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문제 정의
- 01). NO 생성에 있어 GGDE의 억제효과에 대한 기전을 알아보기 위하여 배약세포의 iNOS 발현을 조사하였다. 그 결과 NO 생성에 대한 GGDE의억제 현상과 같이 iNOS 발현이 농도에 의존적으로 억제하였다.
- PGE2, IL-1。과 TNF-a 등의 생성 및 이들 염증 매개물 생성에 관여하는 iNOS 및 COX-2의 분자 발현에 미치는 영향을 조사한 결과 유의한 억제 효과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 최근에 본 연구자들은 加減拱辰丹 추출물을 활용하여 OVA 에 의해 유도된 피부 알레르기 반응을 억제하는 효과를 보고하였으며3), 더불어 추출물 자체의 항산화 능을 바탕으로 APAP에 의해 유도된 간독성을 완화시키는 효과를 보고하였다". 따라서 본 연구는 加減拱辰丹의 항염증 효과를 밝히기 위하여 마우스 복강대식세포를 LPS 자극에 의해 생성되는 염증 매개물을 조사하였다. 그 결과 본 연구에서 사용된 加減拱辰丹 추출물인 GGDE는 세포독성이 없었고, LPS에 유발되는 세포독성을 억제하는 효과가 있었다.
- 보고하였다. 본 연구는 LPS로 자극된 마우스 복강대식세포에서 염증 매개물질의 생성과 이들 물질의 생성에 관여하는 분자의 발현에 미치는 加 減拱辰丹의 추출물인 GGDE의 영향을 조사하였다. 그 결과 GGDE는 LPS 자극에 의해 활성화된 마우스 복강대식세포에서 iNOS와 COX-2의 분자발현을 억제함으로써 NO와 PGE2와 같은 염증 매개물의 생성을 억제와 IL-1。와 TNF-a등 전염증성 사이토가인 생성을 억제하는 효과가 우수하였다.
제안 방법
- 그러므로 본 연구에서는 마우스 복강 대식세포를 대상으로 LPS로 자극한 후 Ⅱ.-W 와 TNF-a의 생성능에 미치는 GGDE의 효과를 조사하였다. 그 결과 GGDE는 효과적으로 이들전염증성 사이토카인 생성을 억제하는 우수한 효과가 있음을 밝혔다.
- GGDE가 LPS가 처리된 복강대식세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 마우스 복강대식세포(Ixle/mL)를 RPMI 1640(1% P/S, 10% FBS) 배지를 사용하여 세포 부유액을 만든 다음 여러 가지 농도의 GGDE를 주입하고 24시간 동안 배양한 후 세포 생존율을 조사하였다. 그 결과 Fig.
- GGDE가 NO 생성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 복강대식세포(IxlOi'/mL)를 접종하고 3시간 후에 GGDE을 50-400 ug/mL의 농도로 2시간 동안 전 처리한 다음 LPS (1 ug/mL) 로자극한 후 24시간 배양하고 배양액에 축척된 아질산염을 측정하였다. 그 결과 Fig.
- GGDE가 PGE2 생성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 복강대식세포(Ixir/mL)를 접종하고 3시간 후에 GGDE을 50-400 ug/mL의 농도로 2시간 동안 전 처리한 다음 LPS (1 国 /mL)로 자극한 후 24시간 배양하고 먼저 배양액에 축척된 PG0을 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 桂皮. 黃苓, 五味子 등 약물로 구성된 加減拱 辰丹(Gami-GongJin-dan, GGD) 을 조제하여 그 추출물인 GGDE을 활용하여 BALB/c계 마우스를 대상으로 ovalbumin (OVA)에 의해 유도된 혈청 내 항체와 CCL27/CTACK의 생산. 발부종반응(footpad swelling response) 및 림프절 세포의 CCR10의 발현에 미치는 효과를 조사한 결과 우수한 항염증 효과가 있음을 보고한 바 있다3).
- 건강한 8주령의 수컷 마우스 복강에 Brewer's thioglycollate broth를 마리 당 2 mL씩 복강 내로 주사기를 이용하여 주입하고 3일 후 생쥐를 후경골탈추법으로 즉사시킨 다음 heparin (5 U/mL) 이 첨가된 HBSS 10 mL을 복강에 주입하고 복강을 잘 마사지 하였다. 마사지 후 26케이지 10 mL 용주사기를 이용하여 복강으로 유입된 세포를 얻은 후 3회 HBSS로 원심세척하였다.
- 분리된 세포는 10% FBS오] 1% penicillin/streptomycin°] 첨가된 RPMI 1640 배지에 부유시켜 배양접시에 접종한 후 371와 5% CO?가 유지되는 배양기에서 2시간 동안 방치하였다. 그 후 대식세포외 다른 세포를 제거하기 위해서 냉각 HBSS을 이용하여 3회 반복 세척하였다. 부착된 마우스 복강 대식세포는 10% FBS오]■ 1% penicillin/streptomycin°] 첨가된 RPMI 1640 배지에 접종한 후 실험 목적에 따라 시간을 정하여 배양하여 사용하였다.
- 피부조직에서 LPS로 자극하였을 때 TNF-o가" 생성되어 비만세포를 비롯한 면역세포의 침윤이 촉진되고 염증반응을 촉진시키는 효과가 있어 TNF-a를 전염증성 사이토카인라 한다m 따라서 TNF-a를 효과적으로 억제할 수 있는 소재의 발굴은 인체에서 나타나는 염증성 질환을 개선 또는 치료하는데 활용될 수 있다. 그러므로 본 연구에서는 마우스 복강 대식세포를 대상으로 LPS로 자극한 후 Ⅱ.-W 와 TNF-a의 생성능에 미치는 GGDE의 효과를 조사하였다.
- 배양 24시간 후에 상층 액을 얻어 PGEz를 측정하였다. 또한 배양 18시간 후에 부착세포를 PBS로 3회 세척하고 lysis buffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.2 % SDS, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM ED TA, 0.2 % SDS) 를 주입하여 세포 용출액을 얻고 COX-2 활성과 iNOS와 COX-2 발현 분석에 사용하였다. PGEz의 측정방법은 R&D 사(Minneopolis, U.
- 마사지 하였다. 마사지 후 26케이지 10 mL 용주사기를 이용하여 복강으로 유입된 세포를 얻은 후 3회 HBSS로 원심세척하였다. 분리된 세포는 10% FBS오] 1% penicillin/streptomycin°] 첨가된 RPMI 1640 배지에 부유시켜 배양접시에 접종한 후 371와 5% CO?가 유지되는 배양기에서 2시간 동안 방치하였다.
- -1。와 TNF-a는 대표적인 전염증성 사이토카인으로 알려져 있는데, GGDE가 전염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저 여러 가지 농도(50-200 ug/mL)의 GGDE을 2시간 동안 복강대식세포에 처리하고 1 ug/mL LPS로 자극하여 18시간 동안 배양한 후 배양액에서 TNF-a 와 IL-W 측정하였다. Fig.
- 동안 배양하였다. 배양 24시간 후에 상층 액을 얻어 PGEz를 측정하였다. 또한 배양 18시간 후에 부착세포를 PBS로 3회 세척하고 lysis buffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.
- 복강대식세포(Ixle/mL)를 여러가지 농도(50 -400 μg/mL)의 GGD 추출물을 2시간동안 전 처리한 후 LPS (1 μg/mL)로 자극 한 후 18시간과 24시간 동안 배양하였다. 배양 24시간 후에 상층 액을 얻어 PGEz를 측정하였다.
- 복강대식세포의 생존율은 여러 농도의 추출물을 2시간 동안 처리한 후 LPS (1 μg/mL)을 주입하여 24시간 배양 후 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 MTT 분석법으로 측정했다. 요약하면, 세포는 IxlWmL의 밀도로 RPMI 1640 배지에 접종하여 3시간 후에 여러가지 농도로 GGD 추출물을 처리하였다.
- 있다. 본 연구에서 사용한 加減拱辰丹의 유효물질 추출은 열수추출법을 활용하여 GGDE를 제조하였고, 염증 매개물로 잘 알려진 NO와 PGE2의생성에 미치는 GGDE의 효과를 조사하였다. 그 결과 NO의 생성억제에 대한 GGDE의 기전은 iNOS 를 통하여 이루어짐을 확인할 수 있었다(Fig.
- )로 540 nm 에서 측정하였다. 아질산산염의 농도 정도는 아질산염의 표준곡선으로부터 계산하였다.
- Ⅱ.-1。와 TNF-a는 대표적인 전염증성 사이토카인으로 알려져 있는데, GGDE가 전염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저 여러 가지 농도(50-200 ug/mL)의 GGDE을 2시간 동안 복강대식세포에 처리하고 1 ug/mL LPS로 자극하여 18시간 동안 배양한 후 배양액에서 TNF-a 와 IL-W 측정하였다.
- 01). 이와 같이 GGDE가 PGE2 생성 억제에 대한 효과를 알아본 후 C0X-2의 활성 및 발현에 미치는 GGDE의 영향을 알아보기 위하여 복강대식세포(IxlM/mL)를 접종하고 3시간 후에 GGDE를 50-400 ug/mL의 농도로 2시간 동안 전 처리한 다음 LPS (1 ug /mL)로 자극한 후 18시간 배양하고 세포를 수확하여 lysis buffed 세포를 용출시키고 C 0X-2의활성과 발현을 측정하였다. 그 결과 PGE2 생성에 대한 GGDE의 억제 현상과 같이 COX-2 활성과 발현이 농도에 의존적으로 억제하였다(Fig.
- 요약하면, 鹿茸 山茱萸, 當歸, 枸杞子, 山藥, 陳皮, 天麻霍香, 桂 皮, 黃苓, 五味子 등은 울산시 소재 약제상(광명당, 대한민국에서 구입하여 우석대한의과대학 본초방제학교실에서 동정하였다. 잘 건조된 加減拱 辰丹 구성 약물 500g를 분말로 제조하여 증류수(3 L)로 3시간 동안 추출기로 열수 추출하였다. 추출물은 0.
대상 데이터
- ) 로부터 구입하였다. Brewers thioglycollate broth 배지, RPMI 1640 배지, Hanks balanced salt solution(HBSS)와 fetal bovine serum (FBS)는 Gibco BRL사(Grand Islang, NY, USA)로부터 구입하였다. 그리고 COX activity assay kit 는 Cayman Chemical사 (USA) 로부터 구입하였다.
- 그리고 COX activity assay kit 는 Cayman Chemical사 (USA) 로부터 구입하였다. Penieillin/streptomyein과 3-( 4, 5 -dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide를 비롯한 기타 사용된 모든 시약은 분석등급으로 Sigma—Aldrich와 Merck (Darmstadt, Germany) 에서 구입하였다.
- Tumor necrosis factor-alpha (TNF—a), interleukin -Ibeta (ILTB)와 prostaglandin EXPGFb) assay kite R&D Systems (Minneapolis, U.S.A.)사로부터 구입하였다. Lipopolysaccharide(LPS), anti-iNOS, anti-COX-1 및 anti-COX-2 antibody는 Santa cruz biotechnology Inc.
- 마우스는 1주일간 스트레스를 해소하기 위해 1주일간 낮과 밤의 주기를 12시간씩 고정하여 사료(중앙동물실험실)와 멸균 물을 공급하면서 사육한 후 실험동물위원회의 실험 규정에 준하여 실험에 사용하였다.
- 무균환경에서 사육된 7주령의 암컷 BALB/c계마우스는 중앙동물실험실사(서울)로부터 구입하였다. 마우스는 1주일간 스트레스를 해소하기 위해 1주일간 낮과 밤의 주기를 12시간씩 고정하여 사료(중앙동물실험실)와 멸균 물을 공급하면서 사육한 후 실험동물위원회의 실험 규정에 준하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험값은 평균土표준오차(mean + SD) 로표시했으며, 통계분석은 ANOVA와 Student's t-test 로 처리했으며, 유의성 한계는 p<0.05로 정하였다.
이론/모형
- 그 후 tris buffered saline (TBS)로 3회 세척하고 anti-iNOS antibody (1:1, 000) 또는 anti-COX-2 (1:500)를 주입하여 3 시간동안 실온에서 반응시킨 후 충분히 세척하고 horse radish peroxidase가 부착된 goat anti-rabbit IgG(l:2, 000)을 첨가하고 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. Membranee TBS로 충분히 세척하고 통상적인 enhanced chemiluminescence (ECL) 방법으로 발색시켰다.
- 2 % SDS) 를 주입하여 세포 용출액을 얻고 COX-2 활성과 iNOS와 COX-2 발현 분석에 사용하였다. PGEz의 측정방법은 R&D 사(Minneopolis, U.S.A.)가 제시한 방법에 준하여 ELISA법으로 정량하였고, COX-2의 활성은 블레드 포드 방법에 따라 단백질을 정량하고 COX-2 activity assay kit (Cayman Chemical, USA) 을 이용하여 Cyman사에서 제공하는 방법에 준하여 측정하였다.
- 실험에 사용한 加減拱辰丹 약물의 구성과 추출은 김 등M의 방법에 준하였다. 요약하면, 鹿茸 山茱萸, 當歸, 枸杞子, 山藥, 陳皮, 天麻霍香, 桂 皮, 黃苓, 五味子 등은 울산시 소재 약제상(광명당, 대한민국에서 구입하여 우석대한의과대학 본초방제학교실에서 동정하였다.
- 추출물이 처리된 세포를 용해한 다음 단백질을 블레드 포드 방법에 따라 정량하고 50 μg을 10% SDS-PAGE로 분리한 다음 transfer solution(20% methanol, 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3) 을 이용해 nitrocellulose membrane에 분리된 단백질을 전사 시켰다. 비 특이반응을 제거하기 위해서 5% 비지방 skim milk가 함유된 triton-tris buffered saline (TTBS)로 4℃에서 2시간 이상 충분히 흔들면서 방치하였다.
- TNF-a와 IL-1。의 정량은 24시간 동안 측적된 량을 측정하였다. 측정방법은 R&D 사(Minneopolis, U.S.A.)가 제시한 방법에 준하여 ELISA법으로 정량하였다.
성능/효과
- 먼저 여러 가지 농도(50-200 ug/mL)의 GGDE을 2시간 동안 복강대식세포에 처리하고 1 ug/mL LPS로 자극하여 18시간 동안 배양한 후 배양액에서 TNF-a 와 IL-W 측정하였다. Fig. 5와 같이 어떠한 약물이 처리되지 않은 대조군에 비해서 LPS로 자극하였을 경우 IL-1 附 TNF-a는 각각 4, 225.35+360.58 pg/ml과 2, 056.80±293.20 pg/mL 로 증가되었으나, GGDE 처리군은 농도에 의존적으로 전염증성 사이토카인 생성이 감소되었다. IL-1。는 200-400 ug/mL GGDE 처리군에서 그 효과가 유의하게 감소되었고(P<0.
- 후 세포 생존율을 조사하였다. 그 결과 Fig. 1과 같이 어떠한 약물이 처리되지 않은 대조군의 세포 생존율을 100%로 나타냈을 때 LPS만 자극하였을 경우 75.3±4.8%로 감소되었으나. GGDE 처리군은 농도에 의존적으로 세포생존율이 증가되었다.
- 측정하였다. 그 결과 Fig. 2A과 같이 어떠한 약물이 처리되지 않은 대조군에 비해서 LPS로 자극하였을 경우 19.5±2.1 uM로 증가되었으나, GGDE 처리군은 농도에 의존적으로 NO 생성을 감소시켰다. 특히 100-400 ug/mL GGDE 처리 군에서는 그 효과가 유의하게 증가되었다(p<0.
- 축척된 PG0을 측정하였다. 그 결과 Fig. 3과같이 어떠한 약물이 처리되지 않은 대조군에 비해서 LPS로 자극하였을 경우 1895.45+189.57 pg/mL 로 증가되었으나, GGDE 처리군은 농도에 의존적으로 PGE2 생성율이 감소되었다. 특히 100-400 ug /mL GGDE 처리군에서는 그 효과가 유의하게 증가되었다UK0.
- -W 와 TNF-a의 생성능에 미치는 GGDE의 효과를 조사하였다. 그 결과 GGDE는 효과적으로 이들전염증성 사이토카인 생성을 억제하는 우수한 효과가 있음을 밝혔다. 그러나 GGDE의 염증 매개물질의 생성과 전염증성 사이토카인의 생성 억제에 대한 분자기전은 앞으로 더 연구해야할 과제로 남아 있다.
- NO 생성에 있어 GGDE의 억제효과에 대한 기전을 알아보기 위하여 배약세포의 iNOS 발현을 조사하였다. 그 결과 NO 생성에 대한 GGDE의억제 현상과 같이 iNOS 발현이 농도에 의존적으로 억제하였다. 이러한 결과는 GGDE가 iNOS의발현을 억제함으로써 NO 생성을 조절할 수 있는 효과가 있는 것으로 사료된다(Fig.
- 본 연구에서 사용한 加減拱辰丹의 유효물질 추출은 열수추출법을 활용하여 GGDE를 제조하였고, 염증 매개물로 잘 알려진 NO와 PGE2의생성에 미치는 GGDE의 효과를 조사하였다. 그 결과 NO의 생성억제에 대한 GGDE의 기전은 iNOS 를 통하여 이루어짐을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 이와 같이 GGDE가 PGE2 생성 억제에 대한 효과를 알아본 후 C0X-2의 활성 및 발현에 미치는 GGDE의 영향을 알아보기 위하여 복강대식세포(IxlM/mL)를 접종하고 3시간 후에 GGDE를 50-400 ug/mL의 농도로 2시간 동안 전 처리한 다음 LPS (1 ug /mL)로 자극한 후 18시간 배양하고 세포를 수확하여 lysis buffed 세포를 용출시키고 C 0X-2의활성과 발현을 측정하였다. 그 결과 PGE2 생성에 대한 GGDE의 억제 현상과 같이 COX-2 활성과 발현이 농도에 의존적으로 억제하였다(Fig. 4). 이러한 결과는 GGDE가 C0X-2 활성과 발현을 억제함으로써 PGE2 생성을 조절할 수 있는 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 따라서 본 연구는 加減拱辰丹의 항염증 효과를 밝히기 위하여 마우스 복강대식세포를 LPS 자극에 의해 생성되는 염증 매개물을 조사하였다. 그 결과 본 연구에서 사용된 加減拱辰丹 추출물인 GGDE는 세포독성이 없었고, LPS에 유발되는 세포독성을 억제하는 효과가 있었다. 또한 염증 매개물인 NO와 PGE2의 생성억제는 iNOS와 COX-2 분자 발현억제를 통하여 나타남을 확인하였다.
- 또한 cyclooxygenase (COX) 는 arachidonic acid 에서 prostanoid로 전환시키는 효소로 알려졌는데, COX-1 과 COX-2에 의해 합성된 적은 양의 prostanoid는생체의 항상성 유지에 필요하지만, 활성화된 대식세포로부터 과량의 prostanoid생성은 면역 반응에 관여하여 다양한 염증성 질환의 원인이 된다5U. 따라서 본 연구는 먼저 GGDE가 PGE2의 생성에 대한 억제 효과가 있음을 확인하고 그 분자기 전을 알아보기 위해서 COX-2 활성과 발현을 조사한 결과 흥미롭게도 PGE2의 생성 억제와 같이 COX-2 활성과 발현을 억제하는 효과가 있었다(Fig. 4)
- 그 결과 본 연구에서 사용된 加減拱辰丹 추출물인 GGDE는 세포독성이 없었고, LPS에 유발되는 세포독성을 억제하는 효과가 있었다. 또한 염증 매개물인 NO와 PGE2의 생성억제는 iNOS와 COX-2 분자 발현억제를 통하여 나타남을 확인하였다. 더불어 전염증성 사이토카인인 IL-1。와 TNF-a을 효과적으로 억제하는 효능을 밝혔다.
- 본 연구는 LPS로 자극된 마우스 복강대식세포에서 염증 매개물질의 생성과 이들 물질의 생성에 관여하는 분자의 발현에 미치는 加 減拱辰丹의 추출물인 GGDE의 영향을 조사하였다. 그 결과 GGDE는 LPS 자극에 의해 활성화된 마우스 복강대식세포에서 iNOS와 COX-2의 분자발현을 억제함으로써 NO와 PGE2와 같은 염증 매개물의 생성을 억제와 IL-1。와 TNF-a등 전염증성 사이토가인 생성을 억제하는 효과가 우수하였다. 그러므로 加減拱辰丹의 항염증 효과는 인체질환에서 나타나는 각종 염증성 질환을 개선 또는 치료할 수 있는 가능성이 있어 앞으로 그 활용 가치가 높아질 것으로 사료된다.
- 4). 이러한 결과는 GGDE가 C0X-2 활성과 발현을 억제함으로써 PGE2 생성을 조절할 수 있는 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 그 결과 NO 생성에 대한 GGDE의억제 현상과 같이 iNOS 발현이 농도에 의존적으로 억제하였다. 이러한 결과는 GGDE가 iNOS의발현을 억제함으로써 NO 생성을 조절할 수 있는 효과가 있는 것으로 사료된다(Fig. 2).
- 01). 이러한 결과는 GGDE가 전염증성 사이토카인을 효과적으로 억제시킬 수 있는 약물임을 시사해 주었다(Fig. 5).
- 이상의 결과를 종합해 볼 때 GGDE는 LPS에 의해 유도되는 NO와 PGE2와 같은 염증 매개물뿐만 아니라 IL-10와 TNF-a와 같은 전염증성 사이토가인을 억제하는 효과가 우수하였다. 이러한 효과는 鹿茸, 山茱萸, 當歸, 枸杞子, 山藥, 陳皮, 天 麻 霍香, 桂皮, 黃苓 五味子 등 생약에 포함된 항가산화 성분뿐만 아니라 항염증에 관여하는 여러된지 성분이 복합적으로 작용하는 효과라 추정나다.
후속연구
- 그 결과 GGDE는 효과적으로 이들전염증성 사이토카인 생성을 억제하는 우수한 효과가 있음을 밝혔다. 그러나 GGDE의 염증 매개물질의 생성과 전염증성 사이토카인의 생성 억제에 대한 분자기전은 앞으로 더 연구해야할 과제로 남아 있다.
- 그 결과 GGDE는 LPS 자극에 의해 활성화된 마우스 복강대식세포에서 iNOS와 COX-2의 분자발현을 억제함으로써 NO와 PGE2와 같은 염증 매개물의 생성을 억제와 IL-1。와 TNF-a등 전염증성 사이토가인 생성을 억제하는 효과가 우수하였다. 그러므로 加減拱辰丹의 항염증 효과는 인체질환에서 나타나는 각종 염증성 질환을 개선 또는 치료할 수 있는 가능성이 있어 앞으로 그 활용 가치가 높아질 것으로 사료된다.
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