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문제 정의
- 그중 이 연구에서 사용하는 세가지 PCR방법이 사람과 동물의 브루셀라 진단에 주로 이용되어 왔고 이 세가지 PCR을 비교하는 연구도 보고되었다(Navarro 등, 2002). 하지만 B. canis를 이용한 이들 세가지 PCR의 비교에 대한 보고가 없었으므로 본 연구에서는 B. canis DNA를 이용해 세 가지 다른 PCR 방법들의 민감도를 비교해 보았다. 이 연구에서 얻어진 세가지 PCR의 민감도는 기존의 보고와는 약간 다르게 나타났다.
제안 방법
- 21개 혈액은 2007년 춘천 군견훈련소에서 사육 후 강원대로 기증된 개에서 채혈하였고, 8개의 혈액은 2009년 유기견 센터에서 분양 받은 개에서, 7개의 샘플은 강원대학교 동물병원에서 사육하는 개에서 채혈하였다(총 36개의 샘플). 3ml의 혈액을 채혈하였고 2개의 튜브로 나누어 하나는 세균 배양용으로, 다른 하나는 3000~4000rpm으로 15분 원심분리하여 상층액은 혈청학적 진단용으로, 침전물은 DNA 추출용으로 각각 사용하였다.
- B. canis (ATCC23365)를 1.5% sheep blood 첨가 Trypticase soy agar에 접종한 뒤 37°C, 5% CO2에서 2일간 배양한 뒤 집락을 PBS로 현탁하여 genomic DNA분리 kit (Gentra Puregene Yeast/Bacteria kit, Qiagen, USA)을 이용하여 DNA를 추출하였다.
- B. canis에 대한 혈청학적 검사는 2-ME RSAT와 immunochromatographic assay (ICA)를 하였다. B.
- Genomic DNA Extraction Kit® (RBC, Taiwan)를 사용하여 혈액으로부터 제조회사에서 제공한 방법에 따라 Genomic DNA를 추출하였다.
- Primer는 각각 50 pmole씩을 첨가하였고 template로 사용한 DNA는 1µl씩을 첨가한 후, DNA thermal cycler (PTC-100, MJ Research)를 사용하여 PCR을 실시하였다.
- 개 혈액에서 Brucella 감염을 진단하기 위해 BCSP31, 16S rRNA 및 OMP-2를 증폭시키는 세가지 종류의 PCR을 실시하여 비교하였으며 이러한 PCR결과와 세균 분리 및 혈청학적 검사 결과를 비교하였다.
- 이 연구에서는 개에서 채취한 혈액을 사용하여 Brucella 진단에 가장 많이 사용되고 있는 세 종류의 PCR을 적용하였다. 또한 PCR결과를 세균배양 검사 및 다른 혈청학적 검사 결과와 비교하였다. 실험에 사용된 PCR 방법들은 B4/B5 primer를 이용하여 Brucella cell surface protein 31kDa 부위를 증폭시키는 PCR (BCSP PCR (Baily 등, 1992), F4/R2 primer를 이용하여 균의16S rRNA 서열부위를 증폭시키는 PCR (16S rRNA PCR, Romero 등, 1995a), 그리고 JPF/JPR primer를 이용하여 outer membrane protein 부위를 증폭시키는 PCR (omp-2 PCR, Leal-Klevezas 등, 1995)을 실시하여 이들의 결과를 비교하였다.
- 5µg/ ml, nystatin 100units/ml)가 포함된 Tryptic soy broth agar (TSA without glucose, BD)에 도말 접종 한 후 37℃ 5~10% CO2 배양기에서 3~5일간 배양하였다. 배지에서 자란 집락을 백금이로 채취하여 5% bovine serum이 포함된 TSA agar에 계대하여 증균시켜 oxidase, catalase, urease 검사와 이번 실험에서 사용된 세 가지 primer을 이용한 PCR로 확인하였다.
- 세 가지 종류의 PCR의 민감도(sensitivity)를 비교하기 위해 B. canis의 DNA를 정량적으로 측정한 후 단계 희석한 DNA를 template로 이용하여 PCR을 실시한 후 PCR product가 검출되는 범위를 비교하였다.
- 또한 PCR결과를 세균배양 검사 및 다른 혈청학적 검사 결과와 비교하였다. 실험에 사용된 PCR 방법들은 B4/B5 primer를 이용하여 Brucella cell surface protein 31kDa 부위를 증폭시키는 PCR (BCSP PCR (Baily 등, 1992), F4/R2 primer를 이용하여 균의16S rRNA 서열부위를 증폭시키는 PCR (16S rRNA PCR, Romero 등, 1995a), 그리고 JPF/JPR primer를 이용하여 outer membrane protein 부위를 증폭시키는 PCR (omp-2 PCR, Leal-Klevezas 등, 1995)을 실시하여 이들의 결과를 비교하였다.
- 우선 세가지 종류의 PCR의 민감도를 B. canis DNA를 template로 사용하여 측정하였다. Fig.
- 특히 개의 경우 유사산 및 생식기계 이상을 제외하고는 임상적으로 정상을 보이는 경우가 많아 정확한 진단이 쉽지 않다. 이 연구에서는 강원도 지역에서 사육된 개의 혈액을 사용하여 Rose Bengal test, rapid screening agglutination with 2-mercaptoethanol, immuochromatographic assay, Brucella-Ab C-ELISA의 혈청학적 검사와 균분리 및 세가지 PCR (BSCP, OMP-2, 16s rRNA)을 실시하여 각 진단법을 상호 비교하였다. 총 36개의 개의 혈액재료 중 혈청학적 검사는 모두 음성으로 나타났다.
- 이 연구에서는 개에서 채취한 혈액을 사용하여 Brucella 진단에 가장 많이 사용되고 있는 세 종류의 PCR을 적용하였다. 또한 PCR결과를 세균배양 검사 및 다른 혈청학적 검사 결과와 비교하였다.
- Negative control로서는 template DNA 대신에 해당하는 양만큼의 멸균 3차 증류수를 첨가하였다. 증폭 반응을 시킨 후 ethidium bromide로 염색시킨 1% agarose gel로 전기영동을 실시하였으며 DNA bands는 UV light 아래에서 image analyzer를 이용하여 촬영하였다.
- 총 36개의 혈액 샘플을 가지고 상기에 언급한 세가지 PCR과 세균 배양검사 및 혈청학적 검사 결과를 비교하였다. Table 2에서 나타난 바와 같이 36개의 혈액 재료는 혈청학적 검사 결과 및 세균 배양 검사 결과 모두 음성으로 나타났다.
- 침전물을 5% bovine serum이 포함된 Tryptic soy broth(BD, USA)에 분주해서 11일간 37℃ 5~10% CO2 배양기에서 배양한 후 Neutral red (0.03g/L), I-erythritol (1.0g/L), 항생제 (bacitracn 25units/ml, azotrenam 5µg/ml, nalidixic acid 5µg/ml, vancomycin 20µg/ml, amphoterinine B 2.5µg/ ml, nystatin 100units/ml)가 포함된 Tryptic soy broth agar (TSA without glucose, BD)에 도말 접종 한 후 37℃ 5~10% CO2 배양기에서 3~5일간 배양하였다.
대상 데이터
- 혈액 샘플은 강원도 춘천시 부근에 사육하는 개에서 채혈하였다. 21개 혈액은 2007년 춘천 군견훈련소에서 사육 후 강원대로 기증된 개에서 채혈하였고, 8개의 혈액은 2009년 유기견 센터에서 분양 받은 개에서, 7개의 샘플은 강원대학교 동물병원에서 사육하는 개에서 채혈하였다(총 36개의 샘플). 3ml의 혈액을 채혈하였고 2개의 튜브로 나누어 하나는 세균 배양용으로, 다른 하나는 3000~4000rpm으로 15분 원심분리하여 상층액은 혈청학적 진단용으로, 침전물은 DNA 추출용으로 각각 사용하였다.
- 혈액 샘플은 강원도 춘천시 부근에 사육하는 개에서 채혈하였다. 21개 혈액은 2007년 춘천 군견훈련소에서 사육 후 강원대로 기증된 개에서 채혈하였고, 8개의 혈액은 2009년 유기견 센터에서 분양 받은 개에서, 7개의 샘플은 강원대학교 동물병원에서 사육하는 개에서 채혈하였다(총 36개의 샘플).
이론/모형
- B. abortus를 위한 혈청학적 검사로서 B. abortus 항원을 사용하는 RBT와 B. abortus와 B. melitensis 항원을 사용하는 Brucella-Ab C-ELISA (Svanova, Sweden)를 제조회사의 첨부된 방법에 따라 실험하였다.
- canis에 대한 혈청학적 검사는 2-ME RSAT와 immunochromatographic assay (ICA)를 하였다. B. canis 의 M(-) strain을 이용한 2-ME RSAT의 항원은 국립수의과학검역원에서 항원을 분양받아 Carmichael과 Joubert(1987)의 방법에 따라 실험하였다. ICA는 Mateau-de-Antonio 등(1993)의 방법에 따라 만들어 놓은 Rapid C.
- canis 의 M(-) strain을 이용한 2-ME RSAT의 항원은 국립수의과학검역원에서 항원을 분양받아 Carmichael과 Joubert(1987)의 방법에 따라 실험하였다. ICA는 Mateau-de-Antonio 등(1993)의 방법에 따라 만들어 놓은 Rapid C. Brucella Ab test kit (Anigen, Korea)를 사용하였다.
성능/효과
- melitensis 항원을 사용한 CELISA). 2-ME RSAT와 ICA를 사용해 B. canis를 검사한 결과 모두 음성이 나왔고 RBT와 C-ELISA를 사용한 B. abortus와 B. melitensis검사 결과, 모두 음성이 나왔으며 세균 배양 역시 모두 음성으로 확인되어 모든 샘플에서 브루셀라증 음성임을 알 수가 있었다. 이렇게 낮은 음성률은 샘플대상이 된 개들이 비교적 위생적인 환경에서 자랐으며 번식과 상관없는 개들이어서 Brucella균에 노출될 가능성이 적었기 때문으로 사료된다.
- 1에서 나타난 것 같이 BCSP31 PCR의 경우 223bp, 16S rRNA PCR의 경우 905bp, OMP-2 PCR의 경우 193bp크기의 PCR 증폭 산물이 증폭되어 기존의 보고와 일치하였다. BCSP31 PCR의 민감도는 약 0.024fg까지 희석된 DNA template에서 PCR 산물이 검출된 반면, 16S rRNA 및 OMP-2 PCR에서는 2.4fg의 template DNA가 함유된 PCR에서 증폭 산물이 검출되어 BCSP31 PCR이 다른 두 종류의 PCR보다 높은 민감도를 나타냈다(Fig. 1).
- 4fg의 DNA까지 검출하여 BSCP31 PCR이 다소 높은 민감도를 나타냈다. 그러나 36개의 개 혈액에서 추출한 DNA를 사용하여 PCR을 한 결과 BSCP31과 OMP-2 PCR은 5개(13.9%)의 혈액재료에서 특이적인 밴드를 검출한 반면 16S rRNA PCR에서는 모두 음성으로 나타나 16S rRNA PCR이 혈청검사결과와 세균배양결과와 일치하였다. 따라서 개 혈액을 대상으로 직접 PCR을 실시할 경우 비특이적인 반응이 있음을 고려하여 단일 방법보다는 여러 방법을 사용하는 것이 진단의 정확성을 높일 수 있음을 확인하였다.
- Table 2에서 나타난 바와 같이 36개의 혈액 재료는 혈청학적 검사 결과 및 세균 배양 검사 결과 모두 음성으로 나타났다. 그러나 BCSP31과 OMP-2 PCR 결과 각각 5/36 (13.9%)가 양성으로 검출된 반면 16S rRNA PCR의 경우 모두 음성으로 나타나 혈청검사 결과와 세균 배양 결과와 일치하였다(Table 2, Fig. 2).
- 이는사육장에서 기르는 개들을 제외한 집안의 개들과 유기견들에서의 발생률에 대한 보고가 없는 것 (Bae와 Lee, 2009; 오와 박, 2001)과 일치하는 결과였다. 그러나 개 혈액 샘플에서 추출한 DNA를 이용해 direct PCR을 해본 결과 B4/B5 primer를 사용한 BCSP31 PCR에서는 36개의 샘플 중 5개의 양성(13.9%)을 보였고 JPF/JPR primer를 사용한 OMP-2 PCR에서도 5개의 혈액이 양성(13.9%)을 보였다. 두 종류의 PCR에서 의양성이 나온 각각의 5개 샘플들 중 한 샘플만을 제외하고 나머지 4개 샘플들은 동일한 혈액샘플들로 상당히 높은 일치도를 보임을 알 수 있었다 (Cohen’s Kappa=0.
- 두 종류의 PCR에서 의양성이 나온 각각의 5개 샘플들 중 한 샘플만을 제외하고 나머지 4개 샘플들은 동일한 혈액샘플들로 상당히 높은 일치도를 보임을 알 수 있었다 (Cohen’s Kappa=0.77).
- 9%)의 혈액재료에서 특이적인 밴드를 검출한 반면 16S rRNA PCR에서는 모두 음성으로 나타나 16S rRNA PCR이 혈청검사결과와 세균배양결과와 일치하였다. 따라서 개 혈액을 대상으로 직접 PCR을 실시할 경우 비특이적인 반응이 있음을 고려하여 단일 방법보다는 여러 방법을 사용하는 것이 진단의 정확성을 높일 수 있음을 확인하였다.
- 이로 미루어 보았을 때 BCSP31과 OMP-2 PCR의 민감도는 높은 편이나 혈액 샘플을 이용한 direct PCR법에서는 의양성이 많이 나오는 것을 알 수 있었다. 본 연구에서는 16S rRNA PCR이 다른 검사 결과와 일치하여 특이도가 높은 것으로 밝혀져 Navarro 등(2002)의 연구 결론에서 16S rRNA를 가장 유용한 방법으로 결론 내린 것과 일치하였다.
- 하지만 F4/R2 primer를 사용한 16S rRNA PCR은 36개의 혈액 샘플 모두 음성의 결과가 나와 혈청학적 검사와 세균 배양 검사와 일치하였다. 이로 미루어 보았을 때 BCSP31과 OMP-2 PCR의 민감도는 높은 편이나 혈액 샘플을 이용한 direct PCR법에서는 의양성이 많이 나오는 것을 알 수 있었다. 본 연구에서는 16S rRNA PCR이 다른 검사 결과와 일치하여 특이도가 높은 것으로 밝혀져 Navarro 등(2002)의 연구 결론에서 16S rRNA를 가장 유용한 방법으로 결론 내린 것과 일치하였다.
- 이 연구에서는 강원도 지역에서 사육된 개의 혈액을 사용하여 Rose Bengal test, rapid screening agglutination with 2-mercaptoethanol, immuochromatographic assay, Brucella-Ab C-ELISA의 혈청학적 검사와 균분리 및 세가지 PCR (BSCP, OMP-2, 16s rRNA)을 실시하여 각 진단법을 상호 비교하였다. 총 36개의 개의 혈액재료 중 혈청학적 검사는 모두 음성으로 나타났다. 또한 혈액을 사용한 균 분리동정도 모두 음성으로 나왔다.
- 77). 하지만 F4/R2 primer를 사용한 16S rRNA PCR은 36개의 혈액 샘플 모두 음성의 결과가 나와 혈청학적 검사와 세균 배양 검사와 일치하였다. 이로 미루어 보았을 때 BCSP31과 OMP-2 PCR의 민감도는 높은 편이나 혈액 샘플을 이용한 direct PCR법에서는 의양성이 많이 나오는 것을 알 수 있었다.
- 또한 혈액을 사용한 균 분리동정도 모두 음성으로 나왔다. 혈액에서 직접적인 PCR을 실시하기 위해 우선 세가지 종류의 PCR의 민감도를 조사한 결과, BCSP31 PCR은 0.024fg의 DNA까지 검출할 수 있는 반면, 16S rRNA와 OMP-2 PCR에서는 2.4fg의 DNA까지 검출하여 BSCP31 PCR이 다소 높은 민감도를 나타냈다. 그러나 36개의 개 혈액에서 추출한 DNA를 사용하여 PCR을 한 결과 BSCP31과 OMP-2 PCR은 5개(13.
후속연구
- 이러한 차이는 PCR에 사용되는 dNTPs, MgCl2, Taq polymerase 농도 등의 PCR 조성과 조건이 기존의 보고와 조금 다르기 때문이라 사료된다. 그리고 기존의 보고는 B. abortus와 B. melitensis DNA를 이용한 실험이었으나 이번 실험은 B. canis를 이용한 점도 영향이 있으리라 판단된다.
- 비록 이 연구에서는 혈청학적 검사 보다 direct PCR에서 약간의 의양성이 나왔지만 균혈증이 오래 지속되어 혈액에서 Brucella균을 검출 할 수 있는 개 혈액 샘플에서의 PCR 활용이 반드시 필요하므로 특이도가 높은 16S rRNA PCR 사용이 바람직하다고 사료된다.
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