This work was conducted to establish an efficient plant regeneration system for genetic transformation and the in vitro conservation of Sedum sarmentosum genetic resources. Effects of glutamine and $AgNO_3$ on plant regeneration between two genotypes were investigated using MS media suppl...
This work was conducted to establish an efficient plant regeneration system for genetic transformation and the in vitro conservation of Sedum sarmentosum genetic resources. Effects of glutamine and $AgNO_3$ on plant regeneration between two genotypes were investigated using MS media supplemented with 0.2 mg/L NM and 3.0 mg/L BA. Calluses were formed on leaf explants placed on MS solid media supplemented with 3 mg/L 2,4-D and 1 mg/L BA. Calluses of Keumsan local strain produced shoots at a frequency of up to 100% after 50 days of culture on medium supplemented with glutamine. The highest number of shoots per callus was 17.6 at 350 mg/L glutamine. However, calluses of Wanju local strain gave rise to no shoots under the same culture conditions. Likewise, calluses of Keumsan local strain produced shoots at a frequency of up to 100% after 50 days of culture on medium supplemented with $AgNO_3$ whereas Wanju local strain sporadically produced shoots. The highest number of shoots per callus of Keumsan local stain was 16.1 at $15{\mu}M$$AgNO_3$. Regenerated shoots were subcultured on hormone-free MS medium for rooting and shoot growth, and then 3-5 cm high plantlets were transplanted to the artificial soils comprising vermiculite and perlite, where they survived at a frequency of 88-100%. After being transplanted into upland soil:sand (1:1, v/v) in a greenhouse, regenerated plants showed a morphologically normal growth.
This work was conducted to establish an efficient plant regeneration system for genetic transformation and the in vitro conservation of Sedum sarmentosum genetic resources. Effects of glutamine and $AgNO_3$ on plant regeneration between two genotypes were investigated using MS media supplemented with 0.2 mg/L NM and 3.0 mg/L BA. Calluses were formed on leaf explants placed on MS solid media supplemented with 3 mg/L 2,4-D and 1 mg/L BA. Calluses of Keumsan local strain produced shoots at a frequency of up to 100% after 50 days of culture on medium supplemented with glutamine. The highest number of shoots per callus was 17.6 at 350 mg/L glutamine. However, calluses of Wanju local strain gave rise to no shoots under the same culture conditions. Likewise, calluses of Keumsan local strain produced shoots at a frequency of up to 100% after 50 days of culture on medium supplemented with $AgNO_3$ whereas Wanju local strain sporadically produced shoots. The highest number of shoots per callus of Keumsan local stain was 16.1 at $15{\mu}M$$AgNO_3$. Regenerated shoots were subcultured on hormone-free MS medium for rooting and shoot growth, and then 3-5 cm high plantlets were transplanted to the artificial soils comprising vermiculite and perlite, where they survived at a frequency of 88-100%. After being transplanted into upland soil:sand (1:1, v/v) in a greenhouse, regenerated plants showed a morphologically normal growth.
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문제 정의
본 연구는 돌나물 유전자원 기내보존을 위한 식물체 분화 체계를 확립히기 위하여, 형태적 특성이 다른 두 수집 계통간 식물체 분화에 미치는 glutamine 및 AgNCh의 영향과 토양활착에 미치는 인공배양토의 영향을 조사하기 위하여 실시하였다.
제안 방법
ID). 30일간 자란 재분화 식물체는 인공 배양토를 채운 72구 트레이로 이식하여 20일 째의 생존율과 강모래와 밭흙 (1:1)의 혼합토를 넣은 삽목상자에 정식하여 30일째의 초장을 조사하였다 (Table 3). 이식후 20째의 생존율은 perlite 단독처리구를 제외한 vermiculite 단독처 리구와 perlite와의혼합구에서 98%이상의 높은 생존율을 보였다.
뿌리에 묻은 배지성분을 제거하였다. 72구 트레이에 vermiculite 와 perlite를 단독 또는 혼합하여 채운 후 한 캘러스 유래의 식물체들을 모듬으로 각각의 트레이 셀에 이식하였다. 식물체 관리는 처음 5일 동안은 측광이 들어오는 실내에서 비닐을 씌워서 90% 정도의 과습상태로 유지하였다가, 2일 간격으로 서서히 노출시켜, 10일후 비닐을 제거한 다음, 온실로 옮겨 70% 차광막을 이용하여 3일간 둔 다음, 오전 9~ 10시와 오후 16~ 18시 전후의 약한 햇빛을 쪼여가며 순화시켰다.
돌나물 (Sedum sarme)의 형질전환 및 유전자원 기내보존을 위한 효율적인 식물체 분화 체계를 확립하기 위하여, 잎절편 유래의 캘러스로부터 식물체 분화에 미치는 glutamine과 AgNCh의 영향과 분화 식물체의 순화 후 생존율을 조사하였다. 캘러스 유도는 3 mg/L 2, 4-D와 1 mg/L BA, 식물체 분화는 0.
두 수집종간 캘러스로부터 식물체 분화에 미치는 glutamine과 AgNQ, 첨가의 영향을 조사하기 위하여, 잎 절편으로부터 캘러스 유도는 MS 배지에 3 mg/L 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D), 1 mg/L 6-benzyladenine (BA)를 첨가한 캘러스용 배지 (Ahn and Lee 2004)를 이용하여, 25±2℃ 에서 암배양하였다. 배양 40일 후 형성된 캘러스 중 균일한 크기의 것만을 재분화 배지에 이식하였다.
부정아를 얻기 위하여 생장조절제를 첨가하지 않은 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)를 20 mL씩 분주한 샤레에, 줄기상부에서 잎을 제거하고 10 mm 길이로 마디를 잘라 샤레당 20개씩치상하였다. 3~4회 계대배양 후 새로 발생한 5 cm 크기의 신초에서잎을 채취하여 2x5 mm 크기로 잘라 배양 절편체로 이용하였다.
식물체 분화에 미치는 glutamine의 영향을 알아보기 위하여, 금산과 완주 수집종 돌니물의 마디배양으로부터 부정아를 발달시 킨 다음, 생장조절제를 첨가하지 않은 MS배지로 옮겨 30일간 생장 시켜 어린 잎으로부터 캘러스를 얻었다 (Fig. 1A, B). 균일하게 자란 어린 잎 유래 캘러스를 선별하여 glutamine을 첨가한 재분화 배지에 옮긴 후 30일과 50일째에 식물체 분화율과 캘러스당 식물체 수를 조사한 결괴; 금산 수집종은 식물체 분화가 빠르게 진행되어, 30 일 경에 다수의 식물체를 관찰할 수 있었다 (Fig.
식물체 관리는 처음 5일 동안은 측광이 들어오는 실내에서 비닐을 씌워서 90% 정도의 과습상태로 유지하였다가, 2일 간격으로 서서히 노출시켜, 10일후 비닐을 제거한 다음, 온실로 옮겨 70% 차광막을 이용하여 3일간 둔 다음, 오전 9~ 10시와 오후 16~ 18시 전후의 약한 햇빛을 쪼여가며 순화시켰다. 육묘 트레이에 옮긴 후 20일째에 생존율을 조사한 후, 강모래와 밭흙 (1:1)을 채운 삽목상자 (48x33x8.6 cm)에 5x8 cm 간격으로 32개체씩 정식하여 온실에서 관리하였다. 정식 30일 후에 중앙부의 10개체에 대한 초장을 5반복 조사하였고, 형태적 특성을 모식물과 비교하였다.
2 mg/L NAA, 3 mg/L BA를 첨가한 MS 배지를 이용하였다. 재분화 배지에 L-glutamine (Duchefa Co. Netherlands)을 0, 150, 250, 350, 500 mg/L를 첨가하여, 샤레당 12개의 캘러스를 5반복으로 옮겨 배양하였다. AgNO3 (Duchefa Co.
6 cm)에 5x8 cm 간격으로 32개체씩 정식하여 온실에서 관리하였다. 정식 30일 후에 중앙부의 10개체에 대한 초장을 5반복 조사하였고, 형태적 특성을 모식물과 비교하였다.
치상 재료는 줄기가 가늘고 꽃이 잘피는 금산 수집종과 줄기가굵고 꽃이 거의 피지 않는 완주 수집종을 원광대학교 포장에 삽목하여, 이듬해 봄에 새로 자란 신초를 채취하여 70% 에탄올에 30초간, 1% sodium hypochlorite에 20분간 소독한 디음, 멸균수로 4회 세척하였다. 부정아를 얻기 위하여 생장조절제를 첨가하지 않은 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)를 20 mL씩 분주한 샤레에, 줄기상부에서 잎을 제거하고 10 mm 길이로 마디를 잘라 샤레당 20개씩치상하였다.
분화 식물체의 순화 후 생존율을 조사하였다. 캘러스 유도는 3 mg/L 2, 4-D와 1 mg/L BA, 식물체 분화는 0.2 mg/L NAA와 3.0 mg/L BA를 각각 첨가한 MS배지를 사용하였다. 금산 수집종에서 glutamine 첨가는 50일째에 100%의 식물체 분화를 보였으며, 350 mg/L glutamine 첨가시 캘러스당 17, 6개의 가장 많은 식물체가 분화되었다.
대상 데이터
부정아를 얻기 위하여 생장조절제를 첨가하지 않은 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)를 20 mL씩 분주한 샤레에, 줄기상부에서 잎을 제거하고 10 mm 길이로 마디를 잘라 샤레당 20개씩치상하였다. 3~4회 계대배양 후 새로 발생한 5 cm 크기의 신초에서잎을 채취하여 2x5 mm 크기로 잘라 배양 절편체로 이용하였다.
이론/모형
배양 40일 후 형성된 캘러스 중 균일한 크기의 것만을 재분화 배지에 이식하였다. 재분화 배지도 Ahn과 Lee(2004)의 방법에 따라 0.2 mg/L NAA, 3 mg/L BA를 첨가한 MS 배지를 이용하였다. 재분화 배지에 L-glutamine (Duchefa Co.
4개로 가장 많아 대조 구보다 유의한 증가를 보였다. 50일째에는 모든 캘러스에서 식물체가 분화되었으며, 250 mg/L 이상의 glutamine 첨가배지에서 유의한 증가를 보였고, 350 mg/L에서 캘러스당 식물체수가 17.6개로 가장 많았다 반면 완주 수집종에서는 50일째까지도 식물체가 전혀 분화되지 않았으며, 대조구와 마찬가지로 glutamine 첨가에 관계없이 식물체 분화가 이루어지지 않았는데 (data not shown), 이는 유전자형의 차이로 생각되었다. 질소원으로서 glutaminee 약배양이나 체세포 배 발생에 많이 이용된다.
1C). Glutamine 첨가농도에 따른 식물체 분화율은 66~96%로 350 mg/L 첨가 배지에서 가장 높았으며, 250 mg/L 이상의 농도에서는 처리간에 유의한 차이를 보이지 않았다 (Table 1), 30일째에는 glutamine의 첨가량이 증가할수록 캘러스당 식물체수가 증가하는 경향을 보였으며, 350 mg/L에서 캘러스당 식물체수가 11.4개로 가장 많아 대조 구보다 유의한 증가를 보였다. 50일째에는 모든 캘러스에서 식물체가 분화되었으며, 250 mg/L 이상의 glutamine 첨가배지에서 유의한 증가를 보였고, 350 mg/L에서 캘러스당 식물체수가 17.
0 mg/L BA를 각각 첨가한 MS배지를 사용하였다. 금산 수집종에서 glutamine 첨가는 50일째에 100%의 식물체 분화를 보였으며, 350 mg/L glutamine 첨가시 캘러스당 17, 6개의 가장 많은 식물체가 분화되었다. AgNO3 첨가배지에서도 금산 수집종은 100% 식물체 분화를 보였으며, 15 nM 첨가배지에서 캘러스당 16.
돌나물의 식물체 분화에 미치는 AgNO3 영향을 계대배양 50일 째에 조사한 결과 (Table 2), 금산 수집종의 식물체 분화율은 공시한 캘러스에서 식물체가 100% 분화되어 AgNOa 처리간에 차이가 없었다. 10-30 nM AgNO3 첨가배지에서 캘러스당 식물체수는 대조 구보다 유의한 증가를 보였다.
1994). 본 연구에서도 AgNOj 무첨가 배지보다 10-30 |1M AgNO3 첨가배지에서 금산 수집종의 식물체 분화 수가 유의하게 증가하였고, 식물체 분화가 잘 안되는 완주 수집 종에서도 소수의 식물체 분화가 이루어지는 것으로 보아 AgNQ의효과를 인정할 수 있었다. 따라서 돌나물 식물체 분화효율을 증대시키기 위한 적정 AgNOs 첨가량은 캘러스당 16.
완주 수집종은 glutamine 첨가에 관계없이 식물체가 전혀 분화되지 않았고, 5-25 nM AgNO, 첨가배지에서만 소수의 식물체가 분화되었다. 분화 식물체는 생장조절제를첨가하지 않은 MS배지로 옮겨 shoot 생장과 발근을 유도한 다음, vermiculite와 perlite를 혼합한 인공토양에서 순화시킨 결과 88-100% 의 생존율을 보였다. 생존 식물체들은 강모래:밭흙 (1:1, v/v)을 혼합한 토양에 정식한 후에도 양호한 생장을 보였으며, 모식물과 형태적으로 차이가 없었다.
30일간 자란 재분화 식물체는 인공 배양토를 채운 72구 트레이로 이식하여 20일 째의 생존율과 강모래와 밭흙 (1:1)의 혼합토를 넣은 삽목상자에 정식하여 30일째의 초장을 조사하였다 (Table 3). 이식후 20째의 생존율은 perlite 단독처리구를 제외한 vermiculite 단독처 리구와 perlite와의혼합구에서 98%이상의 높은 생존율을 보였다. Perlite 단독처리에서는 처리구중 유의하게 낮은 88%의 생존율을 보였는데, 이는 재분화 돌나물의 뿌리가 아주 가늘어 perlite 입자공극 사이에서 순화초기에 수분흡수가 잘 이루어지지 않았던 것으로 보인다.
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