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문제 정의
- 이에 본 연구는 薏苡仁의 메탄올 추출물(CSE)이 LPS로 활성화된 Raw 264.7 cell에서 NO production 및 IL-1β, IL-6, TNF-α과 PGE2(Prostaglandin E2) 등의 사이토카인에 미치는 영향을 살펴보고 다음과 같은 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에, 본 연구에서는 薏苡仁 추출물(CSE)의 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극으로 분비되는 NO, 및 IL-1β, IL-6, TNF-α 와 PGE2 등의 염증매개물질의 억제를 통한 항염증 효과를 평가함으로써, CSE가 면역체계에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- CSE 0.01, 0.03, 0.10 mg/ml의 농도에서 LPS 로 유도된 NO 생성의 감소가 CSE의 세포독성으로 인한 것인지를 관찰하기 위하여 THE 0.01, 0.03, 0.10 mg/ml의 농도로 처리하고 24시간 후 MTT assay를 실시하여 세포생존율을 측정하였다. LPS 단독 처리군과 CSE 0.
- CSE가 LPS로 유도된 NO의 생성을 감소시킨 것이, CSE의 세포독성으로 인한 cell 수의 저하에서 기인하였는지를 관찰하기 위하여, CSE의 농도별에 따라, MTT assay를 실시하여 cell viability를 측정하였다. 실험결과 CSE의 0.
- CSE를 농도별로 처치하고, 1시간 후에 LPS를 처치한 후, 배양된 배지를 E-tube에 모아서 ELISA Kit(RnD Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용한 PGE2 측정에 사용하였다. PGE2와 link된 acetylcholinesterase가 도포되어 있는 plate에 standard와 배양 배지를 첨가하여 4 ℃에서 18시간 동안 반응시켰다.
- CSE의 NO 생성억제정도를 관찰하기 위하여 CSE를 0.01, 003, 0.1 ㎎/㎖의 농도로 Raw 264.7 cell에 처리하여 생성되는 NO의 양을 측정하였다. NO의 양은 처치를 하지 않은 control에 대한 비율로 나타내었다.
- Cytokine을 측정하기 위하여 6-well plate에 cells(1×106/ml)을 분주하고 CSE를 농도별로 처치한 다음, 1시간 후에 LPS를 처치하였다. LPS 처치후 6-12시간에 배지를 수거하여 cytokine을 측정하였다. 수거된 배지는 측정전까지 -70 ℃에서 보관하였다.
- LPS는 염증반응 매개물질인 PGE2의 생성을 유의성 있게 증가시켰으며, CSE 0.03, 0.10 mg/ml 처리군은 LPS로 유도된 PGE2를 LPS단독 처리군에 비해 각각 유의성 (P<0.01) 있게 감소시켰다(Fig. 6).
- 10 mg/ml의 농도로 세포에 처리하고 18시간 후 ELISA kit를 사용하여 PGE2 생성 정도를 측정하였다. LPS는 염증반응 매개물질인 PGE2의 생성을 유의성 있게 증가시켰으며, CSE 0.03, 0.10 mg/ml 처리군은 LPS로 유도된 PGE2를 LPS단독 처리군에 비해 각각 유의성 있게 감소시켰다 (Fig. 6).
- LPS는 전염증성 cytokine인 IL-1β의 생성을 유의성 있게 증가시켰으며, CSE 0.03, 0.1 ㎎/㎖를 처치한 실험군에서는 LPS 로 유도된 IL-1β를 LPS단독 처리군에 비해 각각 유의성 있게 감소시켰다(Fig. 4).
- LPS는 전염증성 cytokine인 IL-1β의 생성을 유의성 있게 증가시켰으며, CSE 0.03, 0.1 ㎎/㎖를 처치한 실험군에서는 LPS로 유도된 IL-1β를 LPS단독 처리군에 비해 각각 유의성(P<0.05 또는 P<0.01) 있게 감소시켰다(Fig. 4).
- LPS는 전염증성 cytokine인 IL-6의 생성을 유의성 있게 증가시켰으며, CSE 0.03, 0.1 mg/ml 처리군은 LPS로 유도된 IL-6를 LPS단독 처리군에 비해 각각 유의성 (P<0.05 또는 P<0.01) 있게 감소시켰다(Fig. 5).
- 10 mg/ml의 농도로 세포에 처리하고 18시간 후 ELISA kit를 사용하여 IL-6 생성 정도를 측정하였다. LPS는 전염증성 cytokine인 IL-6의 생성을 유의성 있게 증가시켰으며, CSE 0.03, 0.1 mg/ml 처리군은 LPS로 유도된 IL-6를 LPS단독 처리군에 비해 각각 유의성 있게 감소시켰다 (Fig. 5).
- LPS는 전염증성 cytokine인 TNF-α의 생성을 유의성 있게 증가시켰고, CSE 0.03, 0.1 ㎎/㎖를 처치한 실험군에서는 LPS로 유도된 TNF-α를 LPS단독 처리군에 비해 각각 유의성 있게 감소시켰다(Fig. 3).
- LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 CSE의 IL-1β 생성 저해능을 관찰하기 위하여 CSE를 0.01, 0.03, 0.10 mg/ml의 농도로 세포에 처리하고 18시간 후 ELISA kit를 사용하여 IL-1β 생성 정도를 측정하였다.
- LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 CSE의 IL-6 생성 저해능을 관찰하기 위하여 CSE를 0.01, 0.03, 0.10 mg/ml의 농도로 세포에 처리하고 18시간 후 ELISA kit를 사용하여 IL-6 생성 정도를 측정하였다. LPS는 전염증성 cytokine인 IL-6의 생성을 유의성 있게 증가시켰으며, CSE 0.
- LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 CSE의 PGE2 생성 저해능을 관찰하기 위하여 CSE를 0.01, 0.03, 0.10 mg/ml의 농도로 세포에 처리하고 18시간 후 ELISA kit를 사용하여 PGE2 생성 정도를 측정하였다. LPS는 염증반응 매개물질인 PGE2의 생성을 유의성 있게 증가시켰으며, CSE 0.
- LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 CSE의 TNF-α 생성 저해능을 관찰하기 위하여 CSE를 0.01, 0.03, 0.10 mg/ml의 농도로 세포에 처리하고 18시간 후 ELISA kit를 사용하여 TNF-α생성 정도를 측정하였다.
- Raw 264.7 cell에서 CSE의 NO 생성억제정도를 관찰하기 위하여 CSE를 0.1-1.0mg/ml의 농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO의 양을 측정하였다.
- 薏苡仁 추출물(CSE)이 LPS로 유도된 Raw 264.7 cell에서의 nitric oxide의 생성과, 세포생존율, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2에 미치는 영향을 조사하고 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 薏苡仁 추출물(Coicis Semen Extracts, CSE)은 薏苡仁(Coicis Semen) 300 g을 MeOH 3 L에 넣고 4일간 추출한 다음 추출물을 거어즈로 1차 여과하고 3000×g에서 3분간 원심분리하고, 상층액만을 취하여 0.2 μm filter(Nalgene, New York, NY, USA)로 여과하였다.
- 1 mg/ml의 농도로 CSE를 처치하고 37 ℃, 5 % CO2에서 배양하였다. 배양후 생존세포에 MTT(0.5 mg/ml)를 4시간 처치한 후 배지를 제거하고 생성된 formazan crystals을 DMSO에 녹여 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader(Model MCC/340, Huntsville, AL)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 control cell 에 대한 백분율로 나타내었다.
대상 데이터
- CSE의 수율은 10.62%였으며 실험에서 CSE는 EMEM(Eagle's minimum essential medium)에 녹여 사용하였다.
- LPS(Escherichia coli 026:B6; Difco, Detroit, MI, U.S.A.) 와 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoleum(MTT)은 Sigma(St . Louis ,MO ,USA)에서 구입하였고, fetal bovine serum(FBS) 과 antibiotics는 Gibco/BRL(Eggenstein, Germany)로부터 구입하였으며, Antibody는 BD Bioscience(USA), Cayman(USA), Zymed(USA)에서 구입하였고, NC paper는 Schleicher & Schuell(USA)에서 구입하였다.
- Murine macrophage cell line인 Raw 264.7 cells은 한국세포주연구재단(서울)에서 구입하였으며, Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)에 10 % fetal bovine serum(FBS), 100 U/ml penicillin 및100 μg/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 incubator에서 배양하였다.
- TNF-α, IL-1β와 IL-6의 ELISA Kit는 Pierce endogen(Rockford, IL, USA)에서 구입하였으며, PGE2의 ELISA Kit는 RnD Systems(Minneapolis, MN, USA) 에서 구입하였다.
- 7 cells은 한국세포주연구재단(서울)에서 구입하였으며, Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)에 10 % fetal bovine serum(FBS), 100 U/ml penicillin 및100 μg/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 incubator에서 배양하였다. 실험과정의 모든 cells은 80～90 %의 confluency에서 실험하였고, 20 passages를 넘기지 않은 cell만 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 mean±SD로 나타내었으며, 처치군 간의 유의성은 one way analysis of varience(ANOVA)로 검정한 후 Newman - Keuls test로 검정하였다.
이론/모형
- TNF-α, IL-1β와 IL-6는 ELISA Kit(Pierce endogen, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였으며, 실험의 방법은 manufacturer's instruction에 따랐다.
성능/효과
- 1. CSE 0.03, 0.1 mg/ml 처리군에서 NO의 생성량을 유의성 있게 억제하였으며, 모든 농도의 CSE에서 세포독성을 유발하지 않았다.
- 2. CSE 0.03, 0.1 mg/ml 처리군에서 TNF-α를 유의성 있게 억제하였다.
- 3. CSE 0.01, 0.03, 0.1 mg/ml 처리군에서 IL-1β를 유의성 있게 억제하였다.
- 4. CSE 0.03, 0.1 mg/ml 처리군에서 IL-6를 유의성 있게 억제하였다.
- 5. CSE 0.03, 0.1 mg/ml 처리군에서 PGE2를 유의성 있게 억제하였다.
- LPS군에서는 control군에 비교하여 NO의 생성량이 유의성 있게 증가하였으며, CSE 0.01㎎/㎖를 처치한 실험군에서는 LPS군에 비해 유의성이 없었으나, CSE 0.03, 0.1 ㎎/㎖를 처치한 실험군에서는 LPS군에 비해 유의성 있게 NO의 생성을 억제하였다(Fig. 1).
- LPS군에서는 control군에 비교하여 NO의 생성량이 유의성(P<0.01) 있게 증가하였으며, CSE 0.01 ㎎/㎖를 처치한 실험군에서는 LPS군에 비해 유의성이 없었으나, CSE 0.03, 0.1 ㎎/㎖를 처치한 실험군에서는 LPS군에 비해 유의성 (P<0.05 또는 P<0.01) 있게 NO의 생성을 억제하였다(Fig. 1).
- LPS는 전염증성 cytokine인 TNF-α의 생성을 유의성 있게 증가시켰고, CSE 0.03, 0.1 ㎎/㎖를 처치한 실험군에서는 LPS로 유도된 TNF-α를 LPS단독 처리군에 비해 각각 유의성(P<0.05 또는 P<0.01) 있게 감소시켰다(Fig. 3).
- CSE가 LPS로 유도된 NO의 생성을 감소시킨 것이, CSE의 세포독성으로 인한 cell 수의 저하에서 기인하였는지를 관찰하기 위하여, CSE의 농도별에 따라, MTT assay를 실시하여 cell viability를 측정하였다. 실험결과 CSE의 0.01, 0.03 및 0.10 mg/ml의 농도에서는 유의한 세포독성을 나타내지 않았다(Fig. 2).
후속연구
- 이상의 결과는 CSE가 NO, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2의 생성을 저해함으로써 유의한 항염증 효과가 있음을 보여주며, 향후 기전적 연구를 통해 CSE를 활용한 염증반응 조절제 개발과 임상에서의 활용가치를 높일 수 있을 것으로 생각된다.
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