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문제 정의
- 본 연구에서는 BH4 를 대체할 수 있는 유용물질인 세피아 프테린의 생산성 증대를 위하여 GTP 생합성 경로의 유전자 들을 동시에 발현할 수 있는 재조합 대장균을 제작하였다. 세피아프테린을 생산할 수 있는 재조합 대장균에서 gmk, ndk 및 guaA-guaB 유전자를 동시에 발현함으로써 세포 내 GTP 의 농도가 대조구에 비해 약 200% 이상 증가하였고 126.
- 본 연구에서는 GTP 생합성과 관련된 유전자인 gmk, ndk, guaA 및 guaB를 세피아프테린을 생산할 수 있는 재조합 대장균에서 동시 발현하여 세포 내 GTP 농도를 증가시켜 세피아프테린의 생산성을 증가시키고자 하였다.
제안 방법
- 5 μg의 cDNA, 100pmole의 프라이머(Table 1), 25 μl의 TOPreal qPCR 2X PreMIX(SYBR Green, Enzynomics)를 혼합한 후 멸균 증류 수를 이용하여 최종 부피를 50 μl로 조정하였다. Exicycler TM96(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여, 94 o C에서 10초, 58 o C에서 10초, 72 o C에서 20초간 진행되는 반응을 35회 반복하였다. 각 유전자의 발현은 Exicycler3 Analysis(ver.
- GTP 생합성에 관여하는 유전자의 동시발현이 세포 내 GTP 농도에 미치는 영향을 조사하였다(Fig. 4B). 세피아프 테린 생산에 필요한 gch1과 ptps 유전자만 발현된 균주의 세포 내 GTP 농도는 0.
- Real-time PCR 반응액은 0.5 μg의 cDNA, 100pmole의 프라이머(Table 1), 25 μl의 TOPreal qPCR 2X PreMIX(SYBR Green, Enzynomics)를 혼합한 후 멸균 증류 수를 이용하여 최종 부피를 50 μl로 조정하였다.
- 4 kb)를 동시에 발현할 수있는 pME721 벡터(Table 1)를 사용하였다[17]. 대장균 K-12(GenBank Accession No. CP011343.2)[3] 유래의 gmk (0.6 kb), ndk(0.4 kb), guaA(1.5 kb)와 guaB(1.5 kb) 유전 자는 Table 1에 제시된 프라이머를 사용하여 각각 증폭한 후 pACYCDuet-1(Merck Millipore, Darmstadt, Germany) 플라스미드에 클로닝하였다. 증폭된 gmk 유전자는 제한효소 NcoI과 PstI으로, ndk 유전자는 제한효소 HindIII와 NotI으로, guaA-guaB 유전자는 NdeI과 XhoI 제한효소로 각각 반응시켰다.
- 대장균에서 GTP 생합성에 관여하는 유전자인 gmk(0.6 kb), ndk(0.4 kb) 및 guaA-guaB(3.0 kb)를 ITPG로 발현이 유도 되는 pACYCDuet-1 플라스미드에 각각 삽입하여 발현벡터pME782(pACYCDuet-1-gmk), pME991(pACYCDuet-1-ndk)및 pME854(pACYCDuet-1-guaA-guaB)를 제작하였고, 이들 벡터로부터 한 종류 이상의 유전자를 동시에 발현할 수 있는 pME858(pACYCDuet-1-gmk-guaA-guaB), pME995 (pACYCDuet-1-gmk-ndk), pME998(pACYCDuet-1-ndk-guaAguaB) 및 pME987(pACYCDuet-1-gmk-ndk-guaA-guaB) 벡터를 제작하였다(Fig. 2).
- 목적 유전자의 발현을 확인하기 위하여 재조합 대장균은 준합성 배지를 사용하여 37 o C에서 세포흡광도(OD 600 )가 약 0.6 수준이 되도록 배양한 후, isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)의 최종 농도가 0.1 mM 이 되도록 첨가하여 30 o C에서 4시간 동안 배양한 후, 10,000 × g에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다[17].
- 세피아프테린 생산은 GTP를 생합성 회로의 전구물질로 사용하기 때문에 퓨린(purine)계 핵산대사 회로에서 GTP 생합성을 증가시키기 위하여 ndk, gmk 및 guaA-guaB 유전자를 순차적으로 동시 발현하여 세피아프테린의 생산량을 비교하였다. Fig.
- 세피아프테린 생합성에 필수적인 gch1과 ptps 유전자가 도입된 대장균 BL21(DE3)에 gmk, ndk, guaA-guaB 유전자를 동시에 발현할 수 있는 벡터를 형질전환하고 세피아프테 린의 생산량을 비교하였다(Fig. 4A). 세피아프테린을 생산할수 있는 BL21(DE3) 균주에 대조구 벡터(pACYCDuet-1)를추가적으로 형질전환한 균주를 0.
- 4 N의 KOH(Duksan)를 첨가하여 용출된 상등액을 사용하였다[24]. 세피아프테린과 GTP는 HPLC(LC-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan)에 Inertsil ODS-3 컬럼(Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 장착하여 분석하였다[17]. 세피아프테린 정량을 위하여 이동상으로 12%(v/v)의 메탄올을 1.
- 1 mM 이 되도록 첨가하여 30 o C에서 4시간 동안 배양한 후, 10,000 × g에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다[17]. 유전자 동시 발현에 의한 세피아프테린의 생산성 변화는 단백질 발현 유도 후 24시간 동안 배양 후 세포와 배양액을 회수하여 분석하였다.
- 재조합 대장균 BL21(DE3)에서 gch1, ptps, guaA, guaB, gmk 및 ndk 유전자의 발현은 SDS-PAGE 전기영동(Fig.3A) 및 정량 real-time PCR(Fig. 3B)을 통하여 확인하였다. Real-time PCR 분석결과, 재조합 대장균에서 gch1 유전자의 발현이 확인되었으나, GCH1(27.
- 재조합 대장균 배양액을 10,000 × g로 5분간 원심분리하여 상등액을 회수하고 여과지(0.2 μm, Sartorius Stedim Biotech, Concord, CA, USA)로 여과한 후 세피아프테린의 농도를 측정하였다.
- 2 μm, Sartorius Stedim Biotech, Concord, CA, USA)로 여과한 후 세피아프테린의 농도를 측정하였다. 재조합 대장균 세포내의 GTP 농도 측정을 위하여 회수한 대장균 세포에 0.4 N의 perchloric acid (Duksan, Ansan, Korea), 0.1 N의 NaOH(Duksan), 0.4 N의 KOH(Duksan)를 첨가하여 용출된 상등액을 사용하였다[24]. 세피아프테린과 GTP는 HPLC(LC-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan)에 Inertsil ODS-3 컬럼(Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 장착하여 분석하였다[17].
- 제한효소로 처리된 각각의 유전자는 동일한 제한 효소로 처리한 pACYCDuet-1 플라스미드에 삽입하였고, 제조된 발현벡터에 두 가지 이상의 목적 유전자를 발현시킬 수있는 벡터를 제작하였다. 제작된 플라스미드는 삽입되어 있는 유전자의 염기서열을 확인한 후 대장균 BL21(DE3) 균주로 형질전환 하였다[19].
- 증폭된 gmk 유전자는 제한효소 NcoI과 PstI으로, ndk 유전자는 제한효소 HindIII와 NotI으로, guaA-guaB 유전자는 NdeI과 XhoI 제한효소로 각각 반응시켰다. 제한효소로 처리된 각각의 유전자는 동일한 제한 효소로 처리한 pACYCDuet-1 플라스미드에 삽입하였고, 제조된 발현벡터에 두 가지 이상의 목적 유전자를 발현시킬 수있는 벡터를 제작하였다. 제작된 플라스미드는 삽입되어 있는 유전자의 염기서열을 확인한 후 대장균 BL21(DE3) 균주로 형질전환 하였다[19].
- 5 kb) 유전 자는 Table 1에 제시된 프라이머를 사용하여 각각 증폭한 후 pACYCDuet-1(Merck Millipore, Darmstadt, Germany) 플라스미드에 클로닝하였다. 증폭된 gmk 유전자는 제한효소 NcoI과 PstI으로, ndk 유전자는 제한효소 HindIII와 NotI으로, guaA-guaB 유전자는 NdeI과 XhoI 제한효소로 각각 반응시켰다. 제한효소로 처리된 각각의 유전자는 동일한 제한 효소로 처리한 pACYCDuet-1 플라스미드에 삽입하였고, 제조된 발현벡터에 두 가지 이상의 목적 유전자를 발현시킬 수있는 벡터를 제작하였다.
- 회수한 재조합 대장균으로부터 PureLink RNA Kit(Thermo Fisher)에서 제공된 방법으로 RNA를 추출한 후, cDNA TOPscript RT DryMIX(Enzynomics)를 사용하여 cDNA를제작하였다. Real-time PCR 반응액은 0.
대상 데이터
- 세피아프테린과 GTP는 HPLC(LC-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan)에 Inertsil ODS-3 컬럼(Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 장착하여 분석하였다[17]. 세피아프테린 정량을 위하여 이동상으로 12%(v/v)의 메탄올을 1.2 ml/min의 유 속으로 사용하였고 420 nm의 UV 검출기(SPD-20A, Shimadzu)를 사용하였다. GTP 농도는 0.
- 대장균에서 세피아프테린을 생산하기 위하여 Synechococcussp. 유래의 gch1 유전자(GenBank Accession No. AY120852.1, 0.7 kb)와 사람의 섬유아세포 유래 ptps 유전자(GenBank Accession No. NM_000317.2, 0.4 kb)를 동시에 발현할 수있는 pME721 벡터(Table 1)를 사용하였다[17]. 대장균 K-12(GenBank Accession No.
- 플라스미드 제작 및 단백질 발현을 위하여 대장균 TOP10(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)과 BL21(DE3)(Thermo Fisher) 균주를 각각 사용하였다. 플라스미드 제작을 위한 대장균의 배양은 항생제가 함유된 LB(Luria-Bertani, 10 g/l bacto-tryptone, 5 g/l bacto-yeast extract, and 5 g/l NaCl)배지를 사용하였으며, 단백질 발현의 확인 및 세피아프테린 생산을 위하여 글리세롤(2%, w/v)이 탄소원으로 첨가된 준합성 배지[25]를 사용하였다.
- 플라스미드 제작 및 단백질 발현을 위하여 대장균 TOP10(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)과 BL21(DE3)(Thermo Fisher) 균주를 각각 사용하였다. 플라스미드 제작을 위한 대장균의 배양은 항생제가 함유된 LB(Luria-Bertani, 10 g/l bacto-tryptone, 5 g/l bacto-yeast extract, and 5 g/l NaCl)배지를 사용하였으며, 단백질 발현의 확인 및 세피아프테린 생산을 위하여 글리세롤(2%, w/v)이 탄소원으로 첨가된 준합성 배지[25]를 사용하였다. 항생제로서 kanamycin(30 μg/ ml, Biosesang, Daejeon, Korea)과 chloramphenicol(34 μg/ ml, Biosesang)을 배지에 첨가하여 사용하였다.
- 항생제로서 kanamycin(30 μg/ ml, Biosesang, Daejeon, Korea)과 chloramphenicol(34 μg/ ml, Biosesang)을 배지에 첨가하여 사용하였다.
데이터처리
- Exicycler TM96(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여, 94 o C에서 10초, 58 o C에서 10초, 72 o C에서 20초간 진행되는 반응을 35회 반복하였다. 각 유전자의 발현은 Exicycler3 Analysis(ver. 3.53, Bioneer, Daejeon, Korea) 프로그램을 사용하여 분석하였다. 단백질 발현은 polyacrylamide gel(12%) 전기영동을 통하여 확인하였다[14].
- 모든 실험은 3회 반복하여 평균과 표준편차를 결정하였으며 실험값의 통계분석은 SPSS(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하였다.
성능/효과
- 세피아프테린 생산은 GTP를 생합성 회로의 전구물질로 사용하기 때문에 퓨린(purine)계 핵산대사 회로에서 GTP 생합성을 증가시키기 위하여 ndk, gmk 및 guaA-guaB 유전자를 순차적으로 동시 발현하여 세피아프테린의 생산량을 비교하였다. Fig. 4A에서 나타났듯이, ndk 유전자를 단독으로 발현하거나 ndk-gmk를 조합하여 발현한 경우는 세피아프테 린의 생산량이 대조구보다 유의적으로 감소하였다. 유전자 guaA-guaB의 경우는 단독으로 발현하거나 ndk와 동시에 발현하는 경우 세피아프테린의 생산량이 현격히 감소하였다.
- GTP 생합성에 관여하는 guaA-guaB, gmk 및 ndk 유전자를 동시에 발현한 실험구의 세포 내 GTP의 농도는 0.44 ± 0.01(mg/g cell)로서 대조구와 비교하여 약 2배 높은 GTP 함량을 나타 내었다.
- 3 mg/l의 세피아프테린이 생산되었는데 이 결과는 대조구 보다 세피아프테린의 생산량이 약 43% 증가된 것이다. GTP 생합성에 관여하는 개별 유전자의 단독 발현 또는 두 가지 유전자의 동시 발현은 세포 내 GTP 농도 향상 큰 영향을 미치지 못했지만 네 가지 유전자 모두를 동시에 발현하는 경우는 세포 내 GTP 농도를 유의적으로 증가시킨다는 것이 확인되었다. 결론적으로 세포 내 GTP 생합성에 관여하는 guaA-guaB, gmk 및 ndk 유전자를 동시에 발현함으로써 재조합 대장균에서 세피아프테린의 생산성 증가를 달성하였다.
- 3B)을 통하여 확인하였다. Real-time PCR 분석결과, 재조합 대장균에서 gch1 유전자의 발현이 확인되었으나, GCH1(27.5 kDa) 단백질은 대장균 에서 주로 비가용성 형태(insoluble form)로 발현되는 것으로 나타났다. 모든 재조합 대장균에서 RNA 수준에서 ptps 의 유전자의 발현이 확인되었으나, PTPS(18.
- GTP 생합성에 관여하는 개별 유전자의 단독 발현 또는 두 가지 유전자의 동시 발현은 세포 내 GTP 농도 향상 큰 영향을 미치지 못했지만 네 가지 유전자 모두를 동시에 발현하는 경우는 세포 내 GTP 농도를 유의적으로 증가시킨다는 것이 확인되었다. 결론적으로 세포 내 GTP 생합성에 관여하는 guaA-guaB, gmk 및 ndk 유전자를 동시에 발현함으로써 재조합 대장균에서 세피아프테린의 생산성 증가를 달성하였다.
- 5 kDa) 단백질은 대장균 에서 주로 비가용성 형태(insoluble form)로 발현되는 것으로 나타났다. 모든 재조합 대장균에서 RNA 수준에서 ptps 의 유전자의 발현이 확인되었으나, PTPS(18.6 kDa) 단백질의 발현은 선행연구[17] 결과와 유사하게 대장균에서의 발현 양이 매우 낮은 수준이었다. 유전자 gmk, ndk, guaA-guaB 는 대장균의 염색체에 존재하는 유전자로서 발현벡터 제작을 통하여 발현양의 증대를 도모하였다.
- 목적하는 6 종류의 유전자 모두가 발현되는 실험구 (pME721 + pME987)에서 GuaA, GuaB, NDK, PTPS 단백 질의 발현을 육안으로 확인하기 어려웠지만 real-time PCR을 통하여 RNA의 발현을 조사한 결과, ptps 유전자는 6종류의 유전자가 모두 발현된 균주에서 상대적으로 가장 높은 발현량을 나타냈다. 따라서, gmk, ndk, guaA, guaB의 추가 발현을 통하여 sepiapterin의 생산량이 증가할 수 있다는 것을 확인하였으며, 경제적인 생산을 위하여 추가적으로 GTP 생합성에 관여하는 유전자의 발현조건 최적화에 관한 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
- 1). 본 연구에서 guaAguaB의 추가적인 발현을 통해 IMP로부터 GMP가 생성되는 효소반응의 속도가 GMP가 IMP로 전환되는 효소반응 속도보다 빨라졌기 때문에 세피아프테린의 생산량이 guaAguaB-gmk-ndk의 동시 발현조건에서 대조구보다 유의적으로 향상된 것으로 추정된다. 그러나 이러한 결과의 보다 체계적인 해석을 위하여 유전자 동시발현에 의한 대사흐름 등의 변화를 보다 면밀하게 분석할 필요가 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구의 결과도 문헌에 보고된 결과와 유사하게 GTP 생합성을 향상시키기 위해서 GTP 생합성의 최종단계 효소인 NDK 단백질 유전자부터 순차적으로 생합성과 관련된 효소 유전자들을 추가 발현시킨 결과, 세포 내 GTP 농도의 증가와 이로 인한 세피아프테린의 생산의 증가가 가능했다고 사료된다. 그러나 세포 내에서 과발현되는 유전자의 수가 많아지면서 세피아프테린의 생합성에 관여하는 유전자들의 발현 수준이 각 조건마다 변화하는 경향을 보였으므로 추가적인 연구를 통해서 각 효소들의 발현수준을 일정하게 유지하기 위한 연구와 유전자 동시 발현 및 배양환경에 변화에 따른세포 내 GTP 농도변화를 조사하는 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 01(mg/g cell)로서 대조구와 비교하여 약 2배 높은 GTP 함량을 나타 내었다. 세피아프테린 생산 양상과 완벽하게 부합되지는 않았지만 ndk, gmk 및 guaA-guaB를 순차적으로 추가 발현하는 경우 세포 내 GTP 농도가 증가하는 양상을 확인할 수 있었다.
- 세피아프테린을 생산할 수 있는 재조합 대장균에서 gmk, ndk 및 guaA-guaB 유전자를 동시에 발현함으로써 세포 내 GTP 의 농도가 대조구에 비해 약 200% 이상 증가하였고 126.1 ± 9.3 mg/l의 세피아프테린이 생산되었는데 이 결과는 대조구 보다 세피아프테린의 생산량이 약 43% 증가된 것이다.
- 유전자 gmk, ndk, guaA-guaB 는 대장균의 염색체에 존재하는 유전자로서 발현벡터 제작을 통하여 발현양의 증대를 도모하였다. 유전자 gmk는 발현 벡터(pME782)에 의한 발현으로 대조구와 비교하여 4.6배가량 mRNA 발현양이 증가하였으며, SDS-PAGE 상에서도 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 흥미로운 사실은 guaA-guaB 유전자 조합의 경우 ndk 또는 gmk 유전자와 동시에 발현하는 경우 GuaA(58.
- 6배가량 mRNA 발현양이 증가하였으며, SDS-PAGE 상에서도 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 흥미로운 사실은 guaA-guaB 유전자 조합의 경우 ndk 또는 gmk 유전자와 동시에 발현하는 경우 GuaA(58.7 kDa), GuaB(52.0 kDa) 단백질의 발현수준이 유의적으로 향상되었으며, 특히 gmk 유전자와 동시에 발현하는 경우에 가용성 형태(soluble form) 로 발현되는 수준이 증가되었다. Real-time PCR 결과에서도 비슷한 경향이 나타났으며, gmk 유전자와 동시 발현한 경우 RNA 발현량이 4.
후속연구
- 본 연구의 결과도 문헌에 보고된 결과와 유사하게 GTP 생합성을 향상시키기 위해서 GTP 생합성의 최종단계 효소인 NDK 단백질 유전자부터 순차적으로 생합성과 관련된 효소 유전자들을 추가 발현시킨 결과, 세포 내 GTP 농도의 증가와 이로 인한 세피아프테린의 생산의 증가가 가능했다고 사료된다. 그러나 세포 내에서 과발현되는 유전자의 수가 많아지면서 세피아프테린의 생합성에 관여하는 유전자들의 발현 수준이 각 조건마다 변화하는 경향을 보였으므로 추가적인 연구를 통해서 각 효소들의 발현수준을 일정하게 유지하기 위한 연구와 유전자 동시 발현 및 배양환경에 변화에 따른세포 내 GTP 농도변화를 조사하는 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 guaAguaB의 추가적인 발현을 통해 IMP로부터 GMP가 생성되는 효소반응의 속도가 GMP가 IMP로 전환되는 효소반응 속도보다 빨라졌기 때문에 세피아프테린의 생산량이 guaAguaB-gmk-ndk의 동시 발현조건에서 대조구보다 유의적으로 향상된 것으로 추정된다. 그러나 이러한 결과의 보다 체계적인 해석을 위하여 유전자 동시발현에 의한 대사흐름 등의 변화를 보다 면밀하게 분석할 필요가 있을 것으로 사료된다.
- 목적하는 6 종류의 유전자 모두가 발현되는 실험구 (pME721 + pME987)에서 GuaA, GuaB, NDK, PTPS 단백 질의 발현을 육안으로 확인하기 어려웠지만 real-time PCR을 통하여 RNA의 발현을 조사한 결과, ptps 유전자는 6종류의 유전자가 모두 발현된 균주에서 상대적으로 가장 높은 발현량을 나타냈다. 따라서, gmk, ndk, guaA, guaB의 추가 발현을 통하여 sepiapterin의 생산량이 증가할 수 있다는 것을 확인하였으며, 경제적인 생산을 위하여 추가적으로 GTP 생합성에 관여하는 유전자의 발현조건 최적화에 관한 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
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