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문제 정의
- , 2008; Lim, 2007). 따라서 현 연구에서는 10주동안 실험동물에 홍삼 조사포닌를 투여하면서 또한 디젤배기가스 입자를 알러지 항원과 함께 생쥐 기도내에 병행 투여하여 천식성 호산구성 기도염증과 기도과민성을 유발하고, 이에 대한 홍삼 조사포닌의 투여효과를 조사하였다.
제안 방법
- 기도저항 수치 Pehn 값은 Biosystem XA software (Buxco Research System, Wilmington, USA)를 이용하여 자동 계산되었다. 10주간 가정분진 입자의 기도내 투여와 마지막 2.5% OVA inhallation 24시간 후에, 농도별 methacholine (MCH)수용액을 50, 25, 12,5 6.25, 3.125 ㎎/㎖의 농도로 aerosol하고, 각각의 농도에 대한 기도의 반응성은 10분 동안 연속적으로 검사하였다.
- 5로 조정한 후 원심분리 (1000 rpm × 5분)하여 사용하였다. OVA + DEP 처리군 및 OVA + DEP + 홍삼조사포닌 처리군은 DEP를 기도내에 투여하기 14일과 7일전에 OVA/alum 용액 0.2 ㎖씩 생쥐 복강내로 2회 투여하였고, DEP를 기도내 투여하기 11일과 2일전에는 1% OVA용액 0.1 ㎖씩 생쥐 복강 내로 2회 투여하였다. 또한 250x300x250 mm의 polycarbonate재질 (DJ-435, Daejong Inc, Korea) chamber안에서 10주동안 일주일에 한번, 일일에 30분 Buxco Aersol Dilivery System (NE-CT10, Buxco Co.
- 다시 2회 수세 후 완충 용액으로 세척한 다음 Avidin-HRP conjugated antibody 100 ㎕를 처리하고, 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. Tetramethylbenzidine 기질을 100 ㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 100 ㎕의 stop 용액을 처리한 후 ELISA reader를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하고 그 함량을 계산하였다.
- 4)으로 1 ㎎/㎖의 농도가 되도록 suspension을 만든 다음, −4℃로 유지하면서 초음파 세포분쇄기 (Tomy UD-201, Tokyo, Japan)로 50% 최대 출력하에 5분 동안 sonication하였다. 가정분진 투여군 생쥐를 10% chloral hydrate로 마취한 다음, 기도내 투여용 cannula을 이용하여 그 가정분진입자 suspension 1 ㎎/㎖ 용액 100 ㎕를 10주 동안 일주일에 1회 기도내로 투여하였고, OVA 처리는 0.05% Tween 80을 함유한 50 mM PBS 용액 (pH 7.4)만을 기도내로 투여하였다.
- 동물사육실의 조건은 conventional system으로 온도는 20 ± 2℃, 습도는 40-60%, 환기는 1시간당 12-15회로 하였으며, 1일중 12시간은 200-300 Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다.
- 1 ㎖씩 생쥐 복강 내로 2회 투여하였다. 또한 250x300x250 mm의 polycarbonate재질 (DJ-435, Daejong Inc, Korea) chamber안에서 10주동안 일주일에 한번, 일일에 30분 Buxco Aersol Dilivery System (NE-CT10, Buxco Co. USA)를 이용하여 6주간은 1% OVA 용액, 그리고 마지막 4주간은 2.5% OVA 용액을 aerosol화하여 분무하였다.
- (Eumsung, Korea)에서 구입한 Balb/c계 생쥐로 수컷만을 이용하였다. 생쥐를 정상군, OVA + DEP 처리군 및 OVA + DEP + 홍삼조사포닌 처리군 세 그룹으로 나누고 한 그룹당 16마리씩 사육하여 기도과민성 측정 등에 8마리씩 사용하였고, 혈액과 기도폐 세정액 채취 및 분석에 8마리씩 사용하였다. 동물사육실의 조건은 conventional system으로 온도는 20 ± 2℃, 습도는 40-60%, 환기는 1시간당 12-15회로 하였으며, 1일중 12시간은 200-300 Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다.
- 기도폐세정액 (BALF)은 37℃에서 주사기로 10% FBS DMEM 배양액을 기도에 주입하여 얻었으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 이 폐세정액의 세포를 Cytospin centrifuge (Cellspin, Hanil, Korea)를 이용하여 슬라이드 글라스 위에 도말하고 Diff-Quik로 염색하여 호산구의 세포수를 조사하였다. 폐 세정액의 상층액은 −70℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 즉 가정분진 입자를 0.05% Tween 80을 함유한 50 mM 인산완충 생리식염수 용액 (PBS pH 7.4)으로 1 ㎎/㎖의 농도가 되도록 suspension을 만든 다음, −4℃로 유지하면서 초음파 세포분쇄기 (Tomy UD-201, Tokyo, Japan)로 50% 최대 출력하에 5분 동안 sonication하였다.
- 투여 절차가 끝난 생쥐는 10% chloral hydrate를 복강내에 투여한 후 혈액을 심장채혈법으로 포집하고, 원심분리 (3,000 rpm × 10분)하여 혈청을 얻었으며, 혈청은 −70℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 폐세정액에서 interleukin (IL)-4, IL-5, IL-13의 함량과 interferon (IFN)-gamma ELISA kit는 Biosource사 (Invitrogen, USA)것을 사용하였고, 혈액으로 유리한 히스타민 함량은 Beckman Coulter사 (Fullerton, USA) 제품과 혈액에서 immunoglobulin-E (IgE)의 함량은 Shibayagi사(Shibukawa, Japan) 제품의 monoclonal antibody-based mouse interleukin ELISA kit를 이용하여 측정하였다. 즉 각 well에 천식유발 생쥐의 혈청과 폐세정액 100㎕씩을 각각 분주하고, 1시간 동안 실온에서 방치한 후 2회 washing 완충 용액으로 세척한 다음 biotin-conjugated antibody를 넣고 30분간 방치하였다.
- 홍삼의 조사포닌은 KT&G 중앙연구원 인삼연구소에서 제조한 것을 구입하여 실험에 사용하였다. 홍삼의 조사포닌의 실험동물에 투여는 10주동안 1주일에 5일 75 ㎎/㎏으로 식도내로 투여하였다.
대상 데이터
- 4% 이상 배합사료)를 사용하였다. 그리고 cage는 polycarbonate재질로 만든 것을 사용하였으며 깔집은 (주)JRS (MK-2000 Corncob, Germany) 제품을 사용하였다. 실험동물의 사육과 모든 과정은 국제 동물이용관리 위원회 지침에 준하여 실시하였다.
- 디젤배기가스입자는 일본 국립환경연구소 대기영향평가팀 Sagai 박사님의 도움으로 구입하였다. 즉 일본 이쯔즈 자동차 주식회사 4JB1형 2740 cc 4기통직분사식 디젤엔진을 1500 rpm, 10 torque (10 ㎏/m)의 부하조건하에서 운전했을때 생기는 배기미립자 (DEP)를 glass fiber filter로 포집하고 −20℃로 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 본 연구에서 사용된 실험동물은 Daehan Biolink Co. (Eumsung, Korea)에서 구입한 Balb/c계 생쥐로 수컷만을 이용하였다. 생쥐를 정상군, OVA + DEP 처리군 및 OVA + DEP + 홍삼조사포닌 처리군 세 그룹으로 나누고 한 그룹당 16마리씩 사육하여 기도과민성 측정 등에 8마리씩 사용하였고, 혈액과 기도폐 세정액 채취 및 분석에 8마리씩 사용하였다.
- 동물사육실의 조건은 conventional system으로 온도는 20 ± 2℃, 습도는 40-60%, 환기는 1시간당 12-15회로 하였으며, 1일중 12시간은 200-300 Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다. 실험동물의 사료는 (주)삼양사 (Seoul, Korea) 제품의 고형사료 (조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4% 이상 배합사료)를 사용하였다. 그리고 cage는 polycarbonate재질로 만든 것을 사용하였으며 깔집은 (주)JRS (MK-2000 Corncob, Germany) 제품을 사용하였다.
- 즉 일본 이쯔즈 자동차 주식회사 4JB1형 2740 cc 4기통직분사식 디젤엔진을 1500 rpm, 10 torque (10 ㎏/m)의 부하조건하에서 운전했을때 생기는 배기미립자 (DEP)를 glass fiber filter로 포집하고 −20℃로 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 홍삼의 조사포닌은 KT&G 중앙연구원 인삼연구소에서 제조한 것을 구입하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, 데이터 분석은 StatView version (4.0 Abacus Concepts, Inc. Berkeley, CA)을 이용하였고, Fisher's protected least significant difference test 혹은 Scheffe's F test에 의해 두 처리군 사이에 p 값이 0.05보다 작은 값을 나타내었을 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
- 가정분진 입자의 기도내 투여는 Lim 등의 방법 (1998)에 준하여 실시하였다. 즉 가정분진 입자를 0.
- 기도과민성의 측정은 whole body plethysmographs인 Biosystem XA (Buxco research system, Wilmington,NC, USA) 장비를 사용하여 Finotto등 (2001)의 방법에 따라 실시 하였다. 기도저항 수치 Pehn 값은 Biosystem XA software (Buxco Research System, Wilmington, USA)를 이용하여 자동 계산되었다.
- 실험동물에 Ovalbumin (OVA: Sigma St. Louis, MO) 감작화 및 흡입은 Hammad 등 (2004)의 방법에 따라 실시하였다. 즉 OVA/alum 용액은 먼저 50 mM PBS용액 (pH 7.
- 그리고 cage는 polycarbonate재질로 만든 것을 사용하였으며 깔집은 (주)JRS (MK-2000 Corncob, Germany) 제품을 사용하였다. 실험동물의 사육과 모든 과정은 국제 동물이용관리 위원회 지침에 준하여 실시하였다.
성능/효과
- 그러나 장기간 홍삼사포닌의 투여는 약간의 IFN-γ의 함량을 증가시키는 경향만을 나타내었으나, OVA 감작화와 함께 디젤배기가스 입자를 투여했을 때 증가하는 폐세 정액의 IL-4, IL-5와 IL-13의 함량을 감소시킬 수 있는 가능성을 나타내었다.
- 따라서 생쥐에게 장기간 디젤배기가스입자를 OVA 감작화와 함께 기도내로 투여했을 때 혈액에서 기도내로 침윤하는 세포수가 크게 증가하며 그 중에서도, 특히 호산구수가 급증하는 것으로 보아 OVA + DEP 처리군은 항원으로 인한 기관지 천식성 만성염증이 생쥐에 유발된 것을 알 수 있었다. 그러나 홍삼사포닌의 투여는 장기간 OVA 감작과 함께 기도내 DEP 투여에 의해 증가하는 폐의 무게를 완화시킬수 있는 경향을 보이며, 혈액에서 기도내로 침윤하는 염증세포수도 크게 감소시키고, 또한 천식성 만성염증의 특징인 기도내 호산구의 침윤을 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서 생쥐에 홍삼사포닌의 장기간 투여는 디젤배기가스입자에 의한 기관지 천식 발증의 기본 병태인 염증세포의 침윤과 부종과 함께 기관지선의 비대를 완화시킬 수 있는 가능성이 있다는 것을 나타내는 결과라고 생각된다.
- 그리고 OVA + DEP + 홍삼조사포닌 처리군에서의 Pehn 값은 각각 0.77, 1.49, 2.26, 3.22, 4.23으로 MCH 분무농도 25.0 ㎎/㎖부터 정상군에 비해서는 통계적으로 유의하게 높았으며 (p <0.01), OVA + DEP 처리군에 비해서는 같은 MCH 분무농도에 비해 낮은 경향을 나타내었고, 50.0 ㎎/㎖ 농도에서는 통계적으로 유의하게 낮았다 (p < 0.01).
- 그러나 홍삼사포닌의 투여는 장기간 OVA 감작과 함께 기도내 DEP 투여에 의해 증가하는 폐의 무게를 완화시킬수 있는 경향을 보이며, 혈액에서 기도내로 침윤하는 염증세포수도 크게 감소시키고, 또한 천식성 만성염증의 특징인 기도내 호산구의 침윤을 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서 생쥐에 홍삼사포닌의 장기간 투여는 디젤배기가스입자에 의한 기관지 천식 발증의 기본 병태인 염증세포의 침윤과 부종과 함께 기관지선의 비대를 완화시킬 수 있는 가능성이 있다는 것을 나타내는 결과라고 생각된다.
- 따라서 생쥐에게 장기간 디젤배기가스 입자를 OVA 감작화와 함께 기도내에 투여했을 때 면역계 세포에 대한 면역조절 작용이 현저하다고 알려진 IFR-γ과 같은 helper T1 세포형 cytokine 함량에는 영향을 미치지 않지만, B 세포의 IgE항체 생성을 촉진하는 작용을 갖는 IL-4와 B-cell의 분화와 항체 생산을 자극하고, IgA 생산을 증가시키는 작용을 갖고 있고, 또한 호산구를 활성화하는 작용을 갖는다고 알려진 IL-5와 IL13과 같은 helper T2 세포형 cytokine은 크게 증가시키는 것을 확인하였다.
- 1배 증가하였다. 따라서 생쥐에게 장기간 디젤배기가스입자를 OVA 감작화와 함께 기도내로 투여했을 때 혈액에서 기도내로 침윤하는 세포수가 크게 증가하며 그 중에서도, 특히 호산구수가 급증하는 것으로 보아 OVA + DEP 처리군은 항원으로 인한 기관지 천식성 만성염증이 생쥐에 유발된 것을 알 수 있었다. 그러나 홍삼사포닌의 투여는 장기간 OVA 감작과 함께 기도내 DEP 투여에 의해 증가하는 폐의 무게를 완화시킬수 있는 경향을 보이며, 혈액에서 기도내로 침윤하는 염증세포수도 크게 감소시키고, 또한 천식성 만성염증의 특징인 기도내 호산구의 침윤을 감소시키는 것을 확인하였다.
- 6배 증가하였다. 따라서 생쥐에게 장기간 디젤배기가스입자를 OVA 감작화와 함께 기도내에 투여했을 때 혈액중에서 IgE의 함량과 히스타민의 함량은 크게 증가하는데 여기에 홍삼사포닌을 장기간 투여하면 혈액에서 기관지 천식 발증에 중요한 지표로서 IgE와 히스타민이 증가하는 것을 막아주는 효과가 있다는 것을 보여주는 결과라고 생각된다.
- 또한 helper T2 세포에서 유리된다고 알려진 IL-13의 함량도 OVA + DEP 처리군은 정상군에 비해 약 14.5배 증가하였고, OVA + DEP + 홍삼사포닌 투여군도 약 7.1배 증가하였으나 대조군인 OVA + DEP군에 비해 크게 감소하였다 (p < 0.01).
- 2배 증가하였다. 또한 혈장에서 IgE 함량도 정상군에서 145.1 pg/㎖이었으나 OVA + DEP 처리군에서는 343.2 pg/㎖ 로 약 2.4배 증가하였으며, OVA + DEP + 홍삼사포닌 처리군은 231.1 pg/㎖로 약 1.6배 증가하였다. 따라서 생쥐에게 장기간 디젤배기가스입자를 OVA 감작화와 함께 기도내에 투여했을 때 혈액중에서 IgE의 함량과 히스타민의 함량은 크게 증가하는데 여기에 홍삼사포닌을 장기간 투여하면 혈액에서 기관지 천식 발증에 중요한 지표로서 IgE와 히스타민이 증가하는 것을 막아주는 효과가 있다는 것을 보여주는 결과라고 생각된다.
- , 2006). 본 실험에서 정상군에 MCH 분무 농도를 3.125, 6.25, 12.5, 25.0과 50.0 ㎎/㎖ 증가시켰을 때 Pehn 값은 각각 0.58, 1.44, 1.94, 2.35과 2.78로 MCH 분무농도에 따라 기도과밍성은 약간 증가하였다. 그러나 OVA + DEP 처리군에 정상군과 같은 농도의 MCH을 분무했을 때 Pehn 값은 0.
- 생쥐에 OVA 감작과 함께 디젤배기입자 입자를 투여하거나 홍삼사포닌을 투여하여도 폐세정액에서 IFR-γ의 함량은 정상군에 비해 유의한 변화를 보이지 않았다.
- 01). 즉, 10주동안 실험절차에 따라 생쥐에 OVA 감작화와 함께 자동차배기가스 입자를 처리한 후 MCH을 분무하면 천식성 기도과민증은 크게 증가하였으나 여기에서 홍삼사포닌은 병행 처리하면 기도자극에 대한 기관지 천식의 기본 병태인 기도과민성의 증가를 어느 정도 완화시킬 수 있다는 것을 나타내는 결과라고 판단된다.
- 즉, OVA + DEP 처리군의 Pehn 값은 MCH 분무농도 12.5㎎/㎖부터 정상군에 비해 크게 증가하였다 (p < 0.01).
- 또한 IL-5는 macrophage에 의해 항원이라고 제시를 받는 helper T2 세포에서 유리되는 당단백질로서 eosinophil differentiation factor (EDF), B-cell growth factor II (BCGF II)이며, B-cell의 분화와 항체 생산을 자극하고, IgA 생산을 증가시키는 작용을 갖고 있고, 또한 호산구를 활성화하는 작용을 갖고 있어 기관지 천식의 특징인 기관지평활근수축, 점액분비증가, 혈관투과성 항진작용에 중요한 역할을 담당하고 있다 (Nakajima and Takatsu, 2007). 폐 세정액에서 IL-5의 함량은 IL-4 함량과 같이 OVA + DEP 처리군은 정상군에 비해 16.1배 증가하였고 OVA + DEP + 홍삼사포닌 투여군은 14.3배 증가하여 대조군인 OVA + DEP군에 비해 통계적인 유의성은 보이지 않았지만 감소하는 경향을 나타내었다. 또한 helper T2 세포에서 유리된다고 알려진 IL-13의 함량도 OVA + DEP 처리군은 정상군에 비해 약 14.
- 7배 증가하였다. 폐세정액에서 백혈구중 호산구의 수도 OVA + DEP 처리군은 정상군에 비해 약 24.6배 증가하였으나, OVA + DEP + 홍삼사포닌 처리군은 약 16.1배 증가하였다. 따라서 생쥐에게 장기간 디젤배기가스입자를 OVA 감작화와 함께 기도내로 투여했을 때 혈액에서 기도내로 침윤하는 세포수가 크게 증가하며 그 중에서도, 특히 호산구수가 급증하는 것으로 보아 OVA + DEP 처리군은 항원으로 인한 기관지 천식성 만성염증이 생쥐에 유발된 것을 알 수 있었다.
- 01), OVA + DEP + 홍삼사포닌 처리군은 증가하는 경향만을 나타내었다. 폐세정액에서 총세포수는 OVA + DEP 처리군이 정상군에 비해 약 2.6배 증가하였으나, OVA + DEP + 홍삼사포닌 처리군은 약 1.7배 증가하였다. 폐세정액에서 백혈구중 호산구의 수도 OVA + DEP 처리군은 정상군에 비해 약 24.
- 혈장에서 정상군 생쥐의 히스타민의 함량은 9.1 µM이었으나 OVA + DEP 처리군에서의 히스타민 함량은 144.2 µM로 약 15.8배 증가하였으나 OVA + DEP + 홍삼사포닌 처리군에서의 히스타민 함량은 83.4 µM로 약 9.2배 증가하였다.
후속연구
- , 2009b)인지 아니면 홍삼이 위 현상이 복합적으로 작용하여 나타나는 효과 (Hofseth & Wargovich, 2007)인지 그 메카니즘에 관한 연구가 필요하리라 생각된다. 또한 홍삼조사포닌 중에서 어느 성분이 위와 같은 효과를 나타내는데 중요하게 작용하는지 더 세밀한 연구가 필요하리라 생각된다.
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