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문제 정의
- 加減拱辰丹은 鹿茸·山茱萸·當歸·枸杞子·山藥․陳皮·天麻·藿香·桂皮·黃芩·五味子 등 11가지 약제로 구성된 처방으로 기존의 만성 및 허약체질에 활용될 수 있는 처방으로 ovalbumin (OVA)과 같은 과민반응에 대한 실험적 증명자료는 없는 실정이다. 그러므로 본 연구는 Balb/c 마우스를 대상으로 OVA와 alum으로 감작되고 공격하여 加減拱辰丹의 효과를 조사하였다.
- 따라서 본 연구는 BALB/c계 마우스를 대상으로 OVA에 의해 유도된 혈청 내 항체와 CTACK/CCL27의 생산, 발 부종반응(footpad selling response) 및 림프절 세포의 CCR10의 발현에 미치는 加減供辰丹의 효과를 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- OVA의 감작은 스트레스가 해소된 8주령의 마우스를 대상으로 실험군당 5마씩을 배정하여 복강에 OVA와 alum을 잘 교반한 후 주사하여 면역하였고 3주 후 다시 면역하였다. 1주 후에 OVA로 발에 공격하여 발부종의 측정, 혈청내 총 IgE, OVA 특이 IgE, IgG1 및 IgG2와 CTACK/CCL27의 생산량과 CCR10의 발현을 측정하였다.
- OVA 공격 후 48시간에 각 대조군과 실험군의 마우스를 경추탈골법에 의해 즉사시킨 후 목, 사지 및 장내 림프절을 적출한 후 슬라이드 글레스를 이용하여 단일세포 부유액을 제조한 후 세포부유액을 40 μm의 나일론 매쉬에 통과 시킨 후 Ficoll-hypaque을 활용하여 밀도구배법으로 림프구를 분리하였다.
- OVA로 감작과 공격된 마우스에 Brewer’s thioglycollate broth를 마리당 2 ㎖씩 복강 내로 주사기를 이용하여 주입하고 3일 후 생쥐를 후경골탈추법으로 즉사시킨 다음 heparin (5 U/㎖)이 첨가된 HBSS 10 ㎖를 복강에 주입하고 복강을 잘 마사지 하였다.
- OVA로 감작되고 加減拱辰丹이 투여된 마우스의 체중의 변화를 알아보기 위하여 스트레스가 해소된 8주령의 BALB/c계 마우스를 대상으로 실험시작일로부터 종료일까지 3일 간격으로 약물을 투여하기 전에 체중을 계측하였다. 그 결과 Fig.
- 加減拱辰丹 투여가 발 부종에 미치는 효과를 알아보기 위해서 OVA로 감작된 28일째 각 실험군의 마우스 왼쪽 발의 두께를 측정한 후에 20 μL OVA (500 μg/mL)을 마우스 왼쪽 발에 주사하고 8시간 후에 두께를 측정하여 발 부종률을 계산하였다.
- 加減拱辰丹 투여가 세포독성에 미치는 효과를 알아보기 위해서 OVA로 감작과 공격된 마우스에 Brewer’s thioglycollate broth를 마리당 2 mL씩 복강 내로 주사기를 이용하여 주입하고 3일 후 마우스를 경추탈골법으로 즉사시킨 다음 heparin이 첨가된 HBSS 10 mL를 복강에 주입하고 복강을 잘 마사지하여 탐식세포를 페트리접시 부착방식에 의하여 분리한 후 加減拱辰丹을 24시간 처리한 다음 MTT assay 방법으로 세포 독성을 평가하였다.
- 加減拱辰丹 투여가 혈청 내 CTACK/CCL27 케모카인 생산에 미치는 효과를 알아보기 위해서 OVA로 감작된 29일째 각 실험군의 마우스를 대상으로 혈청을 분리한 다음 CTACK/CCL27 케모카인을 ELISA법으로 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 加減拱辰丹 투여가 혈청 내 항체 생산에 미치는 효과를 알아보기 위해서 OVA로 감작된 30일째 각 실험군의 마우스를 대상으로 혈청을 분리한 다음 총 IgE와 OVA 특이 IgE, IgG1 및 IgG2a의 항체를 ELISA법으로 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 加減拱辰丹의 추출은 7일간 메탄올을 주입한 후 가용화된 추출물을 진공감압기를 이용하여 농축한 후 동결건조하여 실험에 사용하였다. 약물의 투여는 매일 1회씩 경구투여하였다(50～200 mg/kg).
- 분리된 세포는 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 RPMI 1640 배지에 부유시켜 배양접시에 접종한 후 37℃와 5% CO2가 유지되는 배양기에서 2시간 동안 방치하였다. 그 후 대식세포외 다른 세포를 제거하기 위해 냉각 HBSS를 이용하여 3회 반족 세척하였다. 부착된 생쥐 복강 대식세포는 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 RPMI 1640 배지에 접종한 후 약물(50～4003mg/ml)을 처리하고 24시간 동안 배양한 다음 MTT방법으로 세포생존율을 평가하였다.
- 마우스 등쪽 털을 안가용 가위로 주의 깊게 자르고 제모크림을 바르고 25℃ 물을 이용하여 털을 제거한 후 400 mg/mL OVA를 용액을 제조하고 감작일에 Spergel 등25)의 방법을 변형하여 Fig. 1과 같은 프로그램에 의하여 100 μL OVA을 복강에 주사하였고 2주 후에 같은 방법으로 복강에 주사하여 1주일간 방치 후 20 μL OVA(500 μg/mL)을 왼쪽 발에 주사하여 공격한 후 발두께, 혈청 내 항체, 림프절, 세포독성 등을 검사하였다.
- 마우스 발 부종의 측정은 OVA로 2회 감작된 마우스를 대상으로 28일에 OVA를 왼쪽 발에 공격한 다음 8시간 후에 디지털 두께 측정기(Model 7326, Japan)로 측정하였다. 발의 부종(footpad swelling response, FRS)은 다음과 같이 계산한 후 %로 표현하였다.
- 마지막으로 우리는 加減拱辰丹 투여가 림프절의 면역 세포에서 발현되는 CTACK/CCL27 케모카인 특이 수용체인 CCR10의 발현을 flow cytomery법으로 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 그 후 대식세포외 다른 세포를 제거하기 위해 냉각 HBSS를 이용하여 3회 반족 세척하였다. 부착된 생쥐 복강 대식세포는 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 RPMI 1640 배지에 접종한 후 약물(50～4003mg/ml)을 처리하고 24시간 동안 배양한 다음 MTT방법으로 세포생존율을 평가하였다. 요약하면 1 mg/㎖의 농도로 배양하기 위해서 MTT 용액을 첨가하고 다시 4시간 동안 배양하였다.
- OVA 공격 후 48시간에 각 대조군과 실험군의 마우스를 경추탈골법에 의해 즉사시킨 후 목, 사지 및 장내 림프절을 적출한 후 슬라이드 글레스를 이용하여 단일세포 부유액을 제조한 후 세포부유액을 40 μm의 나일론 매쉬에 통과 시킨 후 Ficoll-hypaque을 활용하여 밀도구배법으로 림프구를 분리하였다. 분리된 림프구는 HBSS용액으로 3회 원심세척한 후 PE가 부착된 anti-mouse CCR10 항체를 주입하고 1시간 동안 방치 후 2% paraformaldehyde 용액을 주입하여 고정한 후 Flow cytometry (FACS, BD)를 활용하여 형광강도를 측정하여 CCR10의 발현을 측정하였다.
- 스트레스가 해소된 8주령의 BALB/c계 마우스를 5마리씩 분주하여 OVA로 감작하기 1시간 전부터 실험 종료시까지 대조군과 실험군은 각각 생리식염수와 약물(50-400 mg/kg 체중)을 하루에 1회씩 경구투여 하였다. 약물이 투여되는 기간 동안 체중의 변화를 보기 위해서 실험 시작일로부터 종료까지 약물 투여 전에 개체하였다.
- 加減拱辰丹의 추출은 7일간 메탄올을 주입한 후 가용화된 추출물을 진공감압기를 이용하여 농축한 후 동결건조하여 실험에 사용하였다. 약물의 투여는 매일 1회씩 경구투여하였다(50～200 mg/kg). OVA의 감작은 스트레스가 해소된 8주령의 마우스를 대상으로 실험군당 5마씩을 배정하여 복강에 OVA와 alum을 잘 교반한 후 주사하여 면역하였고 3주 후 다시 면역하였다.
- 요약하면 anti-mouse IgE, anti-IgG1과 antiIgG2a는 코팅완충액(0.1 M NaHCO3, pH 8.2)을 이용하여 high binding immunoplate에 well 당 100 μl을 주입하고 4℃에서 24시간 방치한 다음 0.1% Tween 20이 포함되어 있는 PBS로 3회 세척하고 3% (wt/vol) BSA-PBS를 주입하고 2시간 동안 블로킹하였다.
- 최근에 사향의 진위에 대한 논란으로 대체품이나 다른 처방에 대한 개발의 필요성이 제기되고 있다. 이에 ≪동의보감≫을 보면 공진단과 같은 조문에 黑元이라는 처방이 당귀와 녹용만으로 사향을 사용하지 않더라도 공진단과 같은 의미의 약효를 낼 수 있다는 데 착안하여 기존의 공진단에 약물을 가감하여 새로운 처방의 조합을 만들었다. 약물은 한약재 중 면역기능향상에 우수하거나 항산화효과 등이 우수한 약물로 선정하였다.
- 최근에 사향의 진위에 대한 논란으로 대체품이나 다른 처방에 대한 개발의 필요성이 제기되고 있다. 이에 ≪동의보감≫을 보면 공진단과 같은 조문에 黑元이라는 처방이 당귀와 녹용만으로 사향을 사용하지 않더라도 공진단과 같은 의미의 약효를 낼 수 있다는데 착안하여 肝腎을 補하는기존의 공진단에 약물을 가감하여 12개의 약물로 구성된 새로운 처방의 조합을 만들고 이를 이용하여 면역력의 저하로 인한 과민반응에 대한 효과를 살펴보았다.
대상 데이터
- Chicken egg albumin (ovalbumin), aluminium hydroxide, NH4Cl는 Sigma-Ardrich사(St Louis, MO)로부터 구입하였다. Total IgE, OVA-specific IgE, IgG1, IgG2a 등 ELISA kits는 Shibayagi사(Japan)로부터 구입하였고, CTACK/CCL27 ELISA kit와 Anti mouse CCR10-PE conjugated antibody는 R&D사(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다.
- 약물의 투여는 매일 1회씩 경구투여하였다(50～200 mg/kg). OVA의 감작은 스트레스가 해소된 8주령의 마우스를 대상으로 실험군당 5마씩을 배정하여 복강에 OVA와 alum을 잘 교반한 후 주사하여 면역하였고 3주 후 다시 면역하였다. 1주 후에 OVA로 발에 공격하여 발부종의 측정, 혈청내 총 IgE, OVA 특이 IgE, IgG1 및 IgG2와 CTACK/CCL27의 생산량과 CCR10의 발현을 측정하였다.
- Total IgE, OVA-specific IgE, IgG1, IgG2a 등 ELISA kits는 Shibayagi사(Japan)로부터 구입하였고, CTACK/CCL27 ELISA kit와 Anti mouse CCR10-PE conjugated antibody는 R&D사(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다.
- 가감공진단 약물의 선정은 공진단 기본처방에 사향을 빼고 면역활성이 우수한 약물을 중심으로 선정하였다. 실험에 사용한 녹용·산수유·당귀·구기자·산약·진피·천마·배초향·계피·홍삼·오미자·황금은 울산시 소재 약제상(광명당)에서 구입하여 우석대학교 한의과대학 본 초방제학교실에서 동정하였다.
- 무균환경에서 사육된 7주령의 암컷 BALB/c계 마우스는 중앙동물실험실(서울)사로부터 구입하였다. 마우스는 1주일간 스트레스를 해소하기 위해 1주일간 낮과 밤의 주기를 12시간씩 고정하여 사료(중앙동물실험실)와 멸균물을 공급하면서 사육한 후 실험동물위원회의 실험 규정에 준하여 실험에 사용하였다.
- 무균환경에서 사육된 7주령의 암컷 BALB/c계 마우스는 중앙동물실험실(서울)사로부터 구입하였다. 마우스는 1주일간 스트레스를 해소하기 위해 1주일간 낮과 밤의 주기를 12시간씩 고정하여 사료(중앙동물실험실)와 멸균물을 공급하면서 사육한 후 실험동물위원회의 실험 규정에 준하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 녹용·산수유·당귀·구기자·산약·진피·천마·배초향·계피·홍삼·오미자·황금은 울산시 소재 약제상(광명당)에서 구입하여 우석대학교 한의과대학 본 초방제학교실에서 동정하였다.
- 이에 ≪동의보감≫을 보면 공진단과 같은 조문에 黑元이라는 처방이 당귀와 녹용만으로 사향을 사용하지 않더라도 공진단과 같은 의미의 약효를 낼 수 있다는 데 착안하여 기존의 공진단에 약물을 가감하여 새로운 처방의 조합을 만들었다. 약물은 한약재 중 면역기능향상에 우수하거나 항산화효과 등이 우수한 약물로 선정하였다.
데이터처리
- 모든 실험값은 평균±표준오차로 표시했으며, 통계분석은 ANOVA와 Student’s t-test로 처리했으며, 유의성 한계는 p<0.05로 정하였다.
이론/모형
- Serum was collected at 1 day after OVA challenge. CTACK/CCL27 production was analysed using an ELISA assay. Each column represents the mean ± S.
- Serum was collected at 2 days after OVA challenge. Total IgE, OVA-specific IgE, IgG1 and IgG2a production was analysed using an ELISA assay. Each column represents the mean ± S.
- 혈청 내 IgE와 OVA 특이 IgE의 정량은 ELISA법으로 측정하였다. 요약하면 anti-mouse IgE, anti-IgG1과 antiIgG2a는 코팅완충액(0.
- 혈청 내CTACK/CCL27의 측정은 R&D사가 제시하는 방법에 준하였다.
성능/효과
- OVA 특이 IgE의 경우도 총 IgE의 결과와 매우 비슷하게 그 양이 현저히 감소하였고, OVA 특이 IgG1은 200 mg/kg 투여군에서만 감소하였다(p<0.05).
- OVA로 감작되고 加減拱辰丹이 투여된 마우스의 체중의 변화를 알아보기 위하여 스트레스가 해소된 8주령의 BALB/c계 마우스를 대상으로 실험시작일로부터 종료일까지 3일 간격으로 약물을 투여하기 전에 체중을 계측하였다. 그 결과 Fig. 2와 같이 아무런 약물과 OVA로 감작되지 않은 음성대조군은 정상적인 성장을 보인 반면, OVA로 감작된 양성대조군의 경우 21일까지는 음성대조군에 비해 체중의 증가량은 감소되었으나 두 번째 감작한 21일 이후에는 체중의 감량이 현저했다. 그러나 加減拱辰丹이 투여된 실험군의 경우 50 mg/kg 투여군을 제외하고 100 mg/kg 투여군과 200 mg/kg 투여군에서는 21일 감작 후 체중의 증가가 음성대조군과 비슷하게 증가했다(p<0.
- 加減拱辰丹 투여가 발 부종에 미치는 효과를 알아보기 위해서 OVA로 감작된 28일째 각 실험군의 마우스 왼쪽 발의 두께를 측정한 후에 20 μL OVA (500 μg/mL)을 마우스 왼쪽 발에 주사하고 8시간 후에 두께를 측정하여 발 부종률을 계산하였다. 그 결과 Fig. 4와 같이 음성대조군의 경우 부종에 효과가 없었지만, OVA로 감작되고 공격된 양성대조군에서는 발 부종이 현저히 증가한 반면, 加減拱辰丹의 투여군은 농도에 의존적으로 부종이 감소되었다. 특히 100 mg/kg 투여군(p<0.
- 加減拱辰丹 투여가 혈청 내 항체 생산에 미치는 효과를 알아보기 위해서 OVA로 감작된 30일째 각 실험군의 마우스를 대상으로 혈청을 분리한 다음 총 IgE와 OVA 특이 IgE, IgG1 및 IgG2a의 항체를 ELISA법으로 측정하였다. 그 결과 Fig. 5와 같이 IgE의 총량은 음성대조군에 비해서 양성대조군에서 현저히 증가되었지만, 加減拱辰丹을 투여한 실험군에서는 농도에 의존적으로 감소하였다.
- 加減拱辰丹 투여가 혈청 내 CTACK/CCL27 케모카인 생산에 미치는 효과를 알아보기 위해서 OVA로 감작된 29일째 각 실험군의 마우스를 대상으로 혈청을 분리한 다음 CTACK/CCL27 케모카인을 ELISA법으로 측정하였다. 그 결과 Fig. 6과 같이 음성대조군에 비해서 양성대조군에서 현저히 증가되었지만, 加減拱辰丹을 투여한 실험군에서는 농도에 의존적으로 감소하였다. 특히 100 mg/kg 투여군(p<0.
- 마지막으로 우리는 加減拱辰丹 투여가 림프절의 면역 세포에서 발현되는 CTACK/CCL27 케모카인 특이 수용체인 CCR10의 발현을 flow cytomery법으로 측정하였다. 그 결과 Fig. 7과 같이 OVA 단독 감작군인 양성대조군에서 CCR10의 발현이 현저히 증가되었지만, 加減拱辰丹을 투여한 실험군에서는 농도에 의존적으로 감소하였다. 특히 100 mg/kg 투여군(p<0.
- 그 결과 加減拱辰丹 추출물의 경구투여는 OVA가 유도하는 혈청내 총 IgE의 량을 농도 의존적으로 간소시켰을 뿐만 아니라 OVA 특이 IgE, IgG1 및 IgG2a를 효과적으로 억제하였고, 혈청내 CTACK/CCL27의 억제와 더불어 림프절의 면역세포에서 CCR10의 발현을 현저히 억제시키는 효과를 나타내었다. 또한 임상적으로 OVA가 유도하는 체중의 감소에 대한 증가효과를 보였을 뿐만 아니라 발의 부종에 대한 억제 효과가 있었다.
- 2). 따라서 OVA 유도 염증모델동물에서 加減拱辰丹의 투여는 체중의 변화와 세포독성 없이(Fig. 4) OVA가 유도하는 염증 매개물을 효과적으로 제거하는 효과를 증명하였다.
- 3과 같이 加減拱辰丹(50～200 μg/mL)을 처리한 결과 세포의 생존율에 아무런 영향을 주지 않았다. 따라서 본 실험에서 사용된 加減拱辰丹의 약물 농도에서는 세포에 독성은 없는 것으로 평가되었다.
- 6). 또한 CTACK/ CCL27과 특이적으로 결합하는 CCR10의 경우도 加減拱辰丹 투여에 의해서 그 발현이 현저히 억제되는 결과를 얻었다(Fig. 7). 이러한 결과는 OVA 항원으로 유도되는 염증성 면역반응을 加減拱辰丹 투여가 효과적으로 억제하는 것으로 조사되었다.
- 4～7). 또한 加減拱辰丹의 투여가 모델동물의 체중변화와 세포독성에 미치는 영향을 조사한 결과 본 실험에 사용한 모든 농도에서 그 영향이 없다는 것을 확인 하였다(Fig. 2). 따라서 OVA 유도 염증모델동물에서 加減拱辰丹의 투여는 체중의 변화와 세포독성 없이(Fig.
- 그 결과 加減拱辰丹 추출물의 경구투여는 OVA가 유도하는 혈청내 총 IgE의 량을 농도 의존적으로 간소시켰을 뿐만 아니라 OVA 특이 IgE, IgG1 및 IgG2a를 효과적으로 억제하였고, 혈청내 CTACK/CCL27의 억제와 더불어 림프절의 면역세포에서 CCR10의 발현을 현저히 억제시키는 효과를 나타내었다. 또한 임상적으로 OVA가 유도하는 체중의 감소에 대한 증가효과를 보였을 뿐만 아니라 발의 부종에 대한 억제 효과가 있었다.
- 본 연구에서도 마우스에 OVA와 alum을 혼합하여 복강에 감작하고 발에 공격한 결과 음성대조군에 비해 염증성 면역반응이 효과적으로 유도되었다. 즉 발의 부종, 혈청 내 OVA 특이 IgE, IgG1과 IgG2a의 생산, CTACK/CCL27의 생산 및 CTACK/CCL27 ligand인 특이적 수용체 CCR10의 발현이 뚜렷이 증가하였다(Fig.
- 그러므로 CTACK/CCL27의 과도한 생산은 병변 부위의 심각한 염증반응을 유도하며, cutaneous lymphocyte-associated antigen (CLA) 양성 림프구의 이동을 매개하는 중요한 역할을 한다15,16). 본 연구의 결과 OVA로 감작된 마우스의 혈청의 CTACK/CCL27 등은 정상대조군에 비해 현저히 높았으나, 加減拱辰丹이 투여된 실험군에서는 혈청 내 CTACK/ CCL27 케모카인의 생산량이 약물의 농도에 다라 현저히 억제되었다(Fig. 6). 또한 CTACK/ CCL27과 특이적으로 결합하는 CCR10의 경우도 加減拱辰丹 투여에 의해서 그 발현이 현저히 억제되는 결과를 얻었다(Fig.
- 01)은 그 감소효과가 유의하였다. 이러한 CCR10 발현 억제 결과는 Fig. 6에서 보여준 CTACK/CCL27 케모카인 생산량의 감소와 밀접한 관계가 있는 것을 나타내주며, 加減拱辰丹이 OVA 감작에 따른 염증반응을 효과적으로 억제시킨다는 것을 제시해 주었다.
- 이러한 결과는 加減拱辰丹 추출물이 OVA 반응에 대한 면역억제 효과가 있다는 것을 제시해주었고, 알레르기 질환 케어에 유용한 물질로 활용될 가능성이 있음을 시사해주었다.
- 그러나 IgG2a는 加減拱辰丹 투여군 모두에서 큰 영향을 미치지 못하였다. 이러한 결과는 加減拱辰丹 투여가 과민반응 유도지표로 알려진 IgE의 생산량을 감소시키는데 효과가 있다는 것을 나타내 주었다.
- 01)은 그 감소효과가 유의하였다. 이러한 결과는 염증반응에 관여하는 면역세포의 화학주성을 약화시키는데 加減拱辰丹의 효과가 있다는 것을 나타내 주었다.
- 이상의 결과를 종합해볼 때 加減拱辰丹 추출물의 투여는 OVA 항원 감작된 알레르기성 모델마우스의 발 부종 개선효과와 과민반응으로 대표되는 IgE의 혈청학적 증가에 대한 억제 효과 및 염증부위로 면역세포를 이동하여 침윤시키는 데 결정적인 역할을 하는 CTACK/ CCL27의 생산 억제효과는 물론 CTACK/ CCL27과 특이적으로 결합하는 CCR10의 발현을 현저히 줄이는 효과가 있었다. 따라서 加減拱辰丹 추출물은 인간의 AD의 개선에 이용할 수 있는 효과적인 물질이라 사료된다.
- 본 연구에서도 마우스에 OVA와 alum을 혼합하여 복강에 감작하고 발에 공격한 결과 음성대조군에 비해 염증성 면역반응이 효과적으로 유도되었다. 즉 발의 부종, 혈청 내 OVA 특이 IgE, IgG1과 IgG2a의 생산, CTACK/CCL27의 생산 및 CTACK/CCL27 ligand인 특이적 수용체 CCR10의 발현이 뚜렷이 증가하였다(Fig. 4～7). 또한 加減拱辰丹의 투여가 모델동물의 체중변화와 세포독성에 미치는 영향을 조사한 결과 본 실험에 사용한 모든 농도에서 그 영향이 없다는 것을 확인 하였다(Fig.
후속연구
- 이러한 결과는 OVA 항원으로 유도되는 염증성 면역반응을 加減拱辰丹 투여가 효과적으로 억제하는 것으로 조사되었다. 그러나 CTACK/ CCL27과 CCR10의 발현에 미치는 加減拱辰丹의 추출물의 효과는 약물의 유효성분, 및 분자 신호 전달 기전을 더 조사해야 확실한 알레르기 개선 및 치료 약물로 활용될 수 있을 것이라 사료된다.
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