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제안 방법
- 얻어진 MTT실험 결과이다. MTT시약을 세포 단층에 주입한 후 24 h 동안의 추가 배양이 있었으며 이때 형성된 formazan의 양을 흡광도로 측정하였다. 결과에서 알 수 있듯이 경화된 PDMS시료의 경우, 단시간 및 장시간에 걸친 추출액에서 세포 독성이 관찰되지 않았다.
- NIH-3T3 fibroblast 단일세포층을 형성한 후 추출물을 첨가하는 방법과 세포와 함께 추출물을 넣어 배양하는 방법을 사용하였다. 단일세포층을 형성은 3 X 103/well 개의 세포를 96 well 플레이트에 넣어 37℃, 5% CO2 배양기 내에서 24 h 동안 배양하였다.
- Young’s modulus의 측정은 인장강도 측정기(MINIMAT, TA Instrument, USA)을 이용하여 시험하였다. 측정에 사용한 PDMS 시료는 두께 1 mm로 필름을 형성하였으며, 제조한 시료는 10 mm X 30 mm 크기로 자른 후 각 시료의 두께는 10 mm로 제조하였으며 calipers (Gans Schmidt & Co GmbH, Germany)를 이용하여 측정한 후 보정하여 주었다.
- 또한 가교제를 주입한 경우에 있어서도 비슷한 결과를 관찰할 수 있었다. 보다 직접적인 세포 독성은 배양과정 중의 개별 세포에 있어서 더 민감하게 나타날 것이라 예상할 수 있으며 이를 확인하기 위하여 세포배양에 앞서 PDMS prepol ymer 와 가교제를 각각 세포 혼합 배지에 일정량을 주입하였다. 이후 배양 시간에 따른 세포의 형태 변화 및 표면 부착 특성을 관찰하였다.
- 2 cm의 30 mL 유리병은 고압살균기를 이용하여 120℃에서 20 min간 살균하여 사용하였다. 살균된 유리병에 PDMS (Sylgard 184, Dow Corning, USA) 용액을 1.5 g씩 넣어 실온에서 4일 간 건조시켜 주었다. Polyethylene (PE, Sigma-Aldrich, USA)은 유리병에 1.
- 또한 상온에서 가교반응을 시킨 시료의 경우에도 60℃ 에서 가교가 형성된 시료에 비하여 Young’s modulus의 차이가 없음을 확인하였다. 시간별로 38℃ 에서 추출한 PDMS 에 대하여 ISO 10993-5, Biological evaluation of medical devices-Part 5 : Tests for in vitro cytotoxicity (의료기기의 생물 안정성 평가 제 5부: 세포 독성 시험-체외시험)에서 제시하는 기준에 맞추어 생체 외 세포 독성 시험을 실시하였다. PDMS 의 경우 장시간에 걸쳐 추출한 추출물에 대해서도 음성 대조군과 비교하여 현저한 세포의 형태변화가 나타나지 않았으며, MTT분석법으로 세포의 활성도를 측정한 결과에 있어서도 음성 대조군과 비교하여 세포 독성을 관찰할 수 없었다.
- 475 gL 넣어 125 gL/cm2가 되도록 하여 38℃ 배양기내에 일정 시간 동안 보관하여 추출액을 얻었다. 시료마다 각 추출 시간에 대하여 3개의 추출액이 얻어졌으며 추출 시간은 시간별(2〜24시간), 일별(1〜7일), 주별(1〜6주)로 구분하였고 생체독성 평가 시에만 개봉되어 즉시 사용되었다. 추출 온도는 표준 생체 체온을 감안하여 38℃로 하였다.
- 그러나 PDMS 를 이용한 생체주입형 바이오센서의 코팅에 대해서는 연구된 바가 많지 않으며, 지속적인 연구 및 응용에 앞서 체계적인 생체적합성, 특히 세포독성에 대한 국제기준에 준하는 평가 방법을 제시할 필요가 있다. 이 연구에서는 국제기준으로서 ISO 10993-5, Biological eval uation of medical devices-Part 5 : Tests for in vitro cyto toxicity (의료기기의 생물 안정성 평가- 제5부: 세포독성 시험-체외시험)를 채택하여 세포 독성 평가를 실시하였으며, 이와 함께 코팅 소재 표면에 부착하여 성장하는 세포의 형태학적 변화를 관찰하여 생체적합성 여부를 판단하였다 [6-9].
- 보다 직접적인 세포 독성은 배양과정 중의 개별 세포에 있어서 더 민감하게 나타날 것이라 예상할 수 있으며 이를 확인하기 위하여 세포배양에 앞서 PDMS prepol ymer 와 가교제를 각각 세포 혼합 배지에 일정량을 주입하였다. 이후 배양 시간에 따른 세포의 형태 변화 및 표면 부착 특성을 관찰하였다. Figure 2(B)에서 볼 수 있는 바와 같이 세포의 표면 부착은 매우 안정적이었으며, 정도의 차이가 다소 있으나 세포의 성장 및 분화 또한 정상적이었다.
- 시료는 25℃와 60℃에서 12 h 동안 경화시킨 후 준비하였다. 인장속도는 10 mm/min로 하였으며, 5개의 시료를 이용하여 평균값을 대표 값으로 하였다. 각각의 시료들은 실험에 사용되기 최소 24 h 동안 항온항습실(25℃, 60% RH)에서 전처리 과정을 거친 후 사용하였다.
- 추출된 용액은 UV-visible 흡광도계 (Power wave XS, Biotek, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 정성적 평가를 위하여 위상차 광학현미경(Nikon ECLIPSE TS100, Japan)를 이용하여 세포의 형태학적 변화를 관찰하였으며 CCD (Watec WAT- 202B, Japan)를 이용하여 디지털 이미지를 얻어 대조군과 비교하였다.
대상 데이터
- NIH-3T3 fibroblast 세포(ATCC)를 RPMI-1640에서 최소한 1회 이상 계대 배양한 후 세포독성 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 NIH-3T3 fibroblast 세포는 세포배양 용기에 1 X 104개의 세포를 10%의 fetal bovine serum (FBS)가 포함된 RPMI 배지와 함께 3일 간 배양한 후, 트립신으로 처리하여 96 well 플레이트에 3 X 103/well의 세포를 넣어 37℃, 5% CO2 배양기 내에서 24 h 동안 배양한 후 MTT 시험에 사용하였다.
- 국제기준인 ISO 10993-5 에 있어서도 세포독성 평가를 위한 세포주를 지정하고 있지 않기 때문에 기존에 발표된 연구논문들을 토대로 하여 비교적 널리 확립되어 있는 세포주 중에서 안정적이며, 신뢰할 수 있는 세포주인 NIH-3T3 fibroblast를 선정하였다.
- 실험에 사용된 NIH-3T3 fibroblast 세포는 세포배양 용기에 1 X 104개의 세포를 10%의 fetal bovine serum (FBS)가 포함된 RPMI 배지와 함께 3일 간 배양한 후, 트립신으로 처리하여 96 well 플레이트에 3 X 103/well의 세포를 넣어 37℃, 5% CO2 배양기 내에서 24 h 동안 배양한 후 MTT 시험에 사용하였다.
- 음성 대조군은 서술된 절차에 의해 시험되었을 때 시험체계에서 재현 가능하고 적절한 음성의 반응성 또는 비반응성을 가져오는 재료와 물질로서 본 실험에서는 혈청이 포함되지 않은 배지를 사용하였다. 양성 대조군은 서술된 절차에 의해 시험되었을 때 시험체계에서 재현 가능하고 적절한 양성의 반응성을 가져오는 재료와 물질로서 본 실험의 양성 대조군으로는 orga- no-tin 첨가제 50 mg/mL를 사용하였다.
- 이 실험에서는 생체적용 코팅 소재로서 PDMS 를 선정하였다. 가교제의 혼합비를 조절하여 센서에 코팅하고자 하는 PDMS의 Young’s modulus를 향상시킬 수 있었으며 가교제가 20%일 때 가장 높은 modulus 를 나타냄을 확인하였다.
- 이 연구에서는 생체적용 코팅 소재로 polydimethylsi loxane (PDMS)를 선정하였다[5]. PDMS는 다양한 의료분야에서 널리 사용되고 있는 소재이며, 고온에서뿐만 아니라 상온에서도 경화가 가능하기 때문에 열에 민감한 전자소자들의 코팅 소재로 적합하다.
- 4)로 세 번 세척한 후 UV로 30 min 간 살균하였다. 이 연구에서는 혈청이 없는 RPMI 1640 배양액을 추출매개체로 사용하였다. 살균 소독된 유리병에 혈청이 없는 RPMI 배지를 0.
- 세포와 함께 추출물을 넣어 배양하는 방법은 배양용기 내에 3 X 103/well의 세포와 PDMS 용출물 50 uL와 serum 10% 를 함유한 RPMI배지 50 uL를 넣은 후 37℃, 5% CO2 배양기 내에서 24 h 동안 배양하였다. 이후 정량적 세포 독성을 평가하기 위하여 3-MTT (4, 5-dimethylthi- azol-2-yl-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich, USA)을 PBS에 녹여서 5 mg/mL 농도의 용액을 준비하였다. Well 마다 MTT 용액 25 uL와 serum 10%를 함유한 RPMI배지 100 gL를 넣은 후 37℃, 5% CO2 배양기 내에서 4 h 동안 더 배양하여 불용성 formazan 이 세포내부에 형성되도록 하였다.
- 측정에 사용한 PDMS 시료는 두께 1 mm로 필름을 형성하였으며, 제조한 시료는 10 mm X 30 mm 크기로 자른 후 각 시료의 두께는 10 mm로 제조하였으며 calipers (Gans Schmidt & Co GmbH, Germany)를 이용하여 측정한 후 보정하여 주었다. 시료는 25℃와 60℃에서 12 h 동안 경화시킨 후 준비하였다.
- 현재 생물학적 시험의 평가에 사용 가능한 인증된 대조군은 없으나, 양성 또는 음성 대조군으로 세포 독성 시험에 널리 사용되는 재료를 선택하였다. 음성 대조군은 서술된 절차에 의해 시험되었을 때 시험체계에서 재현 가능하고 적절한 음성의 반응성 또는 비반응성을 가져오는 재료와 물질로서 본 실험에서는 혈청이 포함되지 않은 배지를 사용하였다.
데이터처리
- 시료와 대조군에 대하여 최소 6개 이상의 중복 배지를 이용하였으며 이들로부터 얻어진 결과의 평균으로 대표 값을 정하였다.
이론/모형
- 기존에 알려진 생체적합성 평가 방법 중 ISO 10993-5 에 따라 생체적합성 평가 실험을 진행하였다. 시료와 대조군에 대하여 최소 6개 이상의 중복 배지를 이용하였으며 이들로부터 얻어진 결과의 평균으로 대표 값을 정하였다.
- 정량적 평가를 위해서 MTT 시험법을 이용하여 NIH- 3T3 fibroblast 세포의 활성도를 측정하였다[10-12]. 살아있는 세포의 경우, MTT시약을 넣어 주면 미토콘드리아에 존재하는 탈수소 효소인 succinate-tetrazolium- reductase 가 활성을 띠어 formazan색소를 생성하게 된다.
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