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문제 정의
- 이에 본 연구는 의이인의 cytokine 조절 효과를 확인하여 의이인의 항알레르기 치료제로서의 가능성을 확인하고자 알레르기 비염 동물 모델을 이용, 4종류의 다른 농도의 의이인 추출물을 경구 투여 후 혈중 Immunoglobulin E(IgE), Tumor Necrosis Factoralpha(TNF-α), Interferon-gamma(IFN-γ), Interleukin1beta(IL-1β), Interleukin-13(IL-13)을 확인하여 다음과 같은 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Normal군은 Ovalbumin 대신 Normal Saline을 복강 투여 및 비강 점적하였다. Control군 및 모든 실험군에서는 복강 감작 및 비강점적으로 알레르기 비염을 유발한 후, 의이인 추출물은 각각 실험Ⅰ군은 100㎎/㎏, 실험Ⅱ군은 200㎎/㎏, 실험Ⅲ군은 500㎎/㎏, 실험Ⅳ군은 1g/㎏의 농도로 하여 1㏄/㎏의 비율로 20㎖씩 28일간 매일 1회씩 경구투여 되었다.
- HRP에 conjugate된 IgE Enzyme-Antibody Conjugate를 100㎕ 처리하고 실온에 30분 간 방치한 후 다시 4회 세척하였다. Hydrogen peroxide와 TMB 혼합 기질을 각 well에 100㎕ 처리 한 후 암소에서 10분간 방치하고, stop solution을 100㎕씩 처리한 후 sepectrophotometer 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 결과값은 표준액(0-400ng/㎖)의 흡광도 값을 4-parameter algorithm로 계산하였다.
- Horseradish peroxidase(HRP)에 conjugate된 TNF-α Conjugate 를 100㎕ 처리하고 실온에 2시간 방치한 후 다시 5회 세척하였다. Hydrogen peroxide와 chromogen (tetramethylbnzidine: TMB) 혼합 기질을 각 well에 100㎕ 처리 한 후 암소에서 30분간 방치하고, stop solution을 100㎕씩 처리한 후 sepectrophotometer (Versamax microplatereader; Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA) 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 표준액(0-700 pg/㎖)의 흡광도 값을 4-parameter algorithm로 계산하였다.
- HRP에 conjugate된 IFN-γ Conjugate를 100㎕ 처리하고 실온에 2시간 방치한 후 다시 5회 세척하였다. Hydrogen peroxide와 chromogen(TMB) 혼합 기질을 각 well에 100㎕ 처리 한 후 암소에서 30분간 방치하고, stop solution을 100㎕씩 처리한 후 sepectrophotometer 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 결과값은 표준액(9.
- HRP에 conjugate된 IFN-γ Conjugate를 100㎕ 처리하고 실온에 2시간 방치한 후 다시 5회 세척하였다. Hydrogen peroxide와 chromogen(TMB) 혼합 기질을 각 well에 100㎕ 처리 한 후 암소에서 30분간 방치하고, stop solution을 100㎕씩 처리한 후 sepectrophotometer 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 결과값은 표준액(9.
- Levine & Vaz11)의 방법을 응용하여 Ovalbumin(OVA: chicken egg albumin, grade V, Sigma, U. S. A)을 항원으로 사용하였다.
- 1% OVA용액이 되도록 하였다. Normal군을 제외한 모든 군에 실험시작 0일, 7일, 14일째에 0.1% OVA 용액을 복강 투여하여 감작시켰다12). 항원유발을 위해 마지막 복강 투여 1주일 후 7일간 격일로 3회씩 Control군과 실험Ⅰ군, 실험Ⅱ군, 실험Ⅲ군, 실험Ⅳ군 마우스의 비강에 0.
- HRP-conjugated streptavidin을 각 well 에 100㎕ 처리 후 실온에서 45분간 반응 종료 후, 4회 세척하였다. TMB 기질을 각 well에 100㎕ 처리한 후 암소에서 30분간 방치하고, stop solution을 50㎕씩 처리한 후 sepectrophotometer 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 표준액(0-2000pg/㎖)의 흡광도 값을 4-parameter algorithm로 계산하였다.
- 동물은 중앙동물실험에서 분양받은 6주령의 BALB/c 수컷 마우스를 사용하였다. 고형사료와 물은 제한 없이 공급하면서 12시간 주야의 생활리듬을 주었으며, 항온항습상태에서 2주간 적응시킨 후 사용하였다. 동물실험계획서는 경희의료원 동물실험 윤리위원회의 승인(KHMC-IACUC 12-005)을 받았다.
- 마우스 30마리를 각각 5마리씩 Normal군, Control 군, 실험Ⅰ군, 실험Ⅱ군, 실험Ⅲ군, 실험Ⅳ군으로 나누어 사용하였다. Normal군은 Ovalbumin 대신 Normal Saline을 복강 투여 및 비강 점적하였다.
- 마우스를 에테르 마취시킨 후 심장천자로 채혈하여 약 1㏄의 혈액을 얻은 후 응고시켰다. 이것을 원심분리기에 넣고(R.
- 본 연구에서 의이인이 알레르기 비염 동물의 cytokine에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 의이인 추출물을 농도별로 투여한 후, 혈중 IgE, TNF-α, IFN-γ, IL-1β 및 IL-13 농도 변화를 관찰한바 의미있는 결과를 얻지 못하였다.
- 의이인 500g 을 유리로 된 추출 병에 넣고 증류수 3,000㏄ 를 시료가 잠기도록 충분히 넣어 2시간 동안 수침한 다음 환류냉각장치를 이용하여 100℃에서 1시간 전탕하여 1차 전탕액을 얻고, 재차 증류수 2,000㏄를 넣어 1차 전탕할 때와 같은 방법으로 반복 시행하여 2차 전탕액을 얻은 후 1, 2차 전탕액을 혼합하고이 용액을 filter paper로 여과한 다음 rotary vacuum evaporator(EYELA, Japan)에서 감압 농축 후 동결건조 하여 37g의 건조분말을 획득하였다(yield 7.4 %).
- A)을 항원으로 사용하였다. 인산완충용액(PBS: phosphate buffered saline)과 수산화알루미늄겔 (Al(OH)3 gel, Sigma, U. S. A)을 1:1로 하여 OVA 10㎍을 PBS 와 수산화알루미늄겔 용액에 혼합하여 1㎖를 만들어 0.1% OVA용액이 되도록 하였다. Normal군을 제외한 모든 군에 실험시작 0일, 7일, 14일째에 0.
- 1% OVA 용액을 복강 투여하여 감작시켰다12). 항원유발을 위해 마지막 복강 투여 1주일 후 7일간 격일로 3회씩 Control군과 실험Ⅰ군, 실험Ⅱ군, 실험Ⅲ군, 실험Ⅳ군 마우스의 비강에 0.1% OVA용액을 점적하여 알레르기 비염을 유발하였다13).
대상 데이터
- Mouse tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), mouse interferon-gamma(IFN-γ) 및 mouse interleukin-1beta(IL-1β) enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) kit들은 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
- 동물은 중앙동물실험에서 분양받은 6주령의 BALB/c 수컷 마우스를 사용하였다. 고형사료와 물은 제한 없이 공급하면서 12시간 주야의 생활리듬을 주었으며, 항온항습상태에서 2주간 적응시킨 후 사용하였다.
- 실험에 사용한 한약재 의이인은 경희의료원에서 구입하였다. Mouse tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), mouse interferon-gamma(IFN-γ) 및 mouse interleukin-1beta(IL-1β) enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) kit들은 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
- 모든 측정값은 평균값±표준편차(Mean±S.D.)로 나타내었으며, data 분석은 Kruskal-Wallis test로 하였고, 사후검정은 Duncan을 이용하였다.
이론/모형
- TMB 기질을 각 well에 100㎕ 처리한 후 암소에서 30분간 방치하고, stop solution을 50㎕씩 처리한 후 sepectrophotometer 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 표준액(0-2000pg/㎖)의 흡광도 값을 4-parameter algorithm로 계산하였다.
- Hydrogen peroxide와 chromogen (tetramethylbnzidine: TMB) 혼합 기질을 각 well에 100㎕ 처리 한 후 암소에서 30분간 방치하고, stop solution을 100㎕씩 처리한 후 sepectrophotometer (Versamax microplatereader; Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA) 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 표준액(0-700 pg/㎖)의 흡광도 값을 4-parameter algorithm로 계산하였다.
- Hydrogen peroxide와 TMB 혼합 기질을 각 well에 100㎕ 처리 한 후 암소에서 10분간 방치하고, stop solution을 100㎕씩 처리한 후 sepectrophotometer 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 결과값은 표준액(0-400ng/㎖)의 흡광도 값을 4-parameter algorithm로 계산하였다.
- Hydrogen peroxide와 chromogen(TMB) 혼합 기질을 각 well에 100㎕ 처리 한 후 암소에서 30분간 방치하고, stop solution을 100㎕씩 처리한 후 sepectrophotometer 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 결과값은 표준액(0-400pg/㎖)의 흡광도 값을 4-parameter algorithm로 계산하였다.
- Hydrogen peroxide와 chromogen(TMB) 혼합 기질을 각 well에 100㎕ 처리 한 후 암소에서 30분간 방치하고, stop solution을 100㎕씩 처리한 후 sepectrophotometer 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 결과값은 표준액(9.375-600pg/㎖)의 흡광도 값을 4-parameter algorithm로 계산하였다.
성능/효과
- IgE, TNF-α 농도 변화는 그룹 간에 유의한 차이가 있었다.
- 전자의 경우 Ryu22)는 IL-1β, TNF-α가 저농도 투여군에서는 유의한 증가, 고농도 투여군에서는 유의한 감소를 보인다고 보고하였으며, 후자의 경우 Chen 등23,24)은 농도에 관계없이 IL-6, TNF-α를 억제하여 항염증효과가 있다고 하였고, IL-4, IL-6, TNF-α를 억제하여 지연형 알레르기 반응에서의 cytokine 분비를 억제했다고 하였다. 그러나 본 연구에서는 의이인 추출물이 농도 의존성과는 무관하게 알레르기와 관련된 cytokine 합성을 억제시키지 못하였고, IgE의 경우 오히려 증가하였다. 따라서 이전과 본 연구의 결과를 종합하면 의이인 추출물의 cytokine 조절능력에 대한 결과에 있어 서로 다른 차이를 보이고 있다.
후속연구
- 그러나 본 연구에서 의이인의 cytokine 조절 효과를 확인하여 의이인의 항알레르기 치료제로서의 가능성을 확인하고자 알레르기 비염 동물모델 중 BALB/c mice에 의이인 열수 추출물을 농도별로 투여하여 IgE, TNF-α, IFN-γ, IL-1β 및 IL-13 cytokine의 농도 변화를 측정하였지만, 그룹간 의미 있는 결과를 얻지 못했다.
- 그러나 본 연구에서 의이인의 cytokine 조절 효과를 확인하여 의이인의 항알레르기 치료제로서의 가능성을 확인하고자 알레르기 비염 동물모델 중 BALB/c mice에 의이인 열수 추출물을 농도별로 투여하여 IgE, TNF-α, IFN-γ, IL-1β 및 IL-13 cytokine의 농도 변화를 측정하였지만, 그룹간 의미 있는 결과를 얻지 못했다. 비록 제한된 실험방법에서 유의미한 결과를 얻지 못했지만, 추후 의이인의 품종을 달리하거나 알레르기 비염의 다른 실험모델을 이용한 후속 연구가 추가적으로 진행되어야할 것으로 생각된다.
- 따라서 이전과 본 연구의 결과를 종합하면 의이인 추출물의 cytokine 조절능력에 대한 결과에 있어 서로 다른 차이를 보이고 있다. 이러한 차이에 관하여는 실험방법과 실험에 사용된 의이인의 품종과 재배시기 및 재배산지가 다르고, 의이인의 치료지표물질이 확립되어있지 않은 것에서 비롯된 것으로 추측되며, 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각한다.
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