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문제 정의
- 하지만 percoll을 정자 분리에 사용할 경우, 내독소에 의한 오염이나 정자 형태 변화를 유발하기 때문에 수정에 좋지 못한 영향을 미칠 수 있다는 보고들이 있다(Andersen과 Grinsted, 1997; De Vos 등, 1997; Scott와 Smith, 1997; Strehler 등, 1998). 이에 본 연구는 Park 등(2008)의 계속적인 연구의 일환으로 percoll을 이용한 정자 분리가 정자의 성상에 미치는 영향을 확인하고 또한 정자분리방법의 효율성을 확인하고자 하였다
제안 방법
- SYBR- 14와 PI로 구성된 Live/Dead kit는 형광색소의 살아 있는 세포막 투과의 차이로 생존율을 알아보는 방법으로 그린 색 형광을 띠는 SYBR-14는 살아 있는 세포막을 투과하여 핵이 형광 염색되고, 붉은색 형광을 띠는 PI는 세포막 투과성이 없어 죽은 세포나 막 손상을 입은 세포의 핵에만 형광 염색되는 특징을 이용하여 Flowcytometry로 형광의 발현 차를 분석하였다.
- 그러나 percoll이 인체에 사용하기에는 독성과 관련한 문제점들이 보고된 바가 있어 인공수정이나 체외수정을 위해서는 적합한 방법이 아니라고 밝히고 있는 연구 결과가 있기 때문에(Andersen와 Grinsted, 1997; De Vos 등, 1997; Scott와 Smith, 1997; Strehler 등, 1998) 이를 확인하고자 체외수정 실험을 실시하였다. 체외수정 실험 결과, percoll과 희석정액에서 총 분할율과 2세포기, 4세포기 및 4세포기 이상의 각 분할율에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
- 기존의 항생제 처리 정액과 본 연구를 통하여 생산된 무균 정액의 수정능력을 간접적으로 평가하기 위하여 도축장에서 공수해온 일반돼지 난소에서 채란된 난자를 이용하여 체외수정을 통해 초기배의 분할 능력을 평가하였다. 도축장으로부터 회수한 난소로부터 채란된 난자는 TCM-199에서 22시간씩 2차에 거쳐 총 44시간 동안 성숙 과정을 걸친 후 수정에 이용하였다.
- 도축장으로부터 회수한 난소로부터 채란된 난자는 TCM-199에서 22시간씩 2차에 거쳐 총 44시간 동안 성숙 과정을 걸친 후 수정에 이용하였다. 수정액은 m-TBM을 이#'하였으며, 난자는 0.
- 보완하여 CTC 염색을 통한 정자의 첨체 상태를 분석하였다. 실험 방법은 일반 희석 정자와 percoll에 의해 분리된 정자를 원심분리(1500 rpm, 5 min)하여 정자 부유액 792 111에 8 u1의 Hoechst 33258을 첨가하고 어두운 실온에서 3분간 배양시킨 후, 3%(w/v) polyvinyl- pyrolidone(PVP- 40; Sigma) 4 ml로 첨가시켜 실온에서 원심분리(1500 rpm, 5 min)하였다.
- 분리된 정자의 실질적인 수정능력을 확인하고자 체외수정을 통한 수정란의 분할율을 측정하였다. 그 결과 percoll에 의해 세균분리된 정자와 분리되지 않은 정자를 사용하여 수정된 배아에서 총 분할율(76.
- 실험 방법은 일반 희석 정자와 percoll에 의해 분리된 정자를 원심분리(1500 rpm, 5 min)하여 정자 부유액 792 111에 8 u1의 Hoechst 33258을 첨가하고 어두운 실온에서 3분간 배양시킨 후, 3%(w/v) polyvinyl- pyrolidone(PVP- 40; Sigma) 4 ml로 첨가시켜 실온에서 원심분리(1500 rpm, 5 min)하였다. 상층액 제거 후 재부유시킨 45 u1와 45 ill의 CTC solution를 첨가하여 염색하고 12.5%(w/v) paraformaldehyde 8 u1로 고정 후 slide glass에 10 pl 를 떨어뜨려 10 u1의 DABCO와 혼합해 표본을 제작하였다. 제작된 표본은 형광현미경 (400x)하에서 정자 두부 전체가 주황색으로 염색된 것은 수정능 획득 및 첨체 반응이 일어나지 않은 정자© pattern)로, 첨체 부위만 염색된 것은 수정능 획득은 일어났거나 첨체 반응이 일어나지 않은 정자(B pattern)^ 염색이 희미하거나 두부 적도 부위에 band가 형성된 것(AR pattern)은 수정능 획득과 첨체 반응이 일어난 정자로 판정하였다.
- 도축장으로부터 회수한 난소로부터 채란된 난자는 TCM-199에서 22시간씩 2차에 거쳐 총 44시간 동안 성숙 과정을 걸친 후 수정에 이용하였다. 수정액은 m-TBM을 이#'하였으며, 난자는 0.1% hyaluronidase를 사용하여 난구 세포를 적당히 제거시켜 준비한 후 percoll 처리한 정자와 일반 희석 정자를 체외수정하여 PZM-3로 48시간 동안 배양 후 분할률을 평가하였다.
- 보완하여 CTC 염색을 통한 정자의 첨체 상태를 분석하였다. 실험 방법은 일반 희석 정자와 percoll에 의해 분리된 정자를 원심분리(1500 rpm, 5 min)하여 정자 부유액 792 111에 8 u1의 Hoechst 33258을 첨가하고 어두운 실온에서 3분간 배양시킨 후, 3%(w/v) polyvinyl- pyrolidone(PVP- 40; Sigma) 4 ml로 첨가시켜 실온에서 원심분리(1500 rpm, 5 min)하였다. 상층액 제거 후 재부유시킨 45 u1와 45 ill의 CTC solution를 첨가하여 염색하고 12.
- 이상형태를 관찰하고 분석하였다. 실험 방법은 희석 정액 1 ml와 생리식염수에 5%의 FBS가 첨가된 용액 5 ml를 혼합시킨 후 500 g에서 10분간 원심분리하여 상층 액을 제거시킨 후 재부유시켰다. 정자 부유액의 200 pl 를 취하여 slide glass 위에 각각 50 u1의 정자 부유액을 옮겨 도말하고, 실온에서 완전히 건조시킨 후, 0.
- 또한, 돼지에 있어서 사출 직후의 정액 내에서 다양한 종의 세균이 발견되었으며, 이를 percoll로 분리하였을 때, 65% 이상의 percoll에서 효과적으로 제거가 되었다고 보고된 바가 있다(Park 등, 2008). 이에 근거하여 본 연구에서는 65%의 percoll에 의해 정자를 분리하였고 그 성상과 능력을 측정하였다.
- 때문에 희석액에 사용되는 항생제는 정자에게 영향을 미치지 않을 정도의 정량만을 사용하여 정액 내의 모든 세균을 억제하지 못하였고 이로 인해 인공수정을 통한 질병 이입의 위험을 가지게 되었다. 정액 내의 세균을 제거하기 위해가장 흔하게 사용하는 gentamicin을 처리하였으나 세균이 완전히 제거되지 못한 반면, percoll을 이용한 density gradient 방법 중 3 step 방법에서는 정액내의 세균이 완전히 제거되는 것으로 나타났다(Park 등, 2008) 이에 본연구는 percolK 이용한 정자 분리방법으로 정액 내의 세균을 제거하고 percoll을 통한 정자 분리 방법의 실효성을 검증 하였다.
- 실험 방법은 희석 정액 1 ml와 생리식염수에 5%의 FBS가 첨가된 용액 5 ml를 혼합시킨 후 500 g에서 10분간 원심분리하여 상층 액을 제거시킨 후 재부유시켰다. 정자 부유액의 200 pl 를 취하여 slide glass 위에 각각 50 u1의 정자 부유액을 옮겨 도말하고, 실온에서 완전히 건조시킨 후, 0.5 ill의 Rose-Bengal 염색액을 떨어뜨려 염색한 후 위상차 현미경(400x) 하에서 기형정자를 관찰하였다.
- 5%(w/v) paraformaldehyde 8 u1로 고정 후 slide glass에 10 pl 를 떨어뜨려 10 u1의 DABCO와 혼합해 표본을 제작하였다. 제작된 표본은 형광현미경 (400x)하에서 정자 두부 전체가 주황색으로 염색된 것은 수정능 획득 및 첨체 반응이 일어나지 않은 정자© pattern)로, 첨체 부위만 염색된 것은 수정능 획득은 일어났거나 첨체 반응이 일어나지 않은 정자(B pattern)^ 염색이 희미하거나 두부 적도 부위에 band가 형성된 것(AR pattern)은 수정능 획득과 첨체 반응이 일어난 정자로 판정하였다.
이론/모형
- 기형율 검사는 Rose-Bengal 염색 방법을 이용하여 정자의 이상형태를 관찰하고 분석하였다. 실험 방법은 희석 정액 1 ml와 생리식염수에 5%의 FBS가 첨가된 용액 5 ml를 혼합시킨 후 500 g에서 10분간 원심분리하여 상층 액을 제거시킨 후 재부유시켰다.
- 생존율은 Live/Dead kit(Maxwell 과 Johnson, 1997) 로정자를 형광 염색하여 flow cytometry로 분석하였다. SYBR- 14와 PI로 구성된 Live/Dead kit는 형광색소의 살아 있는 세포막 투과의 차이로 생존율을 알아보는 방법으로 그린 색 형광을 띠는 SYBR-14는 살아 있는 세포막을 투과하여 핵이 형광 염색되고, 붉은색 형광을 띠는 PI는 세포막 투과성이 없어 죽은 세포나 막 손상을 입은 세포의 핵에만 형광 염색되는 특징을 이용하여 Flowcytometry로 형광의 발현 차를 분석하였다.
성능/효과
- Percoll에 의해 분리된 정자와 일반희석정액의 생존율을 Flow cytometry로 분석한 결과(Fig. 1) 채취 1일 후의 정자를 percoll로 분리한 결과 더 높은 비율을 나타냈지만 유의적인 차이는 보이지 않았다. 정액 3일 이상 보존 후 percol로 분리한 결과에서는 일반희석정액(59.
- 분리된 정자의 실질적인 수정능력을 확인하고자 체외수정을 통한 수정란의 분할율을 측정하였다. 그 결과 percoll에 의해 세균분리된 정자와 분리되지 않은 정자를 사용하여 수정된 배아에서 총 분할율(76.68 vs 73.32%)과 2세포기(9.25 vs 11.88%), 4세포기(26.76 vs 24.51%) 및 4 세포기 이상(63.99 vs 63.61%)의 각 분할율에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다(Table 1).
- 본 연구에서 percoll에 의해 분리된 정자의 생존율을 일반 희석 정액과 비교실험한 결과, 채취 3일 후의 정액을 percoll로 분리하였을 때 정자의 생존율이 유의적으로 더 높게 나타났다. 채취 1일 후의 정액에서는 유의적인 차이는 보이지 않았지만 percoll로 분리한 경우의 생존율이 더 높았다.
- 연구 결과를 총 요약하자면, 정자 성상을 분석한 결과, percoll에 의해 분리된 정자의 경우 일반희석정액에 비해 정자 성상이 좋은 결과를 보였다. 이와 같은 결과로 미루어 볼 때 percoll을 이용한 분리효과가 세균 분리 효과뿐만 아니라 질 좋은 정자를 분리 선별하는데 효과적인 것을 알 수 있었다.
- 성상이 좋은 결과를 보였다. 이와 같은 결과로 미루어 볼 때 percoll을 이용한 분리효과가 세균 분리 효과뿐만 아니라 질 좋은 정자를 분리 선별하는데 효과적인 것을 알 수 있었다. 또한, 수정된 난자의 분할 정도는 유의적으로 비슷한 수치를 보였다.
- 이와 같은 결과는 기형 정자는 운동성이 거의 없으므로 점성이 있는 percoll을 침전하여 통과하지 못하기 때문이라고 생각된다. 이와 같이 정자 성상 검사 결과를 통해 percoll에 의한 분리방법은 질 좋은 정자의 분리에 보다 효과적이라는 사실을 알 수 있다. 또한, 이 같은 사실은 3일차의 정액에서 보다 확실하게 나타났으므로 저장 기간이 길수록 더 확실한 효과를 얻을 수 있다고 생각된다.
- 1) 채취 1일 후의 정자를 percoll로 분리한 결과 더 높은 비율을 나타냈지만 유의적인 차이는 보이지 않았다. 정액 3일 이상 보존 후 percol로 분리한 결과에서는 일반희석정액(59.0±4.4%) 에 비해 percoll로 분리한 정자(83.6±2.0%)가 유의적으로 (JX0.05) 생존율이 높게 나타났다(Fig. 2).
- 정자 성상검사를 통하여 percoll에 의해 분리된 정액의 질을 분석한 결과, 효과적으로 좋은 질의 정자를 분리하였다. 분리된 정자의 실질적인 수정능력을 확인하고자 체외수정을 통한 수정란의 분할율을 측정하였다.
- 정자의 기형율을 분석한 결과 중 3일간 보존된 정액에서 percoll에 의해 분리된 정자(16.8±2.8%)가 일반 비처리정자(20.2±0.4%)에 비해 유의적으로.05) 낮은 기형율을 보였다. 한편, 채취 1일 후의 정액에서는 percoll로 분리된 정자에서 기형율이 더 낮게 나타났지만 유의적인 차이는 인정되지 않았다(Fig.
- 정자의 수정능력과 직접적인 연관성이 있는 정자의 첨체 막의 상태를 분석하기 위하여 CTC 형광 염색 방법을 이용하여 분석한 결과 percoll로 분리한 정자(8.1±0.6%)의 AR pattern에서 percoll 비처리 정액(13.6±0.8%)에 W 해 유의적으로(p<0.05) 낮게 나타났다. 그러나 F와 B pattern 에서는 percoll로 분리한 정자가 percoll 비처리 정자에 비해 높게 나타났으나, 유의차는 인정되지 않았다(Fig.
- 나타났다. 채취 1일 후의 정액에서는 유의적인 차이는 보이지 않았지만 percoll로 분리한 경우의 생존율이 더 높았다. 이 같은 사실은 percolK 통해서 정자를 분리하였을 때에 죽은 정자를 효과적으로 분리할 수 있다는 것을 말해준다.
- 마지막 성상 검사인 기형 율 검사 결과 또한 percoll에 의해 정자를 분리한 경우에 보다 낮은 수치를 보여주었다. 채취 3일 후의 정자에서 percoll로 분리한 정자와 일반 희석 정액간에 유의적인 차이가 나타났으나, 채취 1일 후의 정액에서는 유의적인 차이는 보이지 않았다. 이와 같은 결과는 기형 정자는 운동성이 거의 없으므로 점성이 있는 percoll을 침전하여 통과하지 못하기 때문이라고 생각된다.
- 체외수정 실험을 실시하였다. 체외수정 실험 결과, percoll과 희석정액에서 총 분할율과 2세포기, 4세포기 및 4세포기 이상의 각 분할율에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 이는 percoll에 의한 정자분리 방법이수정율과 배반포율의 향상에 효과적인 방법 (Parrish 등, 1995)이라고 보고한 내용과는 상반되는 결과이다.
후속연구
- 생산에 도움을 줄 수 있을 것이라 기대된다. 또한 현장에서의 실용성을 확인하기 위해 persU에 의한 분리 방법을 거친 정액을 이용하여 가축으로의 실제 인공수정을 실시하고 산자를 얻" 개체에 직접적으로 미치는 영향을 확인하는 연구가 필요할 것이라 생각된다.
- 본 연구를 통해 percoll에 의해 정액 내 세균을 효과적으로 분리한 정액의 사용은 인공수정 시에 가축으로의 질병이 입의 위험을 배제시킬 수 있고, 항생제의 사용을 줄일 수 있어 실제 농가에서의 인공수정과 안전한 축산물 생산에 도움을 줄 수 있을 것이라 기대된다. 또한 현장에서의 실용성을 확인하기 위해 persU에 의한 분리 방법을 거친 정액을 이용하여 가축으로의 실제 인공수정을 실시하고 산자를 얻" 개체에 직접적으로 미치는 영향을 확인하는 연구가 필요할 것이라 생각된다.
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