 생산량을 보인 반면, P. stipitis KCCM 12009는 24시간 경과 후 각각 93.6% 및 84.3%의 상대적 에탄올 생산량을, 48시간 경과 후에는 99.7% 및 101.0%의 상대적 에탄올 생산량을 보였다. 배양액에 furfural이 1 g/L 및 2 g/L 존재하는 경우, S.
- 3). 배양액에 acetate가 5 g/L 및 10 g/L 존재하는 경우, S. cerevisiae K35는 24시간 경과 후 각각 13.4% 및 2.1%의 상대적 에탄올 생산량을 보였으며, 48시간 경과 후에는 105.4% 및 0%의 상대적 에탄올 생산량을 보인 반면, P. stipitis KCCM 12009는 24시간 경과 후 각각 0.2% 및 0.2%의 에탄올 생산량을 보였으며, 48시간 경과 후에도 그 값의 변화는 없었다. S.
- 0%의 상대적 에탄올 생산량을 보였다. 배양액에 furfural이 1 g/L 및 2 g/L 존재하는 경우, S. cerevisiae K35는 24시간 경과 후 11.0% 및 107.0%의 상대적 에탄올 생산량을, 48시간 경과 후 102.7% 및 100.9%의 상대적 에탄올 생산량을 보인 반면, P. stipitis KCCM 12009는 24시간 경과 후 각각 87.9% 및 71.3%의 상대적 에탄올 생산량을, 48시간 경과 후 102.6% 및 104.2%의 상대적 에탄올 생산량을 보였다. S.
- stipitis KCCM 12009에 동일한 농도의 저해물질이 존재시 저해영향의 차이를 보이는 것은 균주 자체의 특성 차이로 인한 저해물질에 대한 민감도를 나타내는 것으로 보인다. 본 연구를 통해 두 균주를 이용한 바이오에탄올 생산시 발생되는 저해물질의 농도별 선택적 특이성을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 목질계 바이오매스 전처리시 발생되는 저해물질의 적정농도를 확인할 수 있었다.
- 본 연구에 사용된 두 균주 모두 24시간 내에 100 g/L의 glucose를 모두 소비하였으며, 40 g/L 이상의 에탄올을 생산하였다. 저해물질로 퓨란 (5-HMF, furfural)류가 1-2 g/L 존재시, S. cerevisiae K35는 furfural에 비해 5-HMF에 의한 저해영향을 높았으며, P. stipitis KCCM 12009는 그와 반대의 경향을 보였다. Acetate가 5 g/L 이상 존재하는 경우, S.
- 저해물질이 첨가되지 않은 S. cerevisiae K35와 P. stipitis KCCM 12009의 발효 (reference fermentation)시, 24시간 내에 100 g/L의 glucose를 모두 소비했으며, 균체량 (cell growth)의 경우, 24시간 배양 후의 OD600값은 각각 약 15와 12, 48시간 배양 후에는 각각 약 16과 20의 값을 보였다. S.
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